Collecte, l'isolement et l'enrichissement des bactéries présentes naturellement magnétotactique de l'Environnement

Nous démontrons une méthode pour recueillir les bactéries magnétotactiques Tout Terrain (VTT) qui peuvent être appliquées dans les eaux naturelles. VTT peuvent être isolées et enrichies à partir des échantillons de sédiments à l'aide d'une configuration relativement simple qui tire parti du magnétisme de la bactérie naturelle. VTT isolé peut ensuite être examiné en détail en utilisant à la fois la lumière et la microscopie électronique.

Bactéries magnétotactique Tout Terrain (VTT) sont des micro-organismes aquatiques qui ont d'abord été décrits notamment en 1975 ¹ à partir d'échantillons de sédiments prélevés dans les marais salants de Massachusetts (USA). Depuis VTT ont été découverts dans l'eau et stratifiés sédiments colonnes de partout dans le monde ^2. Une caractéristique commune à tous les VTT, c'est qu'ils contiennent magnétosomes, qui sont intracellulaires, nanocristaux liée à la membrane magnétique de la magnétite (Fe ₃ O ₄₎ et / ou greigite (Fe ₃ S ₄₎ ou les deux ^{3, 4.} Dans l'hémisphère Nord, VTT sont généralement attirés vers l'extrémité sud d'un aimant, tandis que dans l'hémisphère sud, ils sont généralement attirés vers l'extrémité nord d'un aimant ^3,5. Cette propriété peut être exploitée lors de la tentative d'isoler VTT à partir d'échantillons environnementaux.

Une des façons les plus courantes pour enrichir VTT est d'utiliser un récipient en plastique transparent pour collecter des sédiments et de l'eau d'une source naturelle,comme un bassin d'eau douce. Dans l'hémisphère Nord, l'extrémité sud d'un aimant est placé sur le côté extérieur du récipient juste au-dessus du sédiment à l'interface eau-sédiments. Après un certain temps, la bactérie peut être retiré de l'intérieur du récipient à proximité de l'aimant à la pipette et ensuite enrichie en outre par l'utilisation d'un circuit capillaire ⁶ et un aimant. Une fois enrichi, les bactéries peuvent être placées sur une lame de microscope en utilisant une méthode de la goutte suspendue et observées dans un microscope optique ou déposée sur une grille de cuivre et observées par microscopie électronique à transmission (MET).

En utilisant cette méthode, isolé VTT peuvent être étudiées au microscope pour déterminer des caractéristiques telles que le comportement natatoire, le type et le numéro de la morphologie cellulaire flagelles, des cellules, la forme des cristaux magnétiques, le nombre de magnétosomes, le nombre de chaînes magnétosome dans chaque cellule, la composition de les cristaux nanomineral, et la présence de vacuoles intracellulaires.

1. VTT Collection

1. Au moment de décider sur un site d'eau douce pour recueillir des bactéries magnétotactiques (VTT), il est souvent préférable de commencer avec un étang ou à rotation lente cours d'eau qui a une couche de sédiments meubles boueux. Dans cette démonstration, nous avons recueilli un échantillon au bord de la rivière d'Olentangy sur le campus de l'Ohio State University (OSU) à Columbus, dans l'Ohio (États-Unis). Bien que ce fut un emplacement idéal pour notre démonstration, le protocole décrit ici est applicable à n'importe quel endroit aquatique. Les matériaux utilisés dans ce protocole peuvent être trouvés dans le tableau 1. Trouver un endroit où la profondeur de l'eau est comprise entre 10 et 100 cm. À un tel endroit, vous devriez recueillir la couche supérieure de sédiments plus en utilisant un clair vis-top conteneur. Écoper l'eau et des sédiments dans le récipient jusqu'à ce qu'il soit rempli d'un tiers à la moitié des sédiments et le volume restant d'eau. Conserver le récipient immergé jusqu'à ce qu'il soit rempli d'eau, puis bien boucher le récipient wvec son vis-top couvercle. Il n'est pas nécessaire de mélanger le sédiment. Essuyez l'extérieur du récipient avec une serviette, puis prendre l'échantillon de votre laboratoire. Il n'est pas nécessaire de se précipiter l'échantillon au laboratoire. Nous avons laissé les échantillons VTT dans des récipients en plastique dans le domaine pendant plusieurs jours avant de les ramener à notre laboratoire. Le VTT doit être viable pendant plusieurs semaines à plusieurs mois, tant que vous stocker les échantillons dans un endroit frais et ombragé dans le domaine.
2. Une fois que l'échantillon est dans votre laboratoire, desserrer le bouchon et laisser couvrant le récipient afin de réduire la quantité d'évaporation. Entreposer le contenant à la température ambiante dans une pièce sombre, un tiroir, ou couvrir complètement le récipient avec du papier d'aluminium. Laissez les sédiments et les particules fines de complètement se déposent au fond du récipient en laissant l'échantillon reposer pendant plusieurs heures à plusieurs jours. Il n'est pas nécessaire de mélanger le sédiment, VTT préfèrent un environnement intact. Les parois claires du récipient en matière plastiquevous permettra de confirmer que les particules se sont installés au fond. En fonction de votre échantillon, VTT peuvent rester vivantes dans l'échantillon pendant de nombreux mois.

2. Isolation VTT

1. Lorsque vous êtes prêt à isoler les aimants VTT lieu, sur les côtés du conteneur en plastique d'environ 1 cm au-dessus de l'interface eau-sédiments (figure 1A). Attention à ne pas perturber les sédiments dans le fond du récipient. Placer le pôle sud d'un aimant sur ​​un côté du récipient et du côté nord d'un autre aimant sur ​​le côté opposé (figure 1A). Presque n'importe quel aimant peut être utilisé comme un agitateur magnétique ou aimant de réfrigérateur grande. Tout peut être utilisé pour soutenir les aimants à la bonne hauteur au-dessus de l'interface eau-sédiment. Nous avons constaté que les aimants se reposer sur le dessus d'un carton ou une boîte en plastique est la meilleure, cependant, les aimants peuvent aussi être enregistrées à l'extérieur du récipient en plastique. Attendre 30 minutes à plusieursheures pour les bactéries de se baigner à l'aimant.
2. Utiliser une pipette stérile pour recueillir soigneusement l'eau à l'intérieur du conteneur (figure 1A) près de la position de l'aimant sud-pôle (pour les échantillons prélevés dans l'hémisphère Nord). Cette eau doit contenir le MTB qui ont été attirés par l'aimant sud-pôle. Ensuite, une piste de course capillaire doit être utilisé pour enrichir le VTT.

3. VTT Racetrack

1. Afin d'enrichir votre échantillon de bactéries magnétotactiques, une piste de course capillaire est nécessaire (figures 1B et 1C). Celles-ci doivent être faites avant d'isoler les cellules du récipient plastique transparent.
2. Utilisez un pouce 5,75 (146 mm) pipette Pasteur en verre pour faire une piste de course. Utilisez un stylo ou un fichier de diamant pour couper le haut de la pipette, la longueur de la pipette n'est pas crucial, mais il devrait être en mesure de contenir environ 1-2 ml d'eau. Ensuite, utilisez un brûleur Bunsen pour faire fondre la pointe de sorte queil devient étanche (Figure 1C). La pipette résultant doit avoir une extrémité ouverte et une extrémité fermée.
3. Faites plusieurs de ces hippodromes, puis autoclave. En outre, vous aurez besoin de passer à l'autoclave coton et plusieurs aiguilles métalliques longues.
4. Ajouter de l'eau filtrée échantillon, recueilli à partir de l'eau à proximité de l'interface sédiment représenté sur la figure 1A, un circuit à l'aide d'un autoclave métallique de grande longueur d'aiguille montée sur une seringue filtré. La taille des pores du filtre doit être de 0,22 mm pour éliminer les débris et les contaminants de l'eau. Il est important d'être absolument sûr qu'il n'y ait pas de bulles d'air dans le capillaire en verre.
5. Branchez le bas de la piste avec du coton stérile (figure 1B). Utiliser l'aiguille métallique pour pousser le coton vers l'extrémité fermée de la piste de sorte qu'il est de 0,5 à 1 cm de distance de l'extrémité fermée (figure 1C).
6. En utilisant une pipette stérile, ajouter de l'eau contenant du VTT (section 2.2) à l'échantillon reservoir (extrémité ouverte) d'un circuit VTT préparée (figure 1B).

4. Enrichissement VTT

1. Une fois que le circuit est rempli de liquide échantillon, posez-le sur le côté sur une surface horizontale (par exemple, une table) et placez le pôle sud d'un aimant (dans l'hémisphère Nord) à côté de la pointe scellée du circuit (figures 1B et 1C).
2. Attendre 5 à 30 min pour le VTT de migrer à travers le coton. Ensuite, vous devez recueillir le liquide près de l'extrémité de la piste. Attendre trop longtemps peut introduire des contaminants, comme d'autres bactéries mobiles, à la pointe du capillaire. En option, vous pouvez utiliser un microscope optique pour voir le bout de la piste de course et regarder le VTT à frais virés au bout de la piste. Cela vous permettra de déterminer combien de temps il prend le VTT à migrer à travers le bouchon de coton.
3. Doucement utiliser le couteau de diamant pour faire une petite égratignure près de bouchon de coton et casser l'extrémité de la piste.
4. Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille étroite (25 ou 27 gauge) pour retirer le fluide de la pointe de l'hippodrome. Cet échantillon liquide doit maintenant contenir le VTT enrichi.

5. Observation VTT par microscopie optique

1. Déposer une goutte (10-20 pi) de l'échantillon enrichi VTT sur une lamelle.
2. Parcourir rapidement la lamelle sur la goutte est donc désormais vers le bas et suspendu à la lamelle.
3. Placer la lamelle couvre-objet sur un joint torique qui est en appui sur une lame de verre. Le joint torique doit avoir un diamètre légèrement plus petit que la lamelle (environ 1 cm, figure 2).
4. Placez cette goutte suspendue sur une scène microscope optique et de se concentrer sur un bord de la goutte. Un objectif 60X sec fonctionne très bien parce que la plupart ont une grande ouverture numérique (NA, par exemple, 0,93) mais ne nécessitent pas d'huile, ce qui est difficile à utiliser pour la méthode de la goutte suspendue (figure 2).
5. Placez l'extrémité sud d'une étroite barre aimantée à la pendaison drop et VTT commence à se déplacer vers le bord de la goutte la plus proche de l'aimant (figure 3). En quelques minutes, VTT nombre devrait être au bord de la goutte (figure 3). Prouvez-vous que les bactéries sont magnétiques en inversant le pôle de l'aimant, puis d'observer les bactéries se baigner dans la direction opposée.

6. Observation VTT par microscopie électronique à transmission (MET)

1. Déposer une goutte (~ 20 pi) du VTT enrichi sur une grille de cuivre et de permettre aux bactéries de s'installer pendant 10 min.
2. Évacuent l'excès d'eau avec un morceau de papier filtre propre.
3. Éventuellement, la grille peut être négativement colorées avec de l'acétate d'uranyle 2%, 2% pH 7,2 acide phosphotungstique ou de sodium 2,5% de molybdate ^{7, 8, 9.} Ceci est fait en plaçant la grille de cuivre sur une goutte de colorant immédiatement après l'incubation de la grille avec le VTT enrichi. Incuber la grille avec la tache négative, les heures peuvent varier selon le stain utilisé, puis évacuent le liquide avec un morceau de papier filtre propre.
4. Observez le VTT par microscopie électronique à transmission (MET, figure 4). Pour les travaux décrits ici ont été adsorbées VTT Formvar stabilisé et revêtues de carbone 200 mailles des grilles de cuivre (Ted Pella # 01800). Les grilles ont été placées avec le côté de carbone sur une goutte de suspension cellulaire pour un maximum de 10 minutes, puis immédiatement lavés une fois en plaçant la grille sur une goutte d'eau pendant 30 secondes. Pour la coloration, les grilles ont été placés sur une baisse de l'acétate d'uranyle 2% (Ted Pella # 19481) pour 30 secondes à 5 minutes, puis séché complètement à l'aide d'un morceau de papier filtre. Les grilles ont été analysés par MET en utilisant soit une FEI 80kV Tecnai Esprit à la FEI ou d'un Tecnai F20 angle à haute tige annulaire champ sombre à 200kV.

Un aimant est un outil efficace qui peut être utilisé pour isoler des bactéries magnétotactiques (MTB) contenues dans des échantillons de l'environnement (Figure 1A). Un circuit capillaire (figure 1B) utilise les propriétés magnétiques des VTT pour les attirer à travers un tampon de coton où ils peuvent être séparés des non-magnétotactiques micro-organismes aussi contenu dans l'échantillon de l'environnement.

Figure 1. Une bouteille en plastique transparent contenant un échantillon de sédiment et de l'eau prélevés dans la rivière d'Olentangy à Columbus, dans l'Ohio (États-Unis). La bouteille contient environ la moitié des sédiments et de la moitié de l'eau. L'extrémité sud d'un aimant est placé à environ 1 cm au-dessus du sédiment pendant plusieurs heures (A). Après avoir retiré une partie du fluide à proximité de l'aimant à l'intérieur du récipient, il est placé à l'intérieur d'un capillaire racetrack où la baignade VTT à travers un bouchon de coton (flèche) en direction de l'extrémité sud d'un aimant (B). Une vue de près de l'hippodrome capillaire montrant l'exemple, le coton, le liquide filtré, extrémité fermée du tube capillaire et l'extrémité sud d'un aimant (C).

Figure 2. Une fois le MTB ont été enrichies de la piste, une petite goutte peut être placée sur une lamelle couvre-objet, qui est ensuite retourné à l'envers et placé sur un joint torique qui est en appui sur une lame. Ce sandwich slide-o-ring-lamelle peut être placé sur une platine de microscope lumière et visualisées à l'aide d'un objectif 60X sec (lentilles de pétrole ne sont pas pratiques à utiliser avec une goutte suspendue).

Figure 3. Lumineux image au microscope domaine de la natation VTT (mincelongues flèches) et de la cueillette au bord de la goutte suspendue (flèches courtes) qui est à côté du pôle sud d'un aimant.

Figure 4. Image au microscope électronique à transmission d'une bactérie magnétotactiques unique enrichie d'un échantillon de sédiment de l'environnement. La morphologie de la cellule (spirilles) et magnétosomes sont clairement visibles avec un seul flagelle.

Magnétotactique bactéries ne sont pas nécessairement dans tous les milieux aquatiques ^8, mais quand ils surviennent, ils peuvent être consultés sur l'ordre de 100 - 1.000 cellules par millilitre ^2. Afin d'observer le VTT en utilisant la microscopie optique, vous aurez besoin d'environ 50 bactéries / ml dans l'échantillon ^8. S'il n'y a pas ou peu de VTT dans votre échantillon, alors vous devrez soit choisir un nouveau site de l'environnement de collecter vos échantillons ou vous aurez besoin d'essayer une ou plusieurs des techniques décrites dans la section suivante.

Tout d'abord, vous devriez essayer de recueillir plus de sédiments dans l'environnement en utilisant une grande baignoire en plastique ^8. Ceci est particulièrement utile si un grand nombre de VTT non cultivables sont nécessaires. Selon l'échantillon de l'environnement, il peut ne pas être possible d'isoler des échantillons de VTT ayant une concentration de 50 bactéries / ml immédiatement après le prélèvement. Par conséquent, lorsque vous apportez votre échantillon environnemental revenir à la laboratory, il peut être avantageux d'attendre l'échantillon à acclimater aux conditions de laboratoire avant d'essayer d'isoler le VTT à l'aide d'un barreau aimanté. Cette période d'acclimatation permettra à la communauté bactérienne à mûrir et à repeupler la culture conduisant à des concentrations plus élevées de VTT. Une autre technique simple qui produit souvent des échantillons plus concentrés VTT est de laisser l'aimant sur ​​le côté du récipient à échantillon (figure 1A) pour une plus longue période de temps (par exemple, plusieurs jours). Cela devrait permettre à la fois de VTT plus à migrer vers l'aimant. Une dernière technique qui peut être utile, est d'utiliser plusieurs circuits (figure 1B) à la fois, puis de combiner le VTT de chaque piste en un seul échantillon. Si vous croyez qu'il ya un problème avec une piste de course ou si il ya trop de micro-organismes contaminants (c.-à-VTT) dans votre échantillon enrichi, vous pouvez placer le circuit sous un microscope optique pour observer le VTT comme ils nagent à travers le PLU cotong et dans la pointe. Cela vous permettra de déterminer si la contamination microbienne sont également à venir à travers le bouchon de coton et quand arrêter le processus d'enrichissement.

Il convient de mentionner qu'il existe des moyens plus sophistiqués pour isoler VTT, mais ces méthodes nécessitent l'utilisation d'équipements plus spécialisés. Un exemple concerne l'utilisation d'une bobine magnétique, au lieu d'une barre aimantée, et des récipients en verre sur mesure pour isoler VTT de ^{10, 11} sédiments d'eau douce. Le protocole décrit ici représente une méthode peu coûteuse et efficace pour déterminer si un site contient de l'environnement VTT. Cet isolement et protocole d'enrichissement est assez simple que les élèves peuvent maîtriser microbiologie et facilement "fine-tune" de telle sorte que des rendements plus élevés de VTT peut être atteint. Une fois que le VTT ont été isolés, d'autres analyses telles que la fluorescence in situ hybridation, ARNr 16S séquençage pour l'analyse des communautés, la spectroscopie à dispersion d'énergie (EDS), TEM, la microscopie optiqueet des mesures magnétiques peuvent être réalisées sur le VTT ^{12, 13, 14.}

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation américaine (AER-0920299-0745808 et EAR); US National Science Foundation Asie de l'Est et du Pacifique Instituts d'été; la Geological Society of America Research Grant Programme et les subventions pour la recherche des anciens diplômés et les bourses de l'Ohio State University. Nous tenons à remercier le rédacteur en chef et deux relecteurs anonymes pour leurs commentaires perspicaces.