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Nous démontrons une méthode pour recueillir les bactéries magnétotactiques Tout Terrain (VTT) qui peuvent être appliquées dans les eaux naturelles. VTT peuvent être isolées et enrichies à partir des échantillons de sédiments à l'aide d'une configuration relativement simple qui tire parti du magnétisme de la bactérie naturelle. VTT isolé peut ensuite être examiné en détail en utilisant à la fois la lumière et la microscopie électronique.
Bactéries magnétotactique Tout Terrain (VTT) sont des micro-organismes aquatiques qui ont d'abord été décrits notamment en 1975 1 à partir d'échantillons de sédiments prélevés dans les marais salants de Massachusetts (USA). Depuis VTT ont été découverts dans l'eau et stratifiés sédiments colonnes de partout dans le monde 2. Une caractéristique commune à tous les VTT, c'est qu'ils contiennent magnétosomes, qui sont intracellulaires, nanocristaux liée à la membrane magnétique de la magnétite (Fe 3 O 4) et / ou greigite (Fe 3 S 4) ou les deux 3, 4. Dans l'hémisphère Nord, VTT sont généralement attirés vers l'extrémité sud d'un aimant, tandis que dans l'hémisphère sud, ils sont généralement attirés vers l'extrémité nord d'un aimant 3,5. Cette propriété peut être exploitée lors de la tentative d'isoler VTT à partir d'échantillons environnementaux.
Une des façons les plus courantes pour enrichir VTT est d'utiliser un récipient en plastique transparent pour collecter des sédiments et de l'eau d'une source naturelle,comme un bassin d'eau douce. Dans l'hémisphère Nord, l'extrémité sud d'un aimant est placé sur le côté extérieur du récipient juste au-dessus du sédiment à l'interface eau-sédiments. Après un certain temps, la bactérie peut être retiré de l'intérieur du récipient à proximité de l'aimant à la pipette et ensuite enrichie en outre par l'utilisation d'un circuit capillaire 6 et un aimant. Une fois enrichi, les bactéries peuvent être placées sur une lame de microscope en utilisant une méthode de la goutte suspendue et observées dans un microscope optique ou déposée sur une grille de cuivre et observées par microscopie électronique à transmission (MET).
En utilisant cette méthode, isolé VTT peuvent être étudiées au microscope pour déterminer des caractéristiques telles que le comportement natatoire, le type et le numéro de la morphologie cellulaire flagelles, des cellules, la forme des cristaux magnétiques, le nombre de magnétosomes, le nombre de chaînes magnétosome dans chaque cellule, la composition de les cristaux nanomineral, et la présence de vacuoles intracellulaires.
1. VTT Collection
2. Isolation VTT
3. VTT Racetrack
4. Enrichissement VTT
5. Observation VTT par microscopie optique
6. Observation VTT par microscopie électronique à transmission (MET)
Un aimant est un outil efficace qui peut être utilisé pour isoler des bactéries magnétotactiques (MTB) contenues dans des échantillons de l'environnement (Figure 1A). Un circuit capillaire (figure 1B) utilise les propriétés magnétiques des VTT pour les attirer à travers un tampon de coton où ils peuvent être séparés des non-magnétotactiques micro-organismes aussi contenu dans l'échantillon de l'environnement.
Figure 1. Une bouteille en plastique transparent contenant un échantillon de sédiment et de l'eau prélevés dans la rivière d'Olentangy à Columbus, dans l'Ohio (États-Unis). La bouteille contient environ la moitié des sédiments et de la moitié de l'eau. L'extrémité sud d'un aimant est placé à environ 1 cm au-dessus du sédiment pendant plusieurs heures (A). Après avoir retiré une partie du fluide à proximité de l'aimant à l'intérieur du récipient, il est placé à l'intérieur d'un capillaire racetrack où la baignade VTT à travers un bouchon de coton (flèche) en direction de l'extrémité sud d'un aimant (B). Une vue de près de l'hippodrome capillaire montrant l'exemple, le coton, le liquide filtré, extrémité fermée du tube capillaire et l'extrémité sud d'un aimant (C).
Figure 2. Une fois le MTB ont été enrichies de la piste, une petite goutte peut être placée sur une lamelle couvre-objet, qui est ensuite retourné à l'envers et placé sur un joint torique qui est en appui sur une lame. Ce sandwich slide-o-ring-lamelle peut être placé sur une platine de microscope lumière et visualisées à l'aide d'un objectif 60X sec (lentilles de pétrole ne sont pas pratiques à utiliser avec une goutte suspendue).
Figure 3. Lumineux image au microscope domaine de la natation VTT (mincelongues flèches) et de la cueillette au bord de la goutte suspendue (flèches courtes) qui est à côté du pôle sud d'un aimant.
Figure 4. Image au microscope électronique à transmission d'une bactérie magnétotactiques unique enrichie d'un échantillon de sédiment de l'environnement. La morphologie de la cellule (spirilles) et magnétosomes sont clairement visibles avec un seul flagelle.
Magnétotactique bactéries ne sont pas nécessairement dans tous les milieux aquatiques 8, mais quand ils surviennent, ils peuvent être consultés sur l'ordre de 100 - 1.000 cellules par millilitre 2. Afin d'observer le VTT en utilisant la microscopie optique, vous aurez besoin d'environ 50 bactéries / ml dans l'échantillon 8. S'il n'y a pas ou peu de VTT dans votre échantillon, alors vous devrez soit choisir un nouveau site de l'environnement de collecter vos échantillons ou vous aurez besoin d'essayer une ou plusieurs des techniques décrites dans la section suivante.
Tout d'abord, vous devriez essayer de recueillir plus de sédiments dans l'environnement en utilisant une grande baignoire en plastique 8. Ceci est particulièrement utile si un grand nombre de VTT non cultivables sont nécessaires. Selon l'échantillon de l'environnement, il peut ne pas être possible d'isoler des échantillons de VTT ayant une concentration de 50 bactéries / ml immédiatement après le prélèvement. Par conséquent, lorsque vous apportez votre échantillon environnemental revenir à la laboratory, il peut être avantageux d'attendre l'échantillon à acclimater aux conditions de laboratoire avant d'essayer d'isoler le VTT à l'aide d'un barreau aimanté. Cette période d'acclimatation permettra à la communauté bactérienne à mûrir et à repeupler la culture conduisant à des concentrations plus élevées de VTT. Une autre technique simple qui produit souvent des échantillons plus concentrés VTT est de laisser l'aimant sur le côté du récipient à échantillon (figure 1A) pour une plus longue période de temps (par exemple, plusieurs jours). Cela devrait permettre à la fois de VTT plus à migrer vers l'aimant. Une dernière technique qui peut être utile, est d'utiliser plusieurs circuits (figure 1B) à la fois, puis de combiner le VTT de chaque piste en un seul échantillon. Si vous croyez qu'il ya un problème avec une piste de course ou si il ya trop de micro-organismes contaminants (c.-à-VTT) dans votre échantillon enrichi, vous pouvez placer le circuit sous un microscope optique pour observer le VTT comme ils nagent à travers le PLU cotong et dans la pointe. Cela vous permettra de déterminer si la contamination microbienne sont également à venir à travers le bouchon de coton et quand arrêter le processus d'enrichissement.
Il convient de mentionner qu'il existe des moyens plus sophistiqués pour isoler VTT, mais ces méthodes nécessitent l'utilisation d'équipements plus spécialisés. Un exemple concerne l'utilisation d'une bobine magnétique, au lieu d'une barre aimantée, et des récipients en verre sur mesure pour isoler VTT de 10, 11 sédiments d'eau douce. Le protocole décrit ici représente une méthode peu coûteuse et efficace pour déterminer si un site contient de l'environnement VTT. Cet isolement et protocole d'enrichissement est assez simple que les élèves peuvent maîtriser microbiologie et facilement "fine-tune" de telle sorte que des rendements plus élevés de VTT peut être atteint. Une fois que le VTT ont été isolés, d'autres analyses telles que la fluorescence in situ hybridation, ARNr 16S séquençage pour l'analyse des communautés, la spectroscopie à dispersion d'énergie (EDS), TEM, la microscopie optiqueet des mesures magnétiques peuvent être réalisées sur le VTT 12, 13, 14.
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation américaine (AER-0920299-0745808 et EAR); US National Science Foundation Asie de l'Est et du Pacifique Instituts d'été; la Geological Society of America Research Grant Programme et les subventions pour la recherche des anciens diplômés et les bourses de l'Ohio State University. Nous tenons à remercier le rédacteur en chef et deux relecteurs anonymes pour leurs commentaires perspicaces.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom d'article | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
Lames de verre | Fisher Scientific | S95933 | |
Verre Pipettes Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
O-ring | Droguerie | ||
Lamelles | Fisher Scientific | 12-542B | |
Barre aimantée | Fisher Scientific | S95957 | |
Conteneur | Tout | Toute plastic ou récipient en verre qui peut contenir au moins 0,5 L et peuvent être scellés | |
Coton | Tout | ||
Microscope avec objectif à sec 60X | Zeiss | Une lentille 60X sec n'est pas absolument nécessaire, mais cela donne une grande NA sans huile | |
Diamant stylo | Fisher Scientific | 08-675 | |
Filtre de 0,22 mm | Fisher Scientific | 09-719C | |
Seringue de 1 ml | Fisher Scientific | NC9788564 | |
Microtubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
Formvar / Carbone200 mesh, des grilles de cuivre | Ted Pella Inc | 01800 | |
L'acétate d'uranyle | Ted Pella Inc | 19481 | |
Tecnai Esprit TEM | FEI | ||
Tecnai F20 S / TEM | FEI |
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