Method Article
Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.
Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel - mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.
El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares.
Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de larga duración crónicas respiratorias como dificultad para respirar, opresión en el pecho, tos persistente y cansancio, que deterioran significativamente su vida diaria 1-3. A pesar de una gran cantidad de esfuerzo para desarrollar terapias eficaces para estas enfermedades de los pulmones, en la actualidad no existe una cura; Por lo tanto, la calidad de vida de estos pacientes es pobre y económica y los costos humanos son high 4-7. En la actualidad, el trasplante de pulmón es la única manera de salvar a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas en fase terminal. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de trasplante, de alto costo, complicaciones graves, y la baja tasa de supervivencia 8-11, el trasplante no es un enfoque óptimo. Rápidos progresos recientes en las técnicas de ingeniería de tejidos ha permitido a los investigadores bioingeniería pulmón implantable por repoblar descelularizado pulmonar completo con varios tipos de células progenitoras o células madre pluripotentes inducidas (iPS) células 12,13. Sin embargo, estos pulmones bioingeniería son funcionales en animales huéspedes sólo durante varias horas después 12,14,15 implantación. Utilizando biomateriales para regenerar las complejas estructuras y funciones de los pulmones ha sido también bastante éxito. Esto puede deberse a que los procesos biológicos fundamentales que rigen la regeneración pulmonar de adultos no han sido bien explorado. En el pulmón, la formación del sistema vascular es uno de los acontecimientos más tempranos y más importantes duriel desarrollo y la regeneración 16-21 ng. Vasculaturas recién formado en el pulmón no sólo entregar oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares necesarios para la formación de órganos, sino que también proporcionan señales reguladoras instructivos a las células circundantes 22-25. Por lo tanto, la angiogénesis juega un papel clave en alveolarization regenerativa en pulmones adultos 24,26,27. Además, la angiogénesis desregulada contribuye a enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) 28, la displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, y fibrosis pulmonar 29. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la ingeniería de los pulmones o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas, es necesario comprender los mecanismos fundamentales de la angiogénesis pulmonar específica.
Cada órgano muestra las propiedades mecánicas y químicas únicas, que pueden diferir entre las condiciones fisiológicas y patológicas 30-33. Estos microenviron órgano-específicamentos regulan los comportamientos de las células endoteliales y orquestan formación de la red vascular de una manera específica de órgano 24,34-36. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la regeneración de pulmón, el mecanismo subyacente a la angiogénesis pulmonar específica necesita ser entendido. Mientras ensayos de angiogénesis in vivo convencionales tales como la implantación subcutánea de hidrogel se han utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Recientemente, un nuevo método para implantar Matrigel en un molde elástico en el pulmón de ratón ha sido desarrollado y demostrado con éxito para reclutar vasos sanguíneos y células epiteliales del pulmón en los geles 22. Este enfoque único permitirá a los investigadores explorar el mecanismo de la angiogénesis-pulmón específico, así como las interacciones entre los vasos sanguíneos y las células pulmonares no vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas. Desde 1) Matrigel no es adecuado para la aplicación clínica; 2) el correomolde lastic utilizado para lanzar el gel puede afectar a las interacciones entre los hidrogeles y tejido pulmonar anfitrión y 3) el molde elástico en el pulmón potencialmente causa un deterioro de la función pulmonar y el dolor durante la respiración, como un enfoque más clínicamente relevante, una matriz de fibrina 3D que contiene factores angiogénicos (factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) ha sido implantado en el pulmón de ratón sin poner en el molde elástico, y se ha recapitulado éxito anfitrión angiogénesis pulmonar derivados. Gel de fibrina, fibrillas de polímeros generados a partir de fibrinógeno escindido por trombina, es conocido para atrapar una variedad de factores angiogénicos como bFGF y VEGF para acelerar la angiogénesis in vivo 40,41. Debido a su capacidad regenerativa y la naturaleza biodegradable 42, gel de fibrina se utiliza ampliamente en el campo de la ingeniería de tejidos.
