Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

Métodos são descritos para-cromatografia em camada delgada (TLC) separação de extratos de plantas e contatar bioautografia para identificar metabólitos antibacterianos. Os métodos são aplicados para o rastreio de compostos fenólicos de trevo vermelho que inibem bactérias produtoras de amoníaco hiper (HAB) nativas para o rúmen de bovinos.

Um ecrã comum para compostos anti-microbianos de plantas consiste na separação dos extractos de plantas por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC), expondo os cromatogramas para as suspensões microbianas (por exemplo, fungos e bactérias em caldo ou ágar), dando tempo para que os micróbios a crescer em um ambiente úmido e visualizar zonas sem crescimento microbiano. A eficácia deste método de rastreio, conhecido como bioautografia, depende tanto da qualidade da separação cromatográfica e os cuidados com as condições de cultura microbiana. Este artigo descreve os protocolos padrão para TLC e bioautografia contato com uma nova aplicação de aminoácidos bactérias fermentadoras de ácido. O extrato é separado em flexíveis (lastreados em alumínio) placas de sílica TLC, e bandas são visualizados sob luz ultravioleta (UV). As zonas são cortadas e incubadas a face para baixo em ágar inoculado com o microrganismo teste. Bandas de inibição são visualizadas por coloração da placa de ágars com tetrazólio vermelho. O método é aplicado para a separação de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) compostos fenólicos e seu rastreio quanto à actividade contra Clostridium sticklandii, uma bactéria produtora de amoníaco hiper (HAB) que é nativo ao rúmen de bovinos. Os métodos de TLC aplicar a vários tipos de extractos de plantas e outras espécies bacterianas (aeróbicas ou anaeróbicas), bem como fungos, podem ser usados ​​como organismos de teste, se as condições de cultura são modificados para se ajustar aos requisitos de crescimento das espécies.

Ensaio para compostos anti-microbianos em plantas requer a separação dos componentes de um extracto de planta, a exposição de um microorganismo de teste para os componentes, e determinar se o crescimento do microorganismo é inibida por qualquer um dos compostos. Separações por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC) é conveniente, porque muitos compostos podem ser separados sobre uma superfície plana. A separação baseia-se na polaridade, com a ligação de alguns compostos estreitamente ao adsorvente (celulose, no caso de PC, e uma variedade de adsorventes em caso de TLC) e a migração de menos do que os outros ^1. Figura 1 fornece um exemplo das posições relativas compostos fenólicos polares e não polares, após separação numa placa de sílica de CCF.

Figura 1. Diagrama que ilustra a distribuição de compostos de diferentes polaridades, após separação num gel de cromatografia de camada fina (TLC) da placa. Compostos fenólicos de trevo vermelho (Trifolium pratense L.), são utilizados como um exemplo. Compostos polares, tais como clovamide, têm uma forte afinidade para um adsorvente polar como sílica e permanecer perto da origem (OR), enquanto que os compostos menos polares, tais como os três isoflavonas perto da frente do solvente (SF), partição mais facilmente em solventes (que são menos polares do que a água a menos de sílica, ácidos ou bases são incluídos) e migra mais longe da placa.

Após a separação de um extracto de uma placa de TLC, os microrganismos de teste podem ser expostos a todos os compostos na placa, acelerando, assim, a identificação dos componentes activos de um extracto ^2. Se uma cultura fúngica ou bacteriana é exposta ao cromatograma, o crescimento microbiano irá ocorrer em todos os lugares, excepto em áreas de crescimento com inibidorcompostos y. As zonas de inibição, em seguida, pode ser visualizado pela observação do contraste entre o crescimento micelial e as áreas livres do crescimento de fungos se foram aplicadas ^3, ou por pulverização com os compostos que mudam de cor quando reduzido ou hidrolisados ​​pelas células vivas ^4. Embora o uso de papel ou de camada fina cromatogramas para ensaios antimicrobianos foi aplicado pela primeira vez aos antibióticos e fungicidas ^{5 3,6,} extratos de plantas já são freqüentemente selecionados para compostos antimicrobianos com este método, muitas vezes referida como bioautografia. Os protocolos aqui descritos aplicam-se a bioautografia dos cromatogramas em camada fina. TLC é amplamente usada porque é relativamente rápida e pode ser realizada em diferentes adsorventes (por exemplo, sílica, amido, alumina), bem como proporcionar boa resolução e sensibilidade ^1.

Extractos vegetais podem ser preparados por TLC de muitas maneiras. Os métodos mais comuns incluem material vegetal extração em alcmisturas OHOL em água tais como etanol a 80% ^7,8, possivelmente com a adição de ácido ou de base ^9. Na sequência de uma extracção em solventes, que contêm água e que são, eventualmente, ácido ou básico, extractos deve ser concentrado de modo a que possam ser aplicadas a placas de TLC em um volume mínimo. A concentração dos extractos de álcool-água pode ser alcançado através da repartição com solventes orgânicos imiscíveis em água ⁸ ou com uma mistura de tais solventes, tal como acetato de etilo-éter etílico (1:1, v / v) ^10,11. Diferentes metabolitos de plantas são extraídos em diferentes solventes orgânicos, dependendo das suas polaridades. Para garantir que os ácidos orgânicos vegetais ou bases são extraídos para solventes orgânicos, nesta fase, o pH de um extracto de álcool e água pode ser aumentado ou reduzido com um ácido solúvel em água ou uma base para converter analitos dissociados em suas formas nondissociated, que são então solúveis em solventes orgânicos neutros ^9. A fase orgânica pode então ser evaporated sob pressão reduzida ou sob azoto, e ajustou-se o volume pretendido de TLC. O pH do extracto é improvável que seja letal para os microorganismos bio-ensaio, devido à partição de analitos em dissolventes neutros, pequeno volume final, e a evaporação do extracto sobre a placa de TLC, antes da separação.

Ambos os fungos e bactérias são empregados como microrganismos testes em bioautografia de extratos vegetais ^2. Esporos de alguns fungos, tais como Cladosporium cucumerinum, germinar sobre placas de TLC (além de regiões com compostos inibitórios), se for pulverizado sobre placas de uma solução nutriente e incubou-se em um ambiente húmido durante vários dias ^3. O micélio escuro da C. cucumerinum em zonas noninhibitory fornece um nítido contraste com as zonas francas de crescimento micelial. Apesar de as bactérias terem sido aplicadas a cromatografia em camada fina (TLC) as placas da mesma forma que ^4,12, bactérias também são derramadas sobre TLCsuperfícies da placa de ágar sobrepõe ^13,14. Levedura, tais como Candida albicans, pode ser aplicado em sobreposições de agar, bem ^14. Alternativamente, placas de TLC pode ser colocado de bruços em ágar inoculadas com bactérias ou leveduras ^{10,15 8,} um método conhecido como contato bioautografia ^2.

Nós descrevemos um método para contato bioautografia para triagem de compostos fenólicos antimicrobianos de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland). O microrganismo teste é sticklandii Clostridium, uma produtora de amônia bactéria hiper ruminal (HAB) e obrigar anaeróbio. Embora as separações utilizados não resolve todos os componentes do extracto, que facilitam a identificação de zonas de actividade antimicrobiana, reduzindo, assim, o conjunto de possíveis compostos antimicrobianos. O protocolo utiliza procedimentos padrão para TLC ^1. O protocolo também descreve algumas das técnicas necessárias para a cultura obrianaeróbios de corrediça para um tal ensaio, a utilização de contacto bioautografia ¹⁵ e um método de visualização com um sal de tetrazólio, que cora as células vivas ^{de 2,4.}

1. Preparação de Extrato vegetal

1. Veja Kagan e Flythe ¹⁰ para a extração de compostos fenólicos de Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Para extrair outros compostos em outras plantas, veja a literatura análise fitoquímico por métodos de extracção de plantas ou específica do metabolito (muitos estão descritos), ou olhar para protocolos, tais como aqueles de Khurram et al. ^7,8 que isolam diversos compostos com uma vasta gama de polaridades.

2. Preparação das placas de camada fina

1. Limpo placas de TLC de desenvolver em um ou mais solventes polares, neutras, a fim de mover os contaminantes adsorvidos para longe da zona de desenvolvimento.
   1. Numa hotte, preparar suficiente solvente de limpeza (por exemplo, de 15-100 ml de acetato de etilo-metanol 2:1, v / v) para cobrir a parte inferior da câmara de cromatografia, bem como a extremidade inferior de uma placa de TLC quando conjunto no interior da câmara.
   2. Use comercialmentevidro cialmente disponível TLC desenvolver câmaras (diferentes tamanhos disponíveis, com tampas) ou coberto com folha de alumínio copos pirex ou frascos de preservação.
   3. Use a tesoura para cortar placas de gel de sílica (flexíveis) plástico apoiado, que vêm em vários tamanhos (20 cm x 20 cm e menores), para ajustar a câmara de desenvolvimento, disponível em alumínio ou. (Atenção: sílica pode causar danos nos pulmões se inalado Trabalhar em um exaustor, e lidar com placas de TLC com luvas para evitar a oleosidade da pele para a sílica.).
   4. Coloque as placas na câmara, com os topos encostados as paredes da câmara. As placas não devem tocar uns aos outros. Cubra e deixe a câmara de mover o solvente até a placa por ação capilar.
   5. Quando solvente alcançou o topo das placas, remover as placas de câmara e organizar em uma posição de pé dentro da coifa até solvente tenha evaporado.
   6. Verifique se as impurezas migraram perto do topo da placa de TLC, procurando por uma faixa amarela sob visívelluz, ou uma banda fluorescente sob luz ultravioleta (UV) (ver "frente impureza" ou se na Figura 2B). Se a maioria da placa ainda tem um tom amarelado, repetir o processo de limpeza.
   7. Depois de remover as placas de TLC da câmara, descartar o solvente. Permitir solvente residual evaporar completamente antes de usar a câmara para Protocol 2.
   8. Para remover a humidade residual, que pode afectar a migração de compostos em sílica ^16, as placas de suporte na posição vertical em um forno de secagem a 100 ° C (10-15 min para a 20 cm x 20 cm de placa, e 5 min para 7 cm x 10 cm placas ).
   9. Se um forno de secagem de 100 ° C não está disponível, as placas de calor por um longo período de tempo, a temperaturas mais baixas (ou seja, 40 min a 60 ° C).
   10. Depois as placas são secas, deixá-las arrefecer até à temperatura ambiente antes do carregamento.

3. Preparação de Desenvolvimento de Chambers para Extrato de Separação

1. Use a tesoura para cortar um pedaço de papel de filtro ligeiramente abaixo da altura da câmara, e cerca de metade do perímetro da câmara de largura. Este trabalho funciona como um pavio para desenhar solvente até a parede da câmara e saturar a câmara com vapores de solventes, melhorando assim a reprodutibilidade das separações ^1.
2. Em uma capela, misture solventes (acetato de etilo-metanol 4:1, v / v, para este estudo). Despeje a mistura de solvente para a câmara e cobrir. Espere até que todo o pavio está molhado com solvente, indicando saturação de câmara, para colocar placas na câmara.

4. Carregando e Desenvolvimento de Placas de TLC

1. Levemente marcar a origem com o lápis. Se a placa de TLC adsorvente é macio e facilmente danificada, fazer marcas nas bordas. Os compostos devem ser acima da superfície do solvente de desenvolvimento quando as placas são inseridos na câmara de CCF.
2. Dissolve-se os extractos em solvente orgânico suficiente (neste caso, metanol) para se ter uma solução concentrada, em vez de um turvosuspensão.
3. Carregar as amostras e padrões como bandas estreitas com uma seringa de microlitros ou micropipetas capilares, deixando uma borda de 1 cm na os lados da placa. Permitir que as bandas para secar (ventilando a placa ou carregá-lo em um exaustor ajuda).
4. Se uma maior concentração de amostra é necessária em uma placa, "overspot" por colocar as amostras de novo sobre as bandas secas.
5. Com fórceps ou pinças, conjunto placa (s) no interior da câmara TLC saturada. As placas não devem tocar o pavio, pois pode proporcionar solvente para as chapas em pontos de contacto, alterando, assim, o percurso de migração do composto. Tampa da câmara e deixar placas desenvolver.

5. Preparação das placas para Bioassay

1. Remova a placa (s) a partir do tanque de TLC antes da frente de solvente atingir o topo da placa, e marcar a altura da frente de solvente com um lápis. Vamos placa seca na coifa.
   1. Desenvolver quaisquer placas de TLC restantes na mesma câmara TLC, que é generally utilizável por um dia inteiro, se mantida fechada. Refazer mistura solvente de CCF câmara se a quantidade de solvente na câmara diminui notavelmente.
2. Após as placas são secas, visualizar bandas sob luz visível ou UV, e delinear as bandas com um lápis. Uma câmara de visualização com uma lâmpada UV portátil é conveniente, em especial, se a lâmpada pode detectar compostos, tanto a 254 nm (com ondas curtas de UV) e 365 nm (UV de onda longa).
   Nota: Neste momento ou após a etapa seguinte, as placas podem ser embrulhados em plástico, cobertos com folha, e armazenada a -20 ° C. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade composto. Porque não é sílica neutra, alguns compostos podem degradar durante a placa de TLC.
3. Fotografar ou desenhar placas.
   1. Use um sistema de fotodocumentação gel se equipado com UV sobrecarga e / ou luzes visíveis está disponível.
   2. Se nenhum sistema de fotodocumentação comercial está disponível, as placas de fotografia dentro de uma caixa forrada com papel escuro ou tecido, with um conjunto de câmera em um tripé e uma luz UV portátil preso a um anel ficar ^17. Ao fotografar as placas que não têm nenhum indicador fluorescente, use um filtro de luz azul sobre a lente da câmera para melhorar a aparência da banda ^17.
4. Para ajudar na caracterização de bandas, calcular os valores do factor de retenção _(Rf) de medição de distâncias percorridas por composto e frente de solvente, e dividindo-se a primeira pela segunda (Figura 2A).

6. Cultura bacteriana e Ensaio

1. Preparar e inocular mídia em condições anaeróbias. A cultura utilizada neste caso era Clostridium SR sticklandii estirpe, que foi obtida a partir da colecção de culturas de James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Veja Flythe e Kagan ¹³ ea lista de materiais para uma descrição dos meios de comunicação HAB.
2. Incubar a cultura a fase exponencial ou estacionária. Use techniqu anaeróbia estériles quando se trabalha com microrganismos anaeróbios.
3. Inocular a cultura (1% v / v) em agar fundido depois da temperatura do ágar (0,75% w / v), foi reduzido para menos de 60 ° C. Misture delicadamente e trazer imediatamente em câmara de anaerobiose (95% de CO ₂ -5% H ₂ atmosfera para a mídia HAB) para derramar.
4. Verte-se 15 milímetros x 100 mm placas de Petri de plástico, e deixar solidificar.
5. Com uma tesoura, corte a placa de TLC em zonas contendo banda (s) de interesse. Coloque faixas viradas para baixo em placas de ágar, marcando bandas na placa de apoio para acompanhar a orientação do original na placa TLC. Coloque uma tira TLC não utilizada para uma placa de agar como um controlo.
6. Incubar as placas de agar agar para baixo, de lado, na câmara de anaerobiose (24 hr, 39 ° C).

7. A visualização das placas ensaiadas biologicamente Agar

1. Com uma pinça, remover faixas de placas de agar enquanto estão na câmara de anaerobiose.
2. Adicionar 1% (w / v) de tetrazolium vermelho, preparado em água, gota a gota, sobre as superfícies das placas de agar. Permitir que a cor se desenvolva durante pelo menos 20 minutos, ou até que a placa de controlo fica completamente vermelha, antes de remover a partir da câmara de anaerobiose. As bactérias anaeróbias começará a perder a viabilidade imediatamente após a remoção da câmara anaeróbia, mas a cor é estável por mais de 24 horas.
3. Fotografia em luz visível.

Representante separações sílica TLC de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) extratos contendo compostos fenólicos, são mostrados na Figura 2. Separação do extracto de trevo vermelho em acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), mais de 8,5 centímetros, resultou em cinco bandas, uma incompletamente resolvidos a partir da origem (Figura 2A). No entanto, a Figura 2B mostra que cerca de duas vezes mais bandas foram revelados quando uma amostra diferente de extrato de trevo vermelho (da mesma cultivar, mas cresceu em um lote separado na mesma fazenda) foi separado por uma distância maior (15 cm em vez de 8,5 cm) e com dois sucessivos desenvolvimentos em diferentes sistemas de solventes. O cromatograma da Figura 2B foi desenvolvido pela primeira vez em acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), e, em seguida, deixa-se secar e separado em acetato de etilo-metanol (78:22, v / v). Estes resultados demonstram que tanto o tamanho da placa e da escolha do sistema solvente (ou uma série de s solventesfo r) podem afectar o número de compostos separados num cromatograma. Neste caso particular, a eluição e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de bandas de outras separações de TLC dos mesmos extractos confirmado que os compostos restantes no ou perto da origem consistia principalmente de compostos fenólicos (ácidos fenólicos ou isoflavonas) conjugados com partes polares tais como derivados de amino ácidos, açúcares, ou ácido málico. Em contraste, as isoflavonas não conjugados com partes polares migrou mais para cima das placas de TLC de ^10.

Os resultados de um bioensaio de placa de TLC mostrada na Figura 2A com Clostridium sticklandii, uma bactéria produtora de amoníaco hiper ruminal (HAB), são mostrados na Figura 3. A adição de 1% (w / v) de solução aquosa de tetrazólio vermelho para as placas de agar após um período de incubação de 24 horas resultou em uma cor vermelho brilhante, quando as células vivas foram coradas. Incubação de banda 1 (biochanina A) e parte da band 2 (formononetina) em agar semeado bactérias resultou numa zona bem definida de inibição (Figura 3A). No entanto, a incubação de o restante da banda 2, juntamente com as faixas 3 e 4, não inibiu o crescimento bacteriano (Figura 3B). Estes resultados demonstraram que a biochanina A era inibitório para C. sticklandii crescimento, mas não foi formononetina.

Figura 2. Sílica em camada fina de cromatografia (TLC) separações de extrato de Trifolium pratense cv. Kenland, desenvolvido em (A) acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), ou (B) que mesmo solvente, seguido por desenvolvimento em acetato de etilo-metanol (78:22, v / v). A distância migrada o solvente entre a origem (OR) e frente de solvente (SF) é indicada junto dacolchetes entre esses dois limites. Na Figura 2B, a "frente de impureza" (IF, a localização das impurezas movida para cima da placa de pré-lavagem no seio de solventes polares) é visto como uma banda escura perto do topo da placa. Extractos preparados 180-250 mg liofilizados folhas do trevo vermelho e caules, foram dissolvidos em metanol, e 10% de extracto de (A) ou 32% (B) foi carregada sobre placas de sílica. Padrões carregadas foram formononetina (f, 7.1 nmol), a biochanina A (ba, 7,4 nmol), a genisteína (g, 9,8 nmol) e clovamide (Cl, Figura 2B apenas, 8,7 nmol). Bandas foram circulou enquanto visto sob uma lâmpada UV de mão a 254 nm (onda curta UV) e 365 nm (UV de onda longa). Uma câmera digital foi usada para fotografar a placa sob UV de ondas curtas. Os números à direita das bandas de extracto de trevo na Figura 2A referem-se às zonas de recorte para bioensaios. Fatores de retenção (R _f, travele distânciad por banda / distância percorrida pelo SF) estão entre parênteses após números da banda na Figura 2A.

Figura 3. Resultados do TLC bioensaios placa de (A) uma banda ea parte superior incompleta resolvido de banda 2 da placa de TLC da Figura 2A, e (B) 2-4 bandas do mesmo prato TLC. Bandas foram colocadas viradas para baixo em meio HAB inoculadas com Clostridium sticklandii e incubadas anaerobicamente 24 horas a 39 ° C. No final deste período de incubação, as bandas foram removidas, e as placas de agar foram coradas com uma solução aquosa de 1% (w / v) de tetrazólio vermelho e fotografado sob luz visível.

Este protocolo descreve um método simples para a separação de um extrato em subconjuntos de compostos e ensaiando esses subconjuntos por contato bioautografia. O método é bastante semelhante ao utilizado por ¹⁵ Chomnawang et al. Seleccionar para os metabolitos de plantas inibidoras para as bactérias causadoras de gonorreia. O tipo de bioautografia empregues para o rastreio de compostos anti-microbianos de plantas depende de muitos factores, incluindo o microorganismo de teste, a configuração de laboratório, e as preferências da pessoa (s) que executa o bioensaio. Contacto bioautografia, o método utilizado neste estudo, tem sido criticado por, dependendo da capacidade de um composto para se difundir para o meio de inoculação ^12. As zonas de inibição em relação aos compostos em concentrações baixas, ou com pouca capacidade de se difundir para o meio, pode não ser detectável se o crescimento ocorre no ágar por baixo da diffusate. Além disso, uma zona de inibição criada por uma banda pode espalhar além inicial da bandalimites, assim, possivelmente, mascarando zonas de inibição criada por compostos vizinhos ^14. No entanto, o contacto bioautografia é um método fácil de utilizar, bem como a capacidade para empilhar as placas de Petri minimiza a quantidade de espaço necessário. Além disso, colocando bandas de TLC em agar elimina o risco de extinção e de difusão de banda que pode ocorrer quando uma placa de TLC é revestida com ágar semeado ou pulverizado com o microorganismo de teste.

A obtenção de informação a partir de qualquer um dos tipos anteriores de bioautografia depende das condições cromatográficas, concentração de ensaio de microrganismos, e as condições de cultura / incubação. Resolução cromatográfica de bandas de antimicrobianos não é indispensável, mas a sensibilidade pode ser maior para uma banda bem-resolvido ^6. As bandas podem ser separados por desenvolvimento em placas mais longos ou em vários sistemas de solventes em uma dimensão (Figura 2B), ou em duas dimensões, transformando uma placa de TLC de 90 graus antes de desenvolvimentonuma segunda ^16,19 solvente. Os compostos polares que podem ser difíceis de separar através de sílica sem a utilização de misturas de solventes que contêm ácidos ou bases. Estes podem ser letal para o microorganismo de teste ^12, embora o uso de pequenas quantidades de ácidos foi avaliado ^14,15. Os sistemas solventes alternativos podem incluir água ou metanol como componentes ^20,21. Os compostos polares também podem ser resolvidos em diferentes tipos de placas de TLC, como as placas revestidas com o C ₁₈ adsorvente ou celulose microcristalina. No entanto, o crescimento ^{de 12} ou sensibilidade ao agente visualização ¹⁴ pode ser impactado negativamente em alguns desses adsorventes.

Muitas combinações diferentes de microorganismo de teste e meios de comunicação podem ser usados ​​por bioautografia. No entanto, vários fatores devem ser considerados na seleção de microrganismos e meios de comunicação. Os meios de comunicação deve ser testado para se determinar que não há componentes que reduzem a tetrazolium sal e provocar uma mudança de cor não-biológica. O ágar também deve ser suficientemente leve de cor para proporcionar contraste entre as células coradas e não coradas zonas de inibição. Um microorganismo que apenas pode crescer na superfície de ágar pode ser removida juntamente com a banda de TLC ou lavado durante a coloração. Além disso, a selecção de combinação microorganismo / meio que minimiza a produção de gás vai reduzir bolhas no agar. Rúmen HAB crescer num meio isento de hidratos de carbono tamponada com carbonato com uma mistura de aminoácidos ou de peptídeos como o substrato de crescimento. As placas de ágar são ouro claro e transparente. Quando C. sticklandii é cultivado no meio, a maior parte dos produtos são solúveis (ácidos gordos voláteis, amónia). Muito pouco gás é produzido, o que resulta em uma placa de agar suave, sem bolhas.

Este bioensaio tem um par de aplicações potenciais. O tamanho da zona de inibição pode ser utilizado como uma estimativa aproximadaa quantidade do composto inibidor, uma vez que o raio da zona de inibição é proporcional ao logaritmo da quantidade do composto que causa a inibição de ^17,22. Talvez o uso mais comum de TLC bioensaios placa é estreitar a gama de possíveis compostos antimicrobianos em um extrato de planta. Após as zonas de inibição são identificados por um bioensaio, as regiões correspondentes de uma placa de TLC duplicado pode ser eluída com um solvente, tal como metanol ou acetato de etilo, e analisadas por HPLC com detecção por espectroscopia de ultravioleta para iniciar a caracterização de compostos bioactivos ^10,14.

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais no artigo é apenas para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo USDA. Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Agradecemos ao falecido Dr. Norm Taylor, Departamento de Plantas e Ciência do Solo da Universidade de Kentucky, por nos permitir usar amostras de suas tramas trevo vermelho para este estudo. Este projeto foi financiado pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos.