Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Nós demonstramos um método para recolher bactérias magnetotáticas (MTB), que podem ser aplicadas para águas naturais. MTB podem ser isolados e enriquecidos a partir de amostras de sedimento utilizando uma configuração relativamente simples que aproveita magnetismo da bactéria natural. Isolado MTB pode então ser analisada em detalhe utilizando luz e microscopia eletrônica.

Bactérias magnetotáticas (MTB) são microorganismos aquáticos que foram pela primeira vez descritos nomeadamente em 1975 ^uma das amostras de sedimentos coletados em salinas de Massachusetts (EUA). Desde então MTB foram descobertos em água e sedimentos estratificados-colunas de todo o mundo ^2. Uma característica comum a todos MTB é que eles contêm magnetossomos, que são intracelulares, nanocristais ligado à membrana magnéticas de magnetita (Fe ₃ O ₄₎ e / ou greigite (Fe ₃ S ₄₎ ou ambos os ^{3, 4.} No hemisfério norte, MTB normalmente são atraídos para a extremidade sul de um ímã de barra, enquanto no hemisfério sul geralmente são atraídos para a extremidade norte de um ímã de ^3,5. Esta propriedade pode ser explorada durante a tentativa de isolar a partir de amostras ambientais MTB.

Uma das formas mais comuns de enriquecer MTB é a utilização de um contentor de plástico transparente de recolher os sedimentos e água a partir de uma fonte natural,tal como um tanque de água doce. No hemisfério norte, o sul de uma barra magnética é colocada contra a parte exterior do recipiente um pouco acima do sedimento na interface sedimento-água. Depois de algum tempo, a bactéria pode ser removido do interior do recipiente perto do magneto com uma pipeta e, em seguida, enriquecido ainda mais por meio de um capilar de pista ⁶ e um magnete. Uma vez enriquecido, a bactéria pode ser colocado sobre uma lamela de microscópio, utilizando um método de gota pendente e observados num microscópio de luz, ou depositado sobre uma grelha de cobre e observadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM).

Usando este método, isolado MTB pode ser estudada microscopicamente para determinar características tais como o tipo de comportamento de natação, e número de flagelos a morfologia das células, das células, a forma dos cristais magnéticos, número de magnetossomos, o número de cadeias de magnetossomos em cada célula, a composição de os cristais nanomineral e presença de vacúolos intracelulares.

1. MTB Colecção

1. Ao decidir sobre um local de água doce para coletar bactérias magnetotáticas (MTB), muitas vezes é melhor começar com uma lagoa ou de baixa movimentação de fluxo que tem uma camada de sedimento suave lamacenta. Nesta demonstração coletamos uma amostra na margem do rio Olentangy no campus da Universidade Estadual de Ohio (OSU), em Columbus, Ohio (EUA). Embora isso fosse um local conveniente para a demonstração, o protocolo aqui descrito é aplicável a qualquer localização aquática. Os materiais utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela 1. Encontrar um local onde a profundidade da água está entre 10 e 100 cm. Em um local tão, você deve coletar a camada superior mais de sedimentos usando uma clara, recipiente com tampa. Colher o sedimento e de água para dentro do recipiente até que é preenchido com um terço até metade do sedimento e o volume restante com água. Manter o recipiente submersa até ser enchido com água e, em seguida, firmemente tampar o recipiente wom a sua tampa de rosca de topo. Não é necessário misturar o sedimento. Limpe a parte externa do recipiente com uma toalha seca e depois tirar a amostra para o seu laboratório. Não é necessário apressar a amostra de volta para seu laboratório. Deixamos amostras de BTT em recipientes de plástico no campo por vários dias antes de trazê-los de volta para o nosso laboratório. O MTB deve ser viável por várias semanas a meses, desde que você armazenar as amostras em um local fresco e com sombra no campo.
2. Uma vez que a amostra está no seu laboratório, soltar a tampa e deixe que cobre o recipiente para reduzir a quantidade de evaporação. Armazenar o recipiente à temperatura ambiente num quarto escuro, gaveta, ou cobrir completamente o recipiente com uma folha de alumínio. Permitir que o sedimento e partículas finas de completamente assentar no fundo do recipiente, deixando a amostra em repouso durante várias horas a vários dias. Não é necessário misturar o sedimento, MTB prefere um ambiente sem ser perturbado. As paredes claras do recipiente de plásticopermitirá que você para confirmar que as partículas foram para o fundo. Dependendo da sua amostra, MTB podem permanecer vivos na amostra por muitos meses.

2. Isolamento MTB

1. Quando estiver pronto para isolar os ímanes MTB, local nos lados do recipiente de plástico a cerca de 1 cm acima da interface sedimento-água (Figura 1A). Ter cuidado para não perturbar o sedimento no fundo do recipiente. Coloque o pólo sul de uma barra magnética de um lado do recipiente e no lado norte de um outro íman em barra no lado oposto (Figura 1A). Quase todo o íman pode ser utilizado, tal como uma barra de agitação magnética ou ima grande. Tudo pode ser utilizado para suportar os ímans à altura correcta acima da interface água-sedimento. Descobrimos que os magnetos descansando sobre a parte superior de uma caixa de papelão ou de plástico é o melhor, no entanto, os ímans podem também ser gravados para o exterior do recipiente de plástico. Espere 30 minutos a várioshoras para as bactérias que nadar para o ímã.
2. Use uma pipeta estéril para recolher a água com cuidado de dentro do recipiente (Figura 1A), perto da posição do ímã de barra sul-pólos (para amostras coletadas no hemisfério Norte). Esta água deve conter o MTB que foram atraídos para o ímã de barra sul-pólo. Em seguida, uma pista de corrida capilar deve ser utilizada para enriquecer ainda mais o MTB.

3. Autódromo de MTB

1. A fim de enriquecer a sua amostra com bactérias magnetotáticas, uma pista de corrida capilar é necessário (Figuras 1B e 1C). Estes necessitam de ser feita antes de isolar as células do recipiente transparente de plástico.
2. Use uma polegada 5,75 (146 mm) de vidro Pasteur pipeta para fazer uma pista de corrida. Use uma caneta de diamante ou arquivo para cortar a parte superior da pipeta, o comprimento da pipeta não é crucial, mas deve ser capaz de conter aproximadamente 1-2 ml de água. Em seguida, utilizar um bico de Bunsen para derreter a ponta de modo a quetorna-se selado (Figura 1C). A pipeta resultante deve ter uma extremidade aberta e uma extremidade fechada.
3. Fazer várias dessas pistas e, em seguida, autoclave. Além disso, você terá de autoclave algodão e várias agulhas de metal longos.
4. Adicionar água de amostra filtrada, recolhida a partir de perto da interface água-sedimento mostrado na Figura 1A, com uma pista de corrida autoclavado utilizando uma agulha de metal longa ligado a uma seringa filtrada. O tamanho dos poros do filtro deve ser 0,22 milímetros para eliminar os detritos e contaminantes da água. É importante ter a certeza absoluta de que não há bolhas de ar no capilar de vidro.
5. Ligue o fundo da pista com algodão estéril (Figura 1B). Utilize a agulha de metal para empurrar o algodão para a extremidade selada da pista de modo que é de 0,5 - 1 cm de distância entre a ponta fechada (Figura 1C).
6. Utilizando uma pipeta estéril, adicionar a água MTB contendo (a partir de Secção 2.2) para a amostra de reservoir (extremidade aberta) de uma pista de corridas de MTB preparada (Figura 1B).

4. Enriquecimento MTB

1. Uma vez que a pista é preenchido com fluido amostra, colocá-lo em seu lado em uma superfície horizontal (por exemplo, uma bancada) e coloque o pólo sul de um ímã de barra (no hemisfério norte) próximo à ponta fechada da pista (Figuras 1B e 1C).
2. Esperar 5 a 30 minutos para o MTB para migrar através do algodão. Então, você deve coletar o líquido perto da ponta da pista. Espera demasiado longa pode introduzir contaminantes, tais como outras bactérias móveis, para a ponta do capilar. Opcionalmente, você pode usar um microscópio de luz para ver a ponta da pista e ver o MTB recolher na ponta da pista do. Isso permitirá que você para determinar quanto tempo leva o MTB para migrar através do tampão de algodão.
3. Gentilmente usar a faca de diamante para fazer um pequeno arranhão perto tampão de algodão e tirar fora o fim da pista.
4. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha fina (25 ou calibre 27), para remover o líquido da ponta da pista. Esta amostra líquida agora deve conter o MTB enriquecido.

5. Observação MTB por microscopia de luz

1. Colocar uma gota (10-20 ul) da amostra de MTB enriquecido para uma lamela.
2. Rapidamente virar a lamela mais para que a queda está agora virada para baixo e pendurado na lamela.
3. Coloque a lamela em um o-ring, que repousa sobre uma lâmina de vidro. O anel de vedação deve ter um diâmetro ligeiramente menor que a lamela (cerca de 1 cm), Figura 2.
4. Coloque essa queda pendurado em um estágio microscópio de luz e foco em uma borda da gota. Um objectivo 60X seco funciona muito bem, porque a maioria tem uma grande abertura numérica (NA; por exemplo, 0,93), mas não necessitam de óleo, o que é difícil de utilizar para o método de gota em suspensão (Figura 2).
5. Coloque a extremidade sul de um ímã de barra próximo ao d penduradorop e MTB começará a migrar em direcção ao bordo de queda mais próximo do íman (Figura 3). Dentro de alguns minutos MTB muitos devem estar na borda da gota (Figura 3). Provar-se que as bactérias são magnéticos, invertendo o pólo do íman e em seguida observar a bactéria nadar na direcção oposta.

6. MTB observação por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

1. Colocar uma gota (~ ul 20) do MTB enriquecido numa grelha de cobre e permitir que as bactérias que se contentar com 10 min.
2. Wick fora o excesso de água com um pedaço de papel de filtro limpo.
3. Opcionalmente, a grade pode ser negativamente coradas com acetato de uranilo a 2%, pH 2% de ácido fosfotúngstico 7,2, ou 2,5% de molibdato de sódio ^{7, 8, 9.} Isto é feito através da colocação da grelha de cobre sobre uma gota de corante, imediatamente após a incubação da grade com o MTB enriquecido. Incubar a grade com a mancha negativa, os tempos podem variar, dependendo da rain utilizado, e, em seguida, para fora da mecha de fluido com um pedaço de papel de filtro limpo.
4. Observe o MTB usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Figura 4). Para o trabalho descrito aqui MTB foram adsorvidos a Formvar estabilizado e revestidos de carbono 200 redes de malha de cobre (Ted Pella # 01800). As grelhas foram colocados com o lado de carbono para baixo sobre uma gota de suspensão de células para um máximo de 10 min, em seguida, imediatamente lavadas uma vez através da colocação da grade em uma gota de água durante 30 segundos. Para a coloração, as grades foram colocados numa gota de acetato de uranilo a 2% (Ted Pella # 19481) durante 30 segundos a 5 minutos, e depois secou-se completamente através de um pedaço de papel de filtro. As grades foram analisadas por MET usando um FEI Espírito Tecnai em 80kV ou FEI Tecnai F20 usando alto ângulo STEM campo escuro anular em 200KV.

Um íman é uma ferramenta eficaz que pode ser usado para isolar as bactérias magnetotáticas (MTB) contidas em amostras ambientais (Figura 1A). A pista de corrida capilar (Figura 1B) utiliza as propriedades magnéticas de MTB de atrair os através de um tampão de algodão, onde eles podem ser separados a partir de microrganismos não-magnetotáticas também contidos na amostra ambiental.

Figura 1. Uma garrafa de plástico transparente contendo uma amostra de sedimento e água coletada do rio Olentangy em Columbus, Ohio (EUA). O frasco contém aproximadamente metade do sedimento e meio de água. A extremidade sul de um magneto é colocado a cerca de 1 cm acima do sedimento por até várias horas (A). Depois de remover algum do fluido a partir de perto do íman no interior do recipiente, ele é colocado no interior de um r capilaracetrack onde o mergulho MTB através de um tampão de algodão (seta) para o fim sul de um ímã de barra (B). A fim acima da vista da pista capilar mostrando a amostra, o algodão, o fluido filtrado, extremidade fechada do tubo capilar e extremidade sul de uma barra magnética (C).

Figura 2. Uma vez que o MTB foram enriquecidas a partir da pista de corrida, uma pequena gota pode ser colocado sobre uma lamela, que é depois virado de cabeça para baixo e colocado sobre um anel de vedação que está apoiado sobre uma lâmina. Esta sanduíche slide-o-ring-lamela pode ser colocado em um estágio de microscópio de luz e visualizado utilizando uma objectiva 60X seco (lentes de petróleo são inconvenientes para usar com uma gota em suspensão).

Figura 3. Imagem do microscópio brilhante campo da natação MTB (finasetas longas) e reunir à beira da gota em suspensão (setas curtas), que é próxima ao pólo sul de um ímã de barra.

Figura 4. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de uma bactéria magnetotáticos único enriquecido a partir de uma amostra de sedimento ambiental. A morfologia da célula (spirillum) e magnetossomos são claramente visíveis, juntamente com um único flagelo.

Bactérias magnetotáticas não são necessariamente encontrados em cada ambiente aquático ^8, mas quando elas ocorrem, eles podem ser encontrados na ordem de 100 - 1000 células por mililitro ^2. A fim de observar o MTB microscopia óptica, você vai precisar de cerca de 50 bactérias / ml em sua amostra ^8. Se não houver nenhum ou poucos MTB em sua amostra, então você precisa selecionar um novo site ambiental para coletar suas amostras ou você terá de tentar uma ou mais das técnicas discutidas na próxima seção.

Primeiro, você deve tentar recolher mais sedimentos do ambiente usando uma grande banheira de plástico ^8. Isto é especialmente útil se um grande número de MTB unculturable são necessários. Dependendo da amostra ambiental, pode não ser possível isolar amostras de MTB tendo uma concentração de 50 bactérias / ml, imediatamente após a recolha da amostra. Portanto, quando você traz sua amostra ambiental volta à laboratory, pode ser benéfico para aguardar a amostra para se aclimatarem às condições laboratoriais antes de tentar isolar o MTB usando uma barra magnética. Este período de aclimatação permitirá que a comunidade bacteriana para amadurecer e repovoar a cultura levando a maiores concentrações de MTB. Outra técnica simples, que muitas vezes produz amostras de MTB mais concentrados é a de deixar o íman em barra no lado do recipiente da amostra (Figura 1A), por um período mais longo de tempo (por exemplo, durante vários dias). Isto deve permitir que o tempo de MTB mais a migrar para o íman. Uma técnica final que pode ser útil, é a utilização de várias pistas (Figura 1B) de uma só vez e, em seguida, combinam o MTB de cada pista de corrida numa única amostra. Se você acredita que há um problema com uma pista de corrida ou se há muitos microrganismos contaminantes (isto é, não-MTB) em sua amostra enriquecida, você pode colocar a pista sob um microscópio de luz para observar o MTB como eles nadam através do plu algodãog e para dentro da ponta. Isso permitirá que você para determinar se microrganismos contaminantes também estão vindo através do tampão de algodão e quando parar o processo de enriquecimento.

Devemos mencionar que existem formas mais sofisticadas para isolar MTB, mas estes métodos requerem o uso de equipamentos mais especializados. Um exemplo envolve a utilização de uma bobina magnética, em vez de uma barra magnética, e os vasos de vidro personalizados para isolar MTB de sedimentos de água doce ^{10, 11.} O protocolo aqui descrito representa um método barato e eficaz para determinar se um sítio ambiental contém MTB. Este protocolo de isolamento e enriquecimento é suficientemente simples para que os estudantes podem dominar microbiologia e facilmente "sintonia fina", de modo que os rendimentos mais elevados de MTB pode ser alcançado. Uma vez que o MTB foram isolados, a análise de outros, tais como hibridação in situ de fluorescência, 16S rRNA para sequenciação espectroscopia dispersiva análise comunidade, a energia (EDS), TEM, microscopia ópticae medições magnéticas podem ser conduzidos sobre o MTB ^{12, 13, 14.}

Não há conflitos de interesse declarados.

Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation EUA (EAR-0920299 e 0745808-EAR); National Science Foundation EUA Leste Asiático e Pacífico Verão Institutos, a Sociedade Geológica da América Programa Bolsa Pesquisa e os Subsídios para Pesquisa de Pós-Graduação Alumni e Bolsa da Universidade Estadual de Ohio. Gostaríamos de agradecer ao editor e dois revisores anônimos por seus comentários perspicazes.