Este artículo presenta un enfoque novedoso y único para implante de gel de fibrina en la superficie pulmonar de adult vivirt ratón y demuestra que anfitrión angiogénesis pulmonar derivado se recapitula el interior de los geles en vivo. Este método, que permite a los investigadores estudiar la angiogénesis pulmonar específica, es probable que conduzca al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares y avanzar significativamente los esfuerzos para regenerar con éxito pulmón adulto.
NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles.
1. Preparación del gel de fibrina
2. Preparación del ratón
3. Ratón Cirugía
4. Recuperación Ratón
5. La recolección del pulmón
Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a. Después de la toracotomía, una pequeña área de la superficie del pulmón izquierdo se raspó usando fórceps y el gel de fibrina fabricado se implantó en el pulmón del ratón adulto usando una pequeña cantidad de pegamento de fibrina, que es aprobado por la FDA y ampliamente utilizado como un sellante eficaz para detener fugas de aire y reducir el sangrado en cirugía pulmonar 48,49 (Figura 1b). La mayoría de los ratones se recuperaron sin síntomas respiratorios graves (por ejemplo, neumotórax, dificultad respiratoria). Siete días después de la implantación, los ratones fueron sacrificados y los pulmones eran harvested. Gel de fibrina implantado se incorporó en el pulmón de acogida 7 días después de la implantación (Figura 1c). Reconstrucción 3D de imágenes de fluorescencia confocal ha demostrado que las células endoteliales CD31-positivas derivadas del huésped formadas redes vasculares dentro de los geles de 7 días después de la implantación de una manera dependiente de la dosis de VEGF / bFGF (figura 2a, c). Tipo I (AQP5 positivo) y tipo II (SP-B positivo) células epiteliales del pulmón también fueron reclutados largo de los vasos sanguíneos recién formados dentro de los geles que fueron suplementados con mayores concentraciones de VEGF y bFGF (cada uno de 100 ng / ml) (Figura 2a) . Tinción H & E de secciones histológicas reveló que otros tipos de células huésped también migran en el gel de 7 días después de la implantación (Figura 2b). Estos hallazgos sugieren que anfitrionas redes vasculares pulmonares regenerativas derivadas de éxito se construyen dentro de los geles de fibrina que se complementan con factores angiogénicos y se implanta en la superficie de mou adultoSE pulmón.
Figura 1:. (A) de gel de fibrina preparado antes de la implantación (b) gel de fibrina implantado sobre la pleura visceral raspado del pulmón izquierdo (puntas de flecha) (c) Implantado gel de fibrina (puntas de flecha) incorporado en el pulmón de acogida 7 días después de la implantación.. Las barras de escala 1 mm.
Figura 2: (a) micrografías de fluorescencia que muestra la formación de las redes vasculares (CD31 positivo; verde) y tipo reclutado I (AQP5-positiva; magenta) o tipo II (SP-B positivo; magenta) células epiteliales del pulmón dentro del gel de fibrina complementados con diversas concentraciones de VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) 7 días después de la implantación. Las líneas discontinuas indican la interfaz entre el gel de fibrina implantado y de pulmón host. Barra de escala:. 20 micras (b) Microfotografía de luz de la tinción de H & E mostrando infiltración de células huésped en el gel de fibrina 7 días después de la implantación. Las flechas indican la interfaz entre el gel y el pulmón host. Barra de escala: 20 m (c) Gráfico que muestra las áreas proyectadas de los vasos sanguíneos de nueva formación en los geles de fibrina que se complementan con diversas concentraciones de VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) 7 días después de la implantación..
Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de 50-53 y regeneración alveolar 24,54. Aunque la implantación subcutánea de hidrogel convencional in vivo se ha utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Este sistema, en el que hidrogel se implanta directamente en la superficie del pulmón, permitirá a los investigadores a explorar los roles del microambiente pulmonar específica en la angiogénesis y la regeneración alveolar en pulmón de ratón adulto. Estos geles pueden ser fabricados de diversos BIOMATE ECM-ricariales (por ejemplo, colágenos, fibrinas) que se pueden complementar con diversos factores químicos (por ejemplo, factores angiogénicos, factores de crecimiento) 55,56, células progenitoras y / o células iPS. Además de los factores químicos, fuerzas mecánicas también controlan la angiogénesis 23,37. La rigidez de los cambios de gel de fibrina en un fibrinógeno de manera dependiente de la concentración 57 y la manipulación de la concentración de fibrinógeno puede afectar la angiogénesis no sólo a través de señales químicas, sino también a través de señales físicas 58,59. Por lo tanto, las propiedades fisicoquímicas de los geles de fibrina pueden necesitar ser optimizado cuidadosamente para recapitular la angiogénesis fisiológica específica de órgano en el futuro. La curación de heridas después de raspar la pleura visceral también produce un coágulo de fibrina endógena, que incluye varios tipos de células huésped y promueve el proceso de curación y regeneración de tejidos. Este coágulo natural puede interactuar con el gel de fibrina exógenamente implantado, y por lo tanto controlar angiogénesis en el gel implantado. Fluorescently fibrinógeno marcado puede permitir a los investigadores distinguir entre coágulo de fibrina natural y gel de fibrina implantado y explorar estos mecanismos. Aunque este es un poderoso método para caracterizar la angiogénesis en los pulmones del ratón adulto, la aplicación para el estudio del desarrollo de pulmón y enfermedades en ratones recién nacidos probablemente presentan desafíos técnicos.
El objetivo final de este estudio es reclutar vasos sanguíneos funcionales en geles de fibrina implantados en pulmones enfermos y de utilizar la matriz como un dispositivo médico para restaurar las estructuras funcionales de pulmón. Posibles comunicaciones entre las células huésped y el vascular y estructuras alveolares dentro de los geles así como la funcionalidad de estas estructuras deben explorarse en futuros experimentos. Dado que los niveles de VEGF en los pulmones están disminuidos en pacientes con TLP 60 y el enfisema 61, añadiendo VEGF a la matriz puede mejorar el reclutamiento de los vasos sanguíneos en los impl matrizrealizado una apuesta inicial en estos pulmones enfermos. Propiedades mecánicas también difieren entre los pulmones sanos y enfermos 23,62. Por ejemplo, la expresión de metaloproteinasas de la matriz y la lisil oxidasa, que controlan la degradación y reticulación de los colágenos, respectivamente, se altera en diversas enfermedades pulmonares incluyendo EPOC y fibrosis pulmonar 63-67. En pulmones enfermos, ciertos linajes de células progenitoras endoteliales de pulmón y células epiteliales se agotan 68. Por lo tanto, la manipulación de estos factores (factores angiogénicos, ECMs, ECM) de rigidez o implantar geles de fibrina complementados con células progenitoras 69 es probable que conduzca a la formación de vasos sanguíneos funcionales dentro de la matriz y la recuperación de la función pulmonar en varias condiciones patológicas. Dado que los factores químicos pueden complementarse dentro de los geles de fibrina para modular la angiogénesis local, este sistema también se puede utilizar explorar señales ambientales específicas que pueden normalizar pulmones enfermos en enfermedades pulmonares crónicas.
En resumen, este artículo presenta un método para implante de hidrogel de fibrina en la superficie de pulmón de ratón vivo, que permite a los investigadores caracterizar la angiogénesis pulmonar específica in vivo. Modificación de diversos factores (por ejemplo, transcurso del tiempo, las concentraciones y combinaciones de factores angiogénicos, varios tipos de hidrogeles, propiedades fisicoquímicas de hidrogeles) en este sistema, dará a conocer los mecanismos de la angiogénesis y la regeneración en el pulmón. Por lo tanto, este sistema avanzará significativamente el conocimiento científico de la biología vascular básica, ingeniería de tejidos, así como la medicina pulmonar.
The authors declare that they have no competing financial interests.
Este trabajo fue apoyado por fondos de la American Heart Association (AM), el Departamento de Defensa de Estados Unidos (BC074986) y del Hospital Infantil de Boston Facultad beca Desarrollo Profesional (TM, AM). Los autores agradecen a Amanda Jiang y Jiang Elisabeth para la asistencia técnica.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
21 G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
Antibody against SP-B | Abcam | AB40876 | Immunohistochemistry |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoThis article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados