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方法描述为薄层色谱(TLC)分离植物提取物和生物自显影接触,以确定抗菌代谢产物。该方法适用于红三叶草酚类化合物抑制超氨生产菌(HAB),原产于牛瘤胃的筛选。
对植物的抗微生物化合物的常用屏幕包括由纸或薄层色谱法(PC或TLC)分离的植物提取物,露出色谱微生物悬浮液( 例如,在液体培养基真菌或细菌或琼脂),允许时间为微生物生长中的潮湿环境中,并且可视区与无微生物生长。该筛选方法,被称为生物自显影的效果,取决于色谱分离的质量和用微生物培养条件下所采取的照顾。本文介绍了一种新型的应用氨基酸发酵菌的TLC和接触生物自显影技术的标准协议。将提取物上分离柔性(铝背)硅胶TLC板,并频带下的紫外线(UV)光可视化。区域被切出并孵育面朝下于琼脂接种试验微生物。抑制带被染色的琼脂平板可视化s的四氮唑红。该方法适用于红三叶草( 红三叶品种。Kenland)分离酚类化合物及其筛查对梭状芽孢杆菌sticklandii,一个超氨产生菌(HAB)是原产于牛瘤胃活动。在TLC的方法适用于许多类型的植物提取物和其它的细菌菌种(好氧或厌氧),以及真菌的,可以作为测试生物体,如果培养条件进行修改,以适应植物的生长要求。
在植物中测定抗微生物化合物需要分离的植物提取物的组分,露出试验微生物的那些部件,并确定由任何所述化合物的微生物的生长是否受到抑制。分离由纸或薄层色谱法(PC或TLC)是方便的,因为很多化合物可在平面表面上进行分离。分离是基于极性,与一些化合物的结合紧密的吸附剂(纤维素在PC机的情况下,以及各种在薄层的情况下,吸附剂)和迁移小于其他1, 图1提供的相对位置的一个例子在硅胶TLC板上分离后极性和非极性的酚类化合物。
图1。示出在硅胶薄层色谱(TLC)板分离后不同极性的化合物的分布。红三叶草( 红三叶 L.)的酚类化合物被用作一个例子。极性化合物,如clovamide,有一种极性吸附剂像二氧化硅有很强的亲和力,并保持靠近原点(OR),而极性较小的化合物,如靠近溶剂前沿的3异黄酮(SF),分区更容易进入溶剂(除非水,酸,碱或包含它们比二氧化硅极性较小)和迁移更远了板。
的提取物在TLC板上分离后,试验微生物可以暴露于板上的所有化合物中,从而加速的提取物2的活性成分的鉴定。如果是真菌或细菌培养物暴露于色谱,会发生微生物生长无处不在,除了以上与生长抑制剂领域Ÿ化合物。抑制区则可以通过观察菌丝生长和生长无区域之间的对比,如果真菌已经应用3或者通过与该改变颜色由活细胞4降低或水解时的化合物喷雾可视化。虽然使用纸或薄层色谱的抗菌试验首先被施加到抗生素5和杀菌剂3,6,植物提取物,现在经常筛选出抗微生物化合物用这种方法,通常被称为生物自显影。本文中所描述的协议适用于薄层色谱生物自显影。 TLC被广泛使用,因为它是相对快速的,并且可以在不同的吸附剂( 如硅胶,淀粉,氧化铝),以及提供良好的分辨率和灵敏度1进行。
植物提取物可用于TLC以多种方式来制备。常用的方法包括提取植物材料的ALCohol -水的混合物,如80%乙醇7,8,可能与另外的酸或碱9。以下在这些溶剂,其中含有一些水,并且可能是酸性或碱性的提取,提取物,必须进行浓缩,以便它们可以应用到TLC板在最小的体积。的醇-水提取物中的浓度可以通过与水不混溶的有机溶剂的8或与此类溶剂,如乙酸乙酯-乙醚(1:1,V / V)10,11的混合物隔开来实现。异植物代谢产物提取到不同的有机溶剂,这取决于它们的极性。以确保植物有机的酸或碱都在此阶段萃取到有机溶剂中,醇 - 水提取物的pH可以升高或降低与水溶性酸或碱解离的分析物转化为它们的nondissociated的形式,然后将它们溶于中性有机溶剂9。然后将有机相可以通过电子邮件在减压或在氮气氛下vaporated并调整为薄层所需的音量。该提取物的pH不太可能是致命的,因为分析物的分割成中性溶剂,小终体积,并在TLC板上分离前的提取物蒸发生物测定微生物。
这两种真菌和细菌被用作试验的微生物在植物生物自显影提取2。一些真菌,如黑星病的孢子发芽在TLC板(除了与抑制性化合物的区域),如果在一个营养液喷洒到板并孵育在潮湿的环境中几天3。 C.暗菌丝体星病的noninhibitory区提供了一个鲜明的对比,免费菌丝生长的区域。虽然细菌已被施加到薄层色谱(TLC)板以相同的方式4,12,细菌也被倾倒在TLC板面在琼脂覆盖13,14。酵母,如白色念珠菌 ,可在琼脂覆盖层被应用,以及14。此外,TLC板可以向下放置脸上琼脂上接种细菌10,15或酵母8,称为接触性生物自显影2的方法。
我们描述了一种接触生物自显影筛选抗菌酚类化合物从红三叶草( 红三叶品种。Kenland)。该测试微生物是梭菌sticklandii,一个超瘤胃氨产生菌(HAB)和专性厌氧菌。尽管所使用的分离不能解决提取物的所有组成部分,它们有助于确定抗菌活性的区域,从而缩小可能的抗菌化合物的游泳池。该协议采用标准程序TLC 1。该协议还介绍了一些需要培养obli技术门厌氧菌对这样的测定,接触生物自显影15和可视化方法的具有四唑鎓盐,其染色活细胞2,4的 使用。
1。植物提取物的制备
2。薄层板的制备
3。钱伯斯开发的提取分离制备
4。加载中TLC板与发展
5。用于制备生物测定板的
6。细菌培养和检测
7。的生物测定琼脂平板可视化
红三叶草( 红三叶品种。Kenland)提取物,含有酚类化合物,有代表性的二氧化硅薄层色谱分离见图2。红车轴草提取物中乙酸乙酯-正己烷分离(9:1,V / V),超过850厘米,导致五阶,一是从原点不完全解析( 图2A)。然而, 图2B表明,大约两倍多的条带,表明当红三叶草提取物(来自同一品种,但在一个单独的情节在同一农场种植)不同的样本中分离了一个较大的距离(而不是15厘米8.5厘米),并用在不同的溶剂系统的两个连续的发展。 图2B的色谱图中,用乙酸乙酯-己烷首先研制(9:1,V / V),然后使之干燥,并在乙酸乙酯-甲醇中分离(78:22,V / V)。这些结果表明,溶剂系统(或一系列的溶剂S的两个板的尺寸和选择度提供意見)会影响分离的色谱化合物的数量。在这种特定情况下,洗脱,并从相同的萃取的其它TLC分离频带的高效液相色谱法(HPLC)证实,其余在或接近原点的化合物主要包括缀合的极性基团的酚类化合物(酚羧酸或异黄酮)如氨基酸衍生物,糖类,或苹果酸。与此相反,未缀合的极性部分异黄酮迁移更远了TLC板10。
与梭菌sticklandii,一个超瘤胃氨生产菌(HAB), 如图2A所示,在薄层板上的生物测定的结果示于图3。添加1%(W / V)的四氮唑红到24小时培养后的琼脂平板水溶液产生了鲜红的颜色,当活细胞进行染色。带1的潜伏期(鹰嘴豆芽素A)和Ba的一部分ND 2(芒柄 花素)对细菌接种的琼脂导致了一个明确的抑制区( 图3A)。然而,温育的带2的其余部分,随着条带3和4中,没有抑制细菌生长( 图3B)。这些结果表明,鹰嘴豆芽素A是抑制到C。 sticklandii增长,但芒柄花素不是。
中红车轴草提取物CV图2。硅胶薄层色谱(TLC)分离。 Kenland,在(A)的乙酸乙酯-己烷(9:1,V / V),或(B)在随后的发展在乙酸乙酯-甲醇中相同的溶剂(78:22,V / V)的距离迁移由开发原点(OR)和溶剂前沿(SF)之间的溶剂是表示靠近括号这两个边界之间。在图2B中,“杂质前沿”(IF,杂质的位置向上移动的板通过预洗涤在极性溶剂中)被视为邻近所述板的顶部上的暗带。提取,从180-250毫克冻干红三叶草的叶子编制及茎,溶于甲醇,并提取物(A)或32%(B)的10%加载到硅胶板。加载标准是芒柄花素(F,7.1纳摩尔),鹰嘴豆芽素A(BA,7.4纳摩尔),染料木素(G,9.8纳摩尔),和clovamide(以Cl, 图2B只,8.7纳摩尔)。条带,盘旋而下,手持紫外灯波长为254 nm(短波紫外线)和365纳米(长波紫外线)查看。数码相机是用来在短波紫外光拍摄的板块。的编号,在图2A中的三叶草提取物条带指的是区域的右切出用于生物测定。保留因子(R F,距离traveleD由乐队/距离通过顺丰速行驶)是在括号中图2A带数字之后。
图3中的(A)波段1和波段2从图2A,和(B)带2-4从同一薄层板的薄层板的不完全解决的上部薄层板上,生物测定结果。乐队被裁减下来的脸民政事务局上中等接种梭菌sticklandii,并在39℃下厌氧培养24小时在此温育期结束时,带被除去,并且琼脂平板上进行染色的1%的水溶液(重量/体积)的四唑和红色可见光下拍摄的。
这个协议描述了一种用于提取物中分离到的化合物的子集,并通过接触生物自显影法测定的那些子集的简单方法。该方法非常类似于1使用Chomnawang 等人 15来筛选植物代谢产物抑制到淋病的细菌。生物自显影来屏幕抗菌植物化合物的类型取决于许多因素,包括微生物检验,实验室的设置,而该人(次)进行生物测定的喜好。联系生物自显影,在这项研究中所使用的方法,已经被批评为根据的化合物扩散到接种媒体12的能力。抑制过度的化合物在低浓度时,或者几乎没有能力扩散到介质的区域,如果生长在渗出下面琼脂发生可能无法检测到。此外,抑制由一个带创建一个区域可能扩散到乐队的初始边界,从而可能掩盖邻国化合物14中创建的抑制区。然而,接触生物自显影技术是一种简单的方法来使用,并且堆叠培养皿的能力,最大限度地减少所需的空间量。另外,敷设薄层频带到琼脂消除了带的溶解和扩散时TLC板上覆盖有接种的琼脂或喷洒试验微生物,可以发生的风险。
从上述任何类型的生物自显影的获取信息依赖于上述色谱条件下,测试微生物浓度,和文化/孵化条件。抗菌乐队的色谱分辨率是可有可无的,但灵敏度可能为一个良好的解决了带6更大。乐队可以通过发展再上板或多种溶剂体系由开发前90度转弯TLC板隔开在一维( 图2B),或在两个维度在第二溶剂16,19。极性化合物可能很难在硅胶上分离,而无需使用含有酸或碱的溶剂混合物。这些可能是致死的试验微生物12,虽然使用的少量的氨基酸已有报道14,15。替代溶剂系统可包括水或甲醇作为部件20,21。极性化合物也可以对不同类型的TLC板,如涂有C 18的吸附剂或微晶纤维素板的解决。然而,生长12或灵敏度的显色剂14可被带负上一些这些吸附剂的影响。
可用于生物自显影试验微生物和媒体的许多不同组合。但是,选择微生物和媒体时,几个因素必须加以考虑。媒体应该进行测试,以确定有没有组件,降低了TETrazolium盐,并导致非生物的颜色变化。琼脂也应该是足够轻的颜色,以提供染色细胞和抑制未染色区之间的对比度。一种微生物,只能生长琼脂表面上可随TLC乐队或删除染色过程中冲洗掉。此外,微生物/媒体组合,最大限度地减少天然气产量的选择将减少气泡的琼脂。瘤胃HAB生长在碳酸盐缓冲的,碳水化合物的培养基与氨基酸或肽作为生长衬底的混合物。该琼脂平板是浅金色和透明。当C。 sticklandii是生长在培养基中,大部分的产品都溶于(挥发性脂肪酸,氨)。很少的气体产生时,这导致了平稳的琼脂板上,以无气泡。
该生物测定有几个潜在的应用。抑菌圈的大小,可作为一个粗略的估计抑制性化合物的量,抑制带的半径,因为是成正比的化合物的量的对数使所述抑制17,22。也许最常见的使用薄层板上,生物测定是缩小可能的抗菌化合物的范围在植物提取物。后抑制区域由生物测定确定,在一个重复的TLC板上的相应区域可以用溶剂洗脱,例如甲醇或乙酸乙酯中,并通过HPLC用紫外光谱检测到开始表征生物活性化合物10,14进行分析。
在文章中商品名称或商品的一提的是,仅用作提供特定信息之目的,并不意味着推荐或认可由美国农业部。作者宣称没有竞争的经济利益。
我们感谢已故的博士。规范泰勒,系植物与土壤科学在肯塔基大学,允许我们使用的样品从他的红三叶草地块为这项研究。该项目是由农业部美国农业部。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
Ingredients for HAB media | |||
Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
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