脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

組織工学や細胞治療は、臨床的に偉大な約束を保持します。この点に関して、このような間葉系幹細胞（MSC）のような多能性細胞は、損傷した器官に機能を回復するために、近い将来に、治療的に使用することができます。それにもかかわらず、MSCおよびそれらの増幅を囲む非効率を単離する高度に侵襲的な手順を含むいくつかの技術的な問題は、現在、これらの治療法の潜在的な臨床使用を妨げます。ここで、我々は、脱分化脂肪細胞（DFAT）、MSC様細胞の生成のための非常に効率的な方法をご紹介します。興味深いことに、DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化することができます。他のグループが以前に成熟した脂肪組織からDFAT細胞を生成するための様々な方法を提示しているが、我々の方法は、私たちはより効率的にDFAT細胞を産生することができます。この点において、我々は、20％FBSを補充したものDFAT培地（DCM）を実証します20％FBSを補充したDMEMよりDFAT細胞を、生成においてより効果的です。さらに、我々の細胞培養法で製造DFAT細胞は、いくつかの組織型に再分化することができます。このように、組織の脱分化の研究のために非常に興味深く、有用なモデルが提示されています。

細胞治療および組織工学、再生医療^1-5の分野におけるホットなトピックです。これらの治療法は偉大な約束を保持している間、いくつかの技術的な問題は、現在、その臨床使用を妨げます。この点において、iPS細胞の生成のように、すべての組織工学的療法は、患者の安全性を維持するために、外部遺伝子形質導入を含まない細胞を産生しなければなりません。したがって、我々が正常に人間DFAT細胞^6を生成するために^、最初のグループでした。いくつかの他の研究グループがいるので、さらに我々のモデルの有用性を強調し、哺乳動物起源^7-9のDFAT細胞を生成するために私たちの方法を採用しています。

いくつかの研究の過程で、我々は、細胞培養環境の質は、細胞培地の含有量を調整することによって修正することができることを見出しました。この知見は、DFAT細胞の産生および改善された細胞質の成功率の増加につながっています。両方の重要な要素で効率的に将来の臨床試験のための細胞を生成します。この点に関して、改善されたDFAT培地中で（DCM、組換えヒトインスリンを含有する細胞培地、血清アルブミン、L-グルタミン酸、いくつかの脂肪酸、およびコレステロール幹間葉する媒体と同様）とDFAT細胞の生成のための方法および増殖は、（DCMの内容の詳細は、リクエストに応じて入手可能です）を開発しました。使用して、この方法の高品質DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化する能力を生成しました。要するに、この検証済みの細胞培養プロトコルはDFAT細胞の質を高め、細胞治療および組織工学の臨床応用性を高めるために非常に有用であり得ます。

人間の皮下脂肪のサンプルは、形成外科、泌尿器科、小児外科と日本大学板橋病院（東京、日本）の整形外科の部門で手術を受ける患者から得ました。患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた、と医学の倫理委員会日本大学の学校は研究を承認しました。

1.組織標本

1. 研究室に手術室からの組織サンプルを持参してください。
2. 一旦室温（RT）で、50mlチューブ中で、次いで、10cmのプラスチック皿に試料を置く（ - ）洗浄1-2 PBS 5 mlの脂肪組織のG。

2.コラゲナーゼ消化

1. 組織サンプルを含む皿に（w / v）のコラゲナーゼ溶液（コラゲナーゼII型）の無菌の0.1％の10ミリリットルを追加し、 - （）PBSからサンプルを削除します。
2. それは構成さピューレに到達するまで、約15分間、外科用ハサミで組織をミンチency。
3. 続いて、シェーカー上で穏やかに撹拌しながら50mlのチューブ中で30分間（60 rpm）で37℃で0.1％（w / v）のコラゲナーゼ溶液中で細分化した組織を消化します。
4. 50ミリリットルチューブに100μmのフィルターを通して消化されたサンプルをフィルタリングします。次に、フィルターを介して、2％FBSを補充した（ 材料の表を参照）、DCMの10ミリリットルを渡します。

3.細胞の単離

1. 室温で1分間、100×gでろ過し、細胞を遠心。
2. この時点で、DCMの調製5mlを50mlチューブ中の2％FBSを補充しました。
3. 次に、千μlのピペットを用いて、浮遊脂肪細胞を策定し、培地を含む50 mlチューブに細胞を追加します。
4. その後、細胞をDCM媒体を混合するために穏やかに50ミリリットルチューブを振ります。
5. その後、室温で1分間、100×gでチューブを遠心します。
6. 18 G針と20ミリリットルの注射器を使用して、チューブの底に培地を捨てます。
7. 次に、DCM秒の10ミリリットルを追加します。採取した細胞を、2％FBSをupplemented。
8. 穏やかに50ミリリットルチューブを振とうすることにより細胞を用いて、DCMを混ぜます。
9. 室温で1分間、100×gでチューブを遠心。

4.めっきセル

1. 12.5センチメートルフラスコに20％FBSを補充DCMまたはDMEMの41ミリリットルを追加します。
2. 次に、200μlのピペットを用いて、フラスコに脂肪細胞の40μlを添加します。
3. その後、DCMまたはDMEMでフラスコを埋めるには、20％FBSを補充しました。重要なステップ：この時点で、細胞を培地全体に広がっていることを確認してください。視覚的に剥離した細胞を確認し、その後フラットそれを維持するラウンドペトリ皿の蓋の上にフラスコを保ちます。
4. 最後に、インキュベータの内側にフラスコを置き、7日間37℃、5％CO ₂インキュベーター内で邪魔されずにそのままにしておきます。
5. インキュベーションの週に続いて、フラスコを反転し、DFAT細胞を確認してください。この点fibroblで以来^、10を説明するよう次に、DFAT細胞の生成能力を評価しますAST様細胞（DFAT細胞）は、脂肪細胞とは異なる領域に配置されています。
6. DCMまたはDMEMを5mlを加える前に細胞培養培地を除去した後、フラスコに、20％FBSを補充しました。 DFAT細胞は、培地を交換した後、別の週のために成長することを可能にします。
7. 細胞カウンターを用いて、種々の細胞培養条件（DMEM対DCM）で生成DFAT細胞の数を数えます。

本研究では、DFAT細胞の生成のための方法およびツールキットは、（ 図1）に向上しました。我々の方法は、私たちは、DCMおよび20％FBS（ 図2A）を含むDMEM培地の両方を使用してDFAT細胞を生成することができます。このように、我々はDFAT細胞を生成するDCMとDMEMの効率を比較しました。この点で、DCMにかかわらず、脂肪細胞の数（ 図2AおよびB）を、DMEMに比べ3倍DFAT細胞増殖を増強しました。 10％FBS（データは示さず）を使用したプロトコルと比較した場合20％を用いてFBSは、細胞増殖を増強します。我々は、さらにDCMを用いて製造DFAT細胞が脂肪細胞への再分化および骨芽細胞（ 図3）へと分化する能力を有することが確認されました。アッセイのための方法は、我々の以前の研究⁶に記載されています。

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図1： 分離を示す概略、脱分化、および成熟脂肪細胞の培養物は、脂肪組織の小片を、0.1％コラゲナーゼで消化し ​​ました。遠心分離後、単房脂肪細胞浮遊層から単離しました。単離された細胞は、7日間、20％FBSを含む培地で満たされたフラスコ中で培養しました。 DFAT細胞に変換した後、培養の間、細胞が付着し、フラスコの上面に平坦化。次に、フラスコを反転させ、DFAT細胞は、従来の方法を用いて培養した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：DCM はDFAT細胞の生成を増強します。 （ A）DMEMまたはDCM中での培養の14日後DFAT細胞コロニー。スケールバー= 200μmの（B）DMEMまたはDCM（平均±SD、n = 3）でのいずれかでDFAT細胞増殖の定量化。 DFAT細胞を生成する際にDCMとDMEMの効率を比較しました。増強細胞増殖をDCMを用いて観察されます。私たちは、製造業者の指示に従って、セルカウンタを使用して、DFAT細胞の増殖を定量化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図 3：DCMを使用して生成DFAT細胞の多電位ヒトDFAT細胞はDFAT細胞の再分化および分化能力を評価するための適切な誘導培地中で3週間培養しました。 C言語ellsは、骨形成（ALPおよびアリザリンレッドS）、脂肪生成（オイルレッドO）能力について分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

インビトロ脱分化に天井文化として知られているプロセスを経る成熟脂肪細胞は、より原始的な表現型に復帰し、増殖能力を得てもよいです。これらの細胞は、以下のように脱分化脂肪（DFAT）細胞と呼ばれます。 DFAT細胞の多分化能を評価しました。分析および遺伝子発現のフローサイトメトリー分析DFAT細胞のASC ⁶と比較して非常に均質であったことを明らかにしました。実際には、DFAT細胞の細胞表面抗原プロファイルは、ASCを⁶に見られるものと非常に類似しています。従って、DFAT細胞は、MSCと同様に機能することができます。

正常の20％ウシ血清^7-8を添加したDMEM F12細胞培養培地を利用DFAT細胞を生成した他の基。我々は、10％FBSを補充した細胞培養培地を用いてDFAT細胞を産生することを試みているが、このプロトコルを用いて製造DFAT細胞の数は、Wよりも有意に低かったです鶏は、20％FBS（データは示していない）を補充しました。従って、FBS濃度および/またはその内容はDFAT細胞の脱分化及び/又はDFAT細胞の増殖のいずれかのために重要です。今後の研究の一環として、我々はさらに、血清コンテンツはDFAT細胞の生成および増殖を支配するメカニズムを解明しようとします。一方、DCMは、私たちの研究で使用したDMEM未満グルコース、脂肪酸および他の化学物質が含まれています。細胞培養におけるこの変動は、培地成分はDFAT細胞の発生と増殖の両方の効率を調節することができます。実際には、低グルコース濃度がわずかにDMEMを用いDFAT細胞の生成効率を向上させる（データは示さず）。 DFAT細胞の生成と成長にDCMの効果の基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、我々は特定の培地成分の濃度は、これらの細胞事象を駆動することをここに仮定する。さらなる研究は、この点を明確にするために必要とされています。さらに、我々は限られをテストしているので、DMEM製剤の次元数は、さらに実験をDFAT細胞を産生する他のDMEM変動（ 例えば 、DMEMを含有するL-グルタミンまたはピリドキシン）の効率を比較するために必要とされます。

我々はDFAT細胞を産生することができるが、DFAT細胞の生成を支配する分子メカニズムはまだ不明です。同様の質問がiPS細胞¹¹の産生を囲みます。これらの治療法のような臨床使用は、細胞の状態調節機構のさらなる調査が必要になります。したがって、我々は強くDFAT細胞が外部遺伝子形質導入の自由、細胞は幹細胞様の状態に戻す方法を解明するためのモデルを提供すると信じています。 DFAT細胞産生プロトコールは、従って、将来の臨床試験での使用のために現在に最適化されています。

コラゲナーゼ処理し、脂肪細胞の単離は、両方適正に行われることを確保することが正常にこのプロトコルを使用してDFAT細胞を生成する際に重要な要因です。 APPR培養中の微細なハサミや気泡の除去opriate使用もDFAT細胞増殖を増強するのに役立ちます。

The authors have nothing to disclose.

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.