Method Article
Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.
Os recentes avanços significativos nas técnicas de pesquisa com células-tronco e bioengenharia têm feito grandes progressos na utilização de biomateriais para regenerar e reparar danos em tecidos simples nas áreas de ortopedia e periodontais. No entanto, as tentativas para regenerar as estruturas e as funções dos órgãos (3D) mais complexas tridimensionais, tais como os pulmões não têm sido muito bem sucedida, porque os processos biológicos de regeneração de órgãos não foram bem exploradas. Torna-se claro que a angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos, desempenha papel fundamental na regeneração de órgãos. Recentemente formado vasculaturas não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares que são necessários para a regeneração de órgãos, mas também fornecem sinais instrutivos para os tecidos em regeneração locais. Portanto, para regenerar com sucesso em pulmões de um adulto, que é necessário para recapitular os microambientes específicos do pulmão em que a angiogénese unidades de regeneração dos tecidos pulmonares locais. Embora conventional ensaios in vivo da angiogénese, tais como a implantação subcutânea de matriz extracelular (ECM) rico em hidrogéis (por exemplo, colagénio ou fibrina géis ou Matrigel - mistura de proteínas de ECM segregado por células de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm rato), são amplamente utilizados para explorar a mecanismos gerais de angiogénese, a angiogénese específica do pulmão não tem sido bem caracterizada porque os métodos para o implante ortotópico de biomateriais no pulmão não foram bem estabelecidos. O objetivo deste protocolo é a introdução de um método único para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de vida do rato adulto, permitindo a recapitulação bem sucedida de acolhimento angiogênese derivado do pulmão dentro do gel. Esta abordagem permite aos investigadores para explorar os mecanismos pelos quais o microambiente-pulmão específico controla a angiogénese e regeneração alveolar em condições normais e patológicas. Desde o lançamento biomateriais implantados e fornecer sinais físicos e químicos para adjacente ltecidos ung, implantação destes biomateriais no pulmão doente pode potencialmente normalizar os tecidos doentes adjacentes, permitindo que pesquisadores a desenvolver novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares.
O objetivo geral deste protocolo é a introdução de um método para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de rato adulto, o que permite aos pesquisadores para caracterizar os mecanismos moleculares da vascular pulmonar e desenvolvimento alveolar, e para aproveitar esse conhecimento, a fim de desenvolver materiais biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológico e formação alveolar para o tratamento de várias doenças pulmonares.
Mais de 35 milhões de americanos sofrem de doenças pulmonares crônicas, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose pulmonar. Esses pacientes têm sintomas crônicos de longa duração respiratórios, como falta de ar, aperto no peito, tosse persistente e cansaço, que prejudiquem significativamente a sua vida diária 1-3. Apesar de uma grande quantidade de esforço para desenvolver terapias eficazes para essas doenças pulmonares, atualmente não há cura; portanto, a qualidade de vida para estes pacientes é pobre e econômica e os custos humanos são oigh 4-7. Atualmente, o transplante de pulmão é a única maneira de salvar os pacientes em fase terminal de doenças pulmonares crônicas. No entanto, por causa da escassez de doadores de transplante, de alto custo, complicações graves, e baixa taxa de sobrevivência 11/08, o transplante não é uma abordagem ideal. Rápido progresso recente em técnicas de engenharia de tecidos tem possibilitado aos pesquisadores modificar geneticamente pulmão implantável por repovoamento todo descelulada pulmão com vários tipos de células progenitoras ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 12,13. No entanto, esses pulmões bioengenharia são funcionais apenas em animais hospedeiros, por várias horas após a implantação 12,14,15. Utilizando biomateriais para regenerar as estruturas complexas e funções dos pulmões também tem sido bastante bem sucedida. Isso pode ser porque os processos biológicos fundamentais que regem a regeneração do pulmão adulto não têm sido bem explorado. No pulmão, a formação do sistema vascular é um dos acontecimentos mais precoces e mais importantes during desenvolvimento e regeneração 16-21. Vasculaturas recém-formados no pulmão não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares necessários para a formação de órgãos, mas também fornecem sinais reguladores instrutivos para células vizinhas 22-25. Assim, a angiogênese desempenha papel-chave na alveolarização regenerativo no pulmão adulto 24,26,27. Além disso, contribui para a angiogênese desregulamentado doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) 28, displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, e fibrose pulmonar 29. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para a engenharia pulmões ou o tratamento de doenças pulmonares crônicas, é necessário entender os mecanismos fundamentais da angiogênese específico do pulmão.
Cada órgão apresenta propriedades mecânicas e químicas únicas, que podem diferir entre as condições fisiológicas e patológicas 30-33. Estes microenviron órgão-específicamentos regular comportamentos de células endoteliais e orquestrar a formação da rede vascular de forma específica do órgão 24,34-36. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para a regeneração do pulmão, o mecanismo subjacente a angiogênese específico do pulmão precisa ser entendido. Embora os ensaios de angiogénese in vivo convencionais, tais como implantação subcutânea de hidrogel têm sido amplamente utilizados para pesquisa da angiogênese 37-39, esses métodos não recapitular angiogénese específica de órgão. Recentemente, um novo método para implante de Matrigel em um molde elástico no pulmão do rato tem sido desenvolvido e mostrado para recrutar com sucesso os vasos sanguíneos e células epiteliais do pulmão em 22 géis. Esta abordagem única permitirá que os investigadores para explorar o mecanismo de angiogênese específico do pulmão, bem como as interações entre os vasos sanguíneos e células pulmonares não-vasculares em condições fisiológicas e patológicas. Desde 1) Matrigel não é adequado para a aplicação clínica; 2) o emolde lastic usado para lançar o gel pode afetar interações entre hidrogéis e tecido pulmonar de acolhimento e 3) o molde elástico no pulmão potencialmente causa comprometimento da função pulmonar e dor durante a respiração, como uma abordagem mais clinicamente relevante, uma matriz de fibrina 3D contendo fatores angiogênicos (factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) / factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF)) foi implantado no pulmão do rato sem vazamento no molde elástico, e tem sucesso recapitulado hospedeiro angiogénese derivados de pulmão. Gel de fibrina, fibrilas de polímero gerados a partir de fibrinogénio clivada pela trombina, a armadilha é conhecida uma variedade de factores angiogénicos, tais como bFGF e VEGF para acelerar a angiogénese in vivo 40,41. Devido à sua capacidade regenerativa e natureza biodegradável 42, gel de fibrina é amplamente utilizada no campo da engenharia de tecidos.
Este artigo apresenta uma abordagem inovadora e única para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de Adul vivot mouse e demonstra que o anfitrião angiogênese derivado do pulmão é recapitulada no interior dos géis in vivo. Este método, o qual permite aos investigadores a estudar angiogénese específica do pulmão, provavelmente irá levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares e avançar significativamente os esforços para regenerar com sucesso adulto pulmão.
NOTA: O estudo in vivo em animais foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do Hospital Infantil de Boston (números de protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos os medicamentos utilizados neste protocolo são de grau farmacêutico e esses medicamentos são preparados em condições estéreis.
1. Preparação de fibrina Gel
2. Preparação do rato
3. Rato Cirurgia
4. Rato Recovery
5. A colheita do Pulmão
Para examinar se a formação vascular pulmonar derivados do hospedeiro, se condensa no interior dos biomateriais implantados no pulmão, geles de fibrina suplementado com grandes factores angiogénicos de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml cada) foram implantados na superfície das que vivem nos pulmões de ratinho quanto relataram o uso de Matrigel 22. 47 geles de fibrina que contêm estes factores de crescimento angiogénicos foram fabricados como se mostra na Figura 1a. Após toracotomia, uma pequena área da superfície do pulmão esquerdo foi raspado utilizando uma pinça e o gel de fibrina fabricado foi implantado no pulmão de rato adulto utilizando a uma pequena quantidade de cola de fibrina, o qual é aprovado pela FDA e amplamente utilizada como selante eficaz para parar vazamentos de ar e reduz o sangramento em cirurgia de pulmão 48,49 (Figura 1b). A maioria dos ratos recuperaram sem sintomas respiratórios graves (por exemplo, pneumotórax, dificuldades respiratórias). Sete dias após a implantação, os ratos foram sacrificados e os pulmões foram harvested. Gel de fibrina implantado foi incorporada no pulmão hospedeiro 7 dias após a implantação (Figura 1c). Reconstrução 3D de imagens de fluorescência confocal revelou que as células endoteliais CD31-positivo derivados do hospedeiro formadas redes vasculares no interior dos géis de 7 dias após o implante de uma forma dependente da dose de VEGF / bFGF (Figura 2a, c). Tipo II I (SP-B positivo) as células epiteliais pulmonares (AQP5 positivo) e de tipo também foram recrutados ao longo dos vasos sanguíneos recentemente formados no interior dos géis que foram suplementados com concentrações mais elevadas de VEGF e bFGF (cada 100 ng / ml) (Figura 2a) . Coloração de H & E de secções histológicas revelaram que outros tipos de células hospedeiras também migraram para o gel de 7 dias após a implantação (Figura 2b). Estes resultados sugerem que as redes vasculares regenerativos derivado de pulmão hospedeiras são construídos com sucesso dentro dos geles de fibrina que são suplementados com factores angiogénicos e implantados na superfície de mou adultose pulmão.
Figura 1:. (A) O gel de fibrina preparado antes da implantação (b) fibrina gel implantado sobre a pleura visceral raspadas do pulmão esquerdo (setas) (c) Implantado gel de fibrina (pontas de seta) incorporada no pulmão hospedeiro 7 dias após a implantação.. Barras de escala de 1 mm.
Figura 2: (a) micrografias de fluorescência mostrando a formação de redes vasculares (CD31 positivo; verde) e recrutados tipo I (AQP5-positivo; magenta) ou tipo II (SP-B positivo; magenta) células epiteliais do pulmão no interior do gel de fibrina suplementado com várias concentrações de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml de cada) 7 dias após a implantação. As linhas tracejadas indicam a interface entre o gel de fibrina e do pulmão implantado hospedeiro. Barra de escala:. 20 um (b) Micrografia luz de coloração de H & E mostra a infiltração de células hospedeiras em gel de fibrina a 7 dias após a implantação. As setas indicam a interface entre o gel e pulmonar do hospedeiro. Barra de escala: 20 mm (c) Gráfico mostrando áreas projectadas dos vasos sanguíneos recentemente formados nos geles de fibrina que são suplementados com várias concentrações de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml de cada) 7 dias após a implantação..
Este artigo apresenta um novo método para implantar biomateriais na superfície do pulmão de vida do rato adulto. Com este sistema, a angiogénese derivados de pulmão hospedeiro com sucesso, se condensa no interior do material. Este sistema permite que os investigadores para explorar a interferência entre as células endoteliais, outras células (por exemplo, células epiteliais, células mesenquimais, células imunes), e vários componentes da matriz extracelular que são necessárias para a angiogénese local, 50-53 e regeneração alveolar 24,54. Embora o implante in vivo de hidrogel subcutânea convencional tem sido usado extensivamente para a pesquisa da angiogênese 37-39, esses métodos não recapitular angiogénese específica de órgão. Este sistema, no qual hidrogel é implantado diretamente na superfície do pulmão, vai permitir aos investigadores para explorar o papel do microambiente específico do pulmão em angiogênese e regeneração alveolar no pulmão do rato adulto. Estes géis podem ser fabricados a partir de vários BIOMATE rico em ECMriais (por exemplo, colágenos, fibrinas) que podem ser complementados com vários fatores químicos (por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de crescimento) 55,56, as células progenitoras e / ou células iPS. Além de fatores químicos, forças mecânicas também controlar a angiogênese 23,37. A rigidez das mudanças de gel de fibrina em um dependente da concentração de fibrinogênio forma 57 e manipular a concentração de fibrinogênio pode afetar a angiogênese, não só através de sinais químicos, mas também através de pistas físicas 58,59. Portanto, as propriedades físico-químicas dos geles de fibrina pode ser necessário optimizar com cuidado para recapitular a angiogénese específica do órgão fisiológico no futuro. A cicatrização de feridas após raspagem da pleura visceral e também produz um coágulo de fibrina endógena, que inclui vários tipos de células hospedeiras e promove o processo de cicatrização e regeneração do tecido. Este coágulo natural pode interagir com o gel de fibrina exogenamente implantado, e, portanto, controlar angiogênese no gel implantado. Fluorescente fibrinogênio marcado pode permitir aos pesquisadores distinguir entre coágulo de fibrina natural e gel de fibrina implantado e explorar esses mecanismos. Embora este seja um método poderoso para caracterizar a angiogénese em pulmões de ratinho adulto, aplicação para o estudo do desenvolvimento do pulmão e doenças em ratinhos neonatais provavelmente apresentam desafios técnicos.
O objetivo final deste estudo é recrutar vasos sanguíneos funcionais em gel de fibrina implantados em pulmões doentes e de usar a matriz como um dispositivo médico para restaurar as estruturas pulmonares funcionais. Possíveis comunicações entre as células hospedeiras e o vascular e estruturas alveolares no interior dos géis, bem como a funcionalidade destas estruturas deve ser explorado em experiências futuras. Desde os níveis de VEGF nos pulmões estão diminuídos em pacientes com DBP 60 e enfisema 61, acrescentando VEGF para a matriz pode melhorar o recrutamento de vasos sanguíneos nos impl matrizanted nesses pulmões doentes. As propriedades mecânicas também diferem entre os pulmões saudáveis e doentes 23,62. Por exemplo, a expressão de metaloproteinases de matriz e lisil-oxidase, que controlam a degradação e reticulação do colagénio, respectivamente, são alteradas em várias doenças pulmonares, incluindo a DPOC e fibrose pulmonar 63-67. Em pulmões doentes, certas linhagens de células progenitoras endoteliais para pulmão e células epiteliais estão esgotados 68. Assim, a manipulação destes factores (factores angiogénicos, ECMs, rigidez ECM) ou implantando geles de fibrina suplementadas com células progenitoras 69 irá provavelmente conduzir à formação de vasos sanguíneos funcionais dentro da matriz e a recuperação da função pulmonar em várias condições patológicas. Desde factores químicos pode ser completada dentro dos geles de fibrina para modular a angiogénese local, o sistema também pode ser utilizado explorar sinais ambientais específicos que podem normalizar pulmões doentes em doenças pulmonares crónicas.
Em resumo, este artigo introduz um método para implante de hidrogel de fibrina sobre a superfície do pulmão de rato vivo, o que permite aos investigadores para caracterizar a angiogénese específica do pulmão in vivo. Modificação de vários factores (por exemplo, campo de tempo, as concentrações e combinações de factores angiogénicos, vários tipos de hidrogéis, propriedades físico-químicas dos hidrogéis) neste sistema, irá revelar os mecanismos de regeneração e a angiogénese no pulmão. Assim, este sistema vai avançar significativamente os conhecimentos científicos da biologia vascular básica, engenharia de tecidos, assim como a medicina pulmonar.
The authors declare that they have no competing financial interests.
Este trabalho foi financiado por fundos da American Heart Association (AM), Departamento de Defesa dos EUA (BC074986), e do Boston Children Hospital Faculdade Career Development Fellowship (TM, AM). Os autores agradecem a Amanda Jiang e Elisabeth Jiang para assistência técnica.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
21 G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
Antibody against SP-B | Abcam | AB40876 | Immunohistochemistry |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados