Recolección, aislamiento y enriquecimiento de bacterias naturales magnetotácticas del Medio Ambiente

Se demuestra un método para recoger las bacterias magnetotácticas (MTB) que se pueden aplicar para aguas naturales. MTB puede ser aislado y enriquecido a partir de muestras de sedimento utilizando una configuración relativamente simple que toma ventaja de magnetismo de la bacteria natural. Aislado MTB pueden examinarse en detalle utilizando la luz y microscopía electrónica.

Bacterias magnetotácticas (MTB) son microorganismos acuáticos que fueron los primeros en particular descritos en 1975 ¹ a partir de muestras de sedimento recolectadas en las marismas de Massachusetts (EE.UU.). Desde entonces se han descubierto MTB en estratificado de agua y sedimentos columnas-de todo el mundo ^2. Una característica común a todos MTB es que contienen magnetosomas, que son nanocristales intracelulares, unido a la membrana magnéticas de magnetita (Fe ₃ O ₄₎ y / o greigita (Fe ₃ S ₄₎ ³ o ^{ambos, 4.} En el hemisferio Norte, MTB suelen ser atraídos por el extremo sur de un imán de barra, mientras que en el hemisferio sur, por lo general son atraídos por el extremo norte de un imán de ^3,5. Esta propiedad puede aprovecharse cuando se trata de aislar MTB partir de muestras ambientales.

Una de las formas más comunes para enriquecer MTB es usar un recipiente de plástico transparente para recoger sedimentos y agua de una fuente natural,tal como un estanque de agua dulce. En el hemisferio norte, el extremo sur de un imán de barra se coloca contra la parte exterior del contenedor justo por encima del sedimento en la interfase agua-sedimento. Después de algún tiempo, la bacteria puede ser retirada desde el interior del recipiente cerca del imán con una pipeta y luego enriquecido aún más mediante el uso de una pista de carreras capilar ⁶ y un imán. Una vez enriquecido, las bacterias se pueden colocar en un portaobjetos de microscopio utilizando un método de la gota colgante y se observaron en un microscopio de luz o se depositan sobre una rejilla de cobre y se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Usando este método, aislado MTB se puede estudiar al microscopio para determinar características tales como el comportamiento natatorio, tipo y número de flagelos morfología celular, de las células, la forma de los cristales magnéticos, número de magnetosomas, el número de cadenas de magnetosoma en cada célula, la composición de los cristales nanomineral, y la presencia de vacuolas intracelulares.

1. MTB Collection

1. Al decidir sobre un sitio de agua dulce para recoger las bacterias magnetotácticas (MTB), a menudo es mejor comenzar con un estanque o arroyo de movimiento lento que tiene una capa suave sedimento fangoso. En esta demostración hemos recogido una muestra en el borde del río Olentangy en el campus de la Ohio State University (OSU), en Columbus, Ohio (EE.UU.). Mientras que esto era una ubicación conveniente para nuestra demostración, el protocolo aquí descrito es aplicable a cualquier ubicación acuático. Los materiales utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla 1. Encontrar un lugar donde la profundidad del agua es de entre 10 y 100 cm. En tal situación, deberá recoger la capa superior, la mayoría de los sedimentos con un claro, con tapa de rosca contenedor. Sacar el sedimento y el agua en el recipiente hasta que se llena con un tercio a la mitad de los sedimentos y el volumen restante con agua. Mantener el envase sumergido hasta que se llena con agua y luego con fuerza tapar el recipiente with su tapa con tapa de rosca. No es necesario mezclar el sedimento. Limpie el exterior del recipiente en lugar seco con una toalla y luego tomar la muestra al laboratorio. No es necesario correr la muestra de nuevo a su laboratorio. Hemos dejado muestras de BTT en contenedores de plástico en el campo durante varios días antes de traer de vuelta a nuestro laboratorio. El CPTM debe ser viable por varias semanas o meses, siempre y cuando se almacenan las muestras en un lugar fresco y con sombra en el campo.
2. Una vez que la muestra está en su laboratorio, afloje la tapa y se deja que cubre el contenedor para reducir la cantidad de evaporación. Almacenar el contenedor a temperatura ambiente en una habitación oscura, cajón, o cubrir completamente el recipiente con papel de aluminio. Permitir el sedimento y las partículas finas se estabilice completamente a la parte inferior del recipiente, dejando la muestra en reposo durante varias horas a varios días. No es necesario mezclar el sedimento, MTB prefieren un ambiente sin perturbaciones. Las paredes transparentes del recipiente de plásticole permitirá confirmar que las partículas se han depositado en el fondo. Dependiendo de la muestra, MTB pueden permanecer vivos en la muestra durante muchos meses.

2. MTB Aislamiento

1. Cuando esté listo para aislar los imanes, MTB lugar en los lados del recipiente de plástico de aproximadamente 1 cm por encima de la interfase agua-sedimento (Figura 1A). Tener cuidado de no perturbar el sedimento en el fondo del recipiente. Coloque el polo sur de un imán de barra en un lado del recipiente y el lado norte de otro imán de barra en el lado opuesto (Figura 1A). Casi cualquier imán se puede utilizar, tal como una barra de agitación magnética o imán refrigerador grande. Cualquier cosa puede ser utilizado para apoyar los imanes a la altura correcta por encima de la interfaz sedimento-agua. Hemos encontrado que los imanes descansando en la parte superior de una caja de cartón o de plástico es mejor, sin embargo, los imanes También se puede amarrar a la parte exterior del recipiente de plástico. Espere 30 minutos hasta varioshoras para las bacterias para nadar hacia el imán.
2. Utilizar una pipeta estéril para recoger cuidadosamente el agua del interior del recipiente (Figura 1A) cerca de la posición del imán de barra polo sur (para las muestras recogidas en el hemisferio norte). Esta agua debe contener la MTB que han sido atraídos por el imán de barra polo sur. A continuación, una pista de carreras capilar debe ser utilizada para enriquecer aún más la MTB.

3. MTB Hipódromo

1. Con el fin de enriquecer la muestra con bacterias magnetotácticas, una pista de carreras capilar es necesario (Figuras 1B y 1C). Estos tienen que ser hecha antes de aislar las células desde el recipiente de plástico transparente.
2. Utilice un reductor de 5,75 (146 mm) pipeta Pasteur de vidrio para hacer una pista de carreras. Utilice una pluma de diamante o archivo para cortar la parte superior de la pipeta, la longitud de la pipeta no es crucial, pero debe ser capaz de contener aproximadamente 1-2 ml de agua. A continuación, utilice un quemador Bunsen para derretir la punta de modo quese convierte sellado (Figura 1C). La pipeta resultante debe tener un extremo abierto y un extremo cerrado.
3. Hacer varios de estos circuitos y autoclave entonces. Además, tendrá que autoclave algodón y varias agujas de metal largas.
4. Añadir agua filtrada muestra, recogida de agua cerca de la interfaz sedimento se muestra en la Figura 1A, a una pista de carreras autoclave usando una aguja larga de metal unida a una jeringa se filtró. El tamaño de poro del filtro debe ser de 0,22 mm para eliminar los desechos y contaminantes del agua. Es importante estar absolutamente seguro de que no hay burbujas de aire en el capilar de vidrio.
5. Conecte el fondo de la pista de carreras con algodón estéril (Figura 1B). Utilice la aguja de metal para empujar el algodón hacia el extremo sellado de la pista de carreras, así que es 0,5 a 1 cm de distancia de la punta de sellado (Figura 1C).
6. Con una pipeta estéril, añadir el agua que contiene MTB (de la sección 2.2) a la muestra reservoir (extremo abierto) de una pista de carreras de MTB preparada (Figura 1B).

4. MTB Enriquecimiento

1. Una vez que la pista está llena de líquido muestra, yacía de costado en una superficie horizontal (por ejemplo, una mesa de trabajo) y coloque el polo sur de un imán de barra (en el hemisferio norte) al lado de la punta sellada de la pista (Figuras 1B y 1C).
2. Esperar 5 a 30 min para el MTB a migrar a través del algodón. Entonces usted debe recoger el líquido cerca de la punta de la pista. Esperar demasiado tiempo puede introducir contaminantes, tales como otras bacterias móviles, a la punta del capilar. Opcionalmente, se puede utilizar un microscopio de luz para ver la punta de la pista y ver el MTB recoger en la punta de la pista de carreras. Esto le permitirá determinar el tiempo que tarda el MTB a migrar a través del tapón de algodón.
3. Suavemente utilizar el bisturí de diamante para hacer un pequeño rasguño cerca de tapón de algodón y encaje el extremo de la pista.
4. Usar una jeringa de 1 ml con una aguja delgada (25 o calibre 27) para retirar el líquido de la punta de la pista de carreras. Esta muestra de líquido debe contener ahora la MTB enriquecido.

5. Observación MTB por Microscopía de Luz

1. Colocar una gota (10-20 l) de la muestra enriquecida MTB sobre un cubreobjetos.
2. Rápidamente la vuelta al cubreobjetos encima de lo que la caída está ahora mirando hacia abajo y colgando del cubreobjetos.
3. Colocar el cubreobjetos sobre un anillo o-que está descansando sobre un portaobjetos de vidrio. La junta tórica debe tener un diámetro ligeramente más pequeño que el cubreobjetos (alrededor de 1 cm; Figura 2).
4. Colocar esta gota colgante sobre una platina de microscopio de luz y se centran en un borde de la gota. Un objetivo seco 60X funciona muy bien porque la mayoría tienen una gran apertura numérica (NA; por ejemplo, 0,93), pero no requieren aceite, que es difícil de utilizar para el método de la gota colgante (Figura 2).
5. Coloque el extremo sur de un imán de barra cerca de la cortina drop y MTB comenzará a migrar hacia el borde de la gota más cercano al imán (Figura 3). En unos pocos minutos MTB muchos debería estar en el borde de la gota (figura 3). Demuéstrese a sí mismo que las bacterias son magnéticas mediante la inversión del polo del imán y luego observar las bacterias nadan en la dirección opuesta.

6. MTB observación por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

1. Colocar una gota (~ 20 l) de la MTB enriquecido en una rejilla de cobre y permitir que las bacterias que conformarse con 10 min.
2. Wick exceso de agua con un trozo de papel de filtro limpio.
3. Opcionalmente, la rejilla puede ser teñidas negativamente con acetato de uranilo al 2%, 2% pH ácido fosfotúngstico 7,2, o 2,5% de molibdato de sodio ^{7, 8, 9.} Esto se realiza mediante la colocación de la rejilla de cobre sobre una gota de colorante inmediatamente después de la incubación de la cuadrícula con la MTB enriquecido. Incubar la cuadrícula con la tinción negativa, los tiempos pueden variar dependiendo de la stain utilizado y, a continuación mecha el fluido con un trozo de papel de filtro limpio.
4. Observe el MTB utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM, Figura 4). Para el trabajo descrito aquí MTB fueron adsorbidos en Formvar y estabilizado de carbono recubiertos con rejillas de cobre de malla 200 (Ted Pella # 01800). Las rejillas se colocaron con la cara hacia abajo de carbono en una gota de suspensión celular durante hasta 10 min, a continuación, inmediatamente se lava una vez mediante la colocación de la rejilla en una gota de agua durante 30 seg. Para la tinción, las rejillas se colocaron en una gota de acetato de uranilo al 2% (Ted Pella # 19481) durante 30 segundos a 5 minutos y después se secó completamente utilizando un trozo de papel de filtro. Las rejillas fueron analizadas por TEM utilizando un FEI Espíritu Tecnai a 80kV o un F20 FEI Tecnai con alto ángulo de campo oscuro anular STEM en 200kV.

Un imán es una herramienta eficaz que se puede utilizar para aislar las bacterias magnetotácticas (MTB) contenidas en muestras ambientales (Figura 1A). Un circuito capilar (Figura 1B) utiliza las propiedades magnéticas de MTB para atraer a ellos a través de un tapón de algodón en el que se puede separar de no magnetotácticas microorganismos también contenidos dentro de la muestra ambiental.

Figura 1. Una botella de plástico transparente que contiene una muestra de sedimento y agua recogidas del Río Olentangy en Columbus, Ohio (EE.UU.). La botella contiene aproximadamente la mitad de los sedimentos y de agua de una media. El extremo sur de un imán se coloca aproximadamente a 1 cm por encima del sedimento de hasta varias horas (A). Después de retirar parte del líquido desde cerca del imán en el interior del contenedor, se coloca dentro de un capilar racetrack donde la natación MTB a través de un tapón de algodón (flecha) hacia el extremo sur de un imán de barra (B). Una vista de cerca de la pista de carreras capilar que muestra la muestra, el algodón, el líquido filtrado, extremo sellado del tubo capilar y el extremo sur de un imán de barra (C).

Figura 2. Una vez que el MTB se han enriquecido a partir de la pista de carreras, una pequeña gota puede ser colocado en un cubreobjetos, que después se voltea al revés y se coloca en una junta tórica que está descansando en una diapositiva. Este sándwich Slide-O-ring-cubreobjetos puede ser colocado en una platina de microscopio de luz y vistos utilizando un objetivo 60X seco (lentes de aceite no son convenientes para usar con una gota colgante).

Figura 3. Imagen brillante microscopio de campo de la natación MTB (delgadoflechas largas) y la recolección en el borde de la gota colgante (flechas cortas) que está al lado del polo sur de un imán de barra.

Figura 4. Transmisión imagen de microscopio electrónico de una bacteria magnetotácticos solo enriquecido a partir de una muestra de sedimento del medio ambiente. La morfología de la célula (spirillum) y magnetosomas son claramente visibles a lo largo con un solo flagelo.

Magnetotácticas bacterias no se encuentran necesariamente en todos los ambientes acuáticos ^8, pero cuando ocurren, pueden ser encontrados en el orden de 100 - 1.000 células por milímetro ^2. Con el fin de observar el MTB por microscopía óptica, necesitará aproximadamente 50 bacterias / ml en la muestra ^8. Si no hay ninguna o pocas MTB en la muestra, entonces usted tendrá que elegir un nuevo sitio ambiental para recoger sus muestras o usted tendrá que tomar una o varias de las técnicas descritas en la siguiente sección.

En primer lugar, usted debe tratar de reunir más sedimento en el medio ambiente usando un recipiente grande de plástico ^8. Esto es especialmente útil si un gran número de MTB unculturable se necesitan. Dependiendo de la muestra ambiental, no puede ser posible aislar muestras de MTB que tienen una concentración de 50 bacterias / ml inmediatamente después de recoger la muestra. Por lo tanto, al trasladar la muestra ambiental de vuelta a la la-boratory, puede ser beneficioso que esperar a que la muestra para aclimatarse a las condiciones del laboratorio antes de intentar aislar el MTB utilizando un imán de barra. Este período de aclimatación permitirá a la comunidad bacteriana a madurar y repoblar la cultura que lleva a una mayor concentración de MTB. Otra técnica simple que a menudo produce muestras de MTB más concentradas es dejar el imán de barra en el lado del recipiente de muestra (Figura 1A) durante un período de tiempo más largo (por ejemplo, varios días). Esto debería permitir que el tiempo de MTB más a migrar hacia el imán. Una técnica final que puede ser útil, es el uso de pistas de carreras varios (Figura 1B) de una vez y luego combinar la BTT de cada pista de carreras en una muestra. Si usted cree que hay un problema con una pista de carreras o si hay demasiados microorganismos contaminantes (es decir, no-MTB) en la muestra enriquecida, puede colocar la pista bajo un microscopio de luz para observar la BTT, ya que nadar a través de la plu algodóng y en la punta. Esto le permitirá determinar si los microorganismos contaminantes también están llegando a través del tapón de algodón y cuándo detener el proceso de enriquecimiento.

Hay que decir que hay formas más sofisticadas para aislar MTB, pero estos métodos requieren el uso de más equipo especializado. Un ejemplo es el uso de una bobina magnética, en lugar de un imán de barra, y los vasos de vidrio para aislar personalizadas MTB de sedimentos de agua dulce ^{10, 11.} El protocolo descrito aquí representa un método barato y eficaz para determinar si un sitio ambiental contiene MTB. Este aislamiento y enriquecimiento protocolo es bastante claro que los estudiantes de microbiología puede dominar fácilmente y "afinar" para que los mayores rendimientos de MTB se puede lograr. Una vez que el MTB se han aislado, otros análisis tales como fluorescencia de hibridación in situ, 16S rRNA secuenciación para el análisis de la comunidad, la espectroscopia de dispersión de energía (EDS), TEM, microscopía ópticay mediciones magnéticas se puede realizar en el MTB ^{12, 13, 14.}

No hay conflictos de interés declarado.

Este trabajo fue apoyado por becas de los EE.UU. National Science Foundation (EAR-0.920.299 y 0.745.808 EAR); EE.UU. National Science Foundation de Asia Oriental y el Pacífico Institutos de Verano, la Sociedad Geológica de América Programa de Investigación Grant y las Becas Alumni para la Investigación de Posgrado y Becas de la Universidad Estatal de Ohio. Nos gustaría dar las gracias al editor y dos revisores anónimos por sus perspicaces comentarios.