당연히 환경에서 Magnetotactic 박테리아를 발생의 수집, 절연 및 강화

우리는 자연 물에 적용 할 수있는 magnetotactic 박테리아 (MTB)를 수집하는 방법을 보여줍니다. MTB는 고립과 박테리아의 자연 자기의 활용 비교적 간단한 설정을 사용하여 침전 샘플 풍부하게 할 수 있습니다. 절연 MTB 그런 다음 빛과 전자 현미경를 사용하여 자세하게 검토 할 수 있습니다.

Magnetotactic 균 (MTB)는 첫째 특히 메사추세츠 (USA)의 염 습지에서 수집 침전 샘플 1975 ^1에서 설명 된 수중 미생물 있습니다. 이후 MTB는 모두 세계 ² 이상에서 층상 물과 침전물-열에서 발견되었습니다. 모든 MTB에 일반적인 기능들은 세포, 막 바인딩 된 자성 자철광의 nanocrystals (철 ₃ O ₄₎ 및 / 또는 greigite (철 ₃ S ₄₎ 또는 두 가지 모두 ^{3 4아르} magnetosomes를 포함한다는 것입니다. 남반구에서 사람들은 보통 자석 ^3,5의 북쪽 끝 부분에 매력을하는 동안 북반구에서는 MTB는 일반적으로, 바 자석의 남쪽 끝 부분에 매력을 수 있습니다. 환경 샘플에서 MTB를 분리 할 때이 속성을 악용 할 수 있습니다.

MTB를 풍성하게하는 가장 일반적인 방법 중 하나는, 천연 소스에서 침전물과 물을 수집하기 위해 투명한 플라스틱 용기를 사용하는 것입니다담수 연못 등. 북반구에서는, 바 자석의 남쪽 끝 단지 침전물 물 인터페이스에서 침전물 위의 컨테이너의 외부에 대한 배치됩니다. 약간의 시간 후, 박테리아는 피펫으로 자석 근처에있는 컨테이너의 내부에서 제거 할 수 있습니다 다음 모세관 경주 ⁶ 자석을 사용하여 더 값진 경험을했습니다. 일단, 풍부한 박테리아는 매달려 드롭 방법을 사용하여 현미경 슬라이드에 배치 할 수 있으며 가벼운 현미경에서 관찰 또는 구리 그리드에 입금 및 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 관찰했다.

이 방법 사용 절연 MTB는 미세 또한 수영과 같은 특성을 결정하기 위해 연구 될 수 세포, 자기 결정의 모양, magnetosomes 수, 각 셀에 magnetosome 체인의 수의 구성의 flagella, 세포 형태학의 행동 유형과 번호 nanomineral 결정하고, 세포 내 액포의 존재.

1. MTB 수집

1. magnetotactic 박테리아를 수집 할 수있는 담수 사이트 (MTB)에 결정할 때, 그것은 종종 부드러운 진흙 퇴적물 층이있는 연못 또는 느리게 이동 스트림로 시작하는 것이 좋습니다. 이 예제에서 우리는 콜럼버스에있는 오하이오 주립 대학 (OSU), 오하이오 (USA)의 캠퍼스에있는 Olentangy 강의 가장자리에 샘플을 수집했습니다. 이 우리의 데모의 편리한 위치에있을 때, 여기에 설명 된 프로토콜은 수중 위치에 적용됩니다. 이 프로토콜에 사용 된 자료는 표 1에서 찾을 수 있습니다. 물 깊이는 10 100cm 사이의 위치를​​ 찾습니다. 같은 장소에서, 당신은 침전 명확한, 스크류 탑 컨테이너를 사용하는 페이지의 상단에있는 레이어를 수집해야합니다. 이 한 절반 삼분의 침전 물과 남은 볼륨이 가득 될 때까지 컨테이너에 침전물과 물을 퍼내다. 이 물이 가득 될 때까지 잠수 용기를 보관하고 단단히 컨테이너 w를 쏠i 번째의 나사 상단 뚜껑. 이 침전물을 혼합 할 필요가 없습니다. 수건으로 건조 용기의 외부를 닦아 다음 실험실에 표본을 채취하시면됩니다. 당신의 실험실로 샘플을 서두를 필요가 없습니다. 우리는 우리의 실험실로 돌아 오는 전에 몇 일 동안 현장에서 플라스틱 용기에 MTB 샘플을 그만 뒀어요. 이 분야에서 시원하고 그늘진 곳에서 샘플을 저장으로 MTB은 오래 같이 개월 몇 주 동안 가능한 있어야합니다.
2. 샘플은 실험실에되면, 뚜껑을 느슨하게하고 증발의 양을 줄일 수있는 용기를 덮고 두십시오. 어두운 방, 서랍에서 실온에서 컨테이너를 저장하거나 완전히 알루미늄 호일로 용기를 다룹니다. 퇴적물과 고급 입자가 완전히 몇 일 몇 시간 동안 방해받지 샘플을 출발하여 컨테이너의 하단에 정착 할 수 있도록 허용합니다. 그것은 퇴적물을 혼합 할 필요가 없습니다, MTB는 그대로 환경을 선호합니다. 플라스틱 용기의 명확한 벽이 입자가 아래로 정착했는지 확인 할 수 있습니다. 샘플에 따라 MTB는 많은 달 동안 샘플에서 살아 남아있을 수 있습니다.

2. MTB 절연

1. 이 약 1cm 침전물 물 인터페이스 (그림 1A) 위의 플라스틱 용기의 측면에있는 MTB, 장소 자석을 분리 할 준비가되면. 용기의 바닥에있는 퇴적물을 방해하지 않도록주의하십시오. 반대편 (그림 1A)에서 컨테이너와 다른 바 자석의 북쪽의 한쪽면에 바 자석의 남극를 놓습니다. 거의 모든 자석은 이러한 자기 저어 바 또는 대형 냉장고 자석으로 사용하실 수 있습니다. 아무거나는 침전물 물 인터페이스 위에 올바른 높이에서 자석을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 골판지 또는 플라스틱 상자의 상단에있는 자석을 쉬고 것이 가장 그러나, 자석은 또한 플라스틱 용기의 외부에 붙어 될 수 것으로 나타났습니다. 여러에 30 분을 기다려야박테리아 시간은 자석으로 수영합니다.
2. 주의 남쪽 극 바 자석 (북반구에 수집 된 샘플의 경우)의 위치 근처의 컨테이너 (그림 1A) 내부에서 물을 수집하기 위해 멸균 피펫을 사용합니다. 이 물은 남쪽 극 바 자석에 매료 된 MTB를 포함해야합니다. 다음, 모세관 경주가 더욱 MTB을 풍요롭게하는 데 사용되어야합니다.

3. MTB의 경마장

1. magnetotactic 박테리아와 샘플을 풍요롭게하기 위해, 모세관 경마장이 (인물 1B와 1C)가 필요합니다. 다음은 일반 플라스틱 용기에서 세포를 분리하기 전에 변경해야합니다.
2. 경마장을 만들기 위해 5.75 인치 (146mm) 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫의 상단을 잘라 다이아몬드 펜이나 파일을 사용 피펫의 길이는 중요하지 않습니다,하지만 물을 약 1-2 ML를 포함 할 수 있습니다. 다음 팁을 녹기 분젠 버너를 사용하는 때문에는 (그림 1C) 밀봉된다. 그 결과 피펫은 오픈 엔드 및 봉인 끝이 있어야합니다.
3. 이 racetracks 여러 후 압력솥을 만듭니다. 또한면 여러 긴 금속 바늘을 압력솥해야합니다.
4. 필터링 주사기에 부착 된 긴 금속 바늘을 사용하여 autoclaved 경기장으로 그림 1A에 도시 된 침전물 물 인터페이스 근처에서 수집 한 필터링 샘플 물을, 추가 할 수 있습니다. 필터의 기공 크기가 물에서 파편과 오염 물질을 제거하기 위해 0.22 mm해야합니다. 이 모세관 유리에 기포가 없는지 철저하게 확인하는 것이 중요합니다.
5. 멸균면 (그림 1B)와 레이스 트랙의 하단을 연결합니다. 거리에 밀봉 된 팁 (그림 1C)에서 1cm -이게 0.5입니다 있도록 경마장의 밀봉 된 끝 부분에 솜을 밀어 금속 바늘을 사용합니다.
6. 멸균 피펫 사용하여 샘​​플에 MTB 함유 물을 (섹션 2.2에서) 추가 연구준비된 MTB의 경주 (그림 1B)의 eservoir (오픈 엔드).

4. MTB 농축

1. 경마장은 샘플 액체로 가득되면, 수평 표면에 옆으로 쏟아 붓는 (예를 들어, benchtop) 및 경마장의 봉인 팁 (인물 1B 옆에 (북반구에서) 바 자석의 남쪽 기둥을 배치 와 1C).
2. 면을 통해 마이그레이션 할 수있는 MTB 기준 5 ~ 30 분 정도 기다립니다. 그런 다음 경마장의 끝 근처의 유체를 수집해야합니다. 너무 오래 기다리는 것은 모세관의 끝을하는 다른 운동성 세균 등 오염 물질을, 소개 할 수 있습니다. 선택적으로, 당신은 경주의 끝을 확인하고 MTB는 경마장의 끝에서 수집 볼 가벼운 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 당신이면 플러그를 통해 마이그레이션 할 수있는 MTB 소요 시간을 결정 할 수 있습니다.
3. 부드럽게면 플러그 근처의 작은 흠집을 만들어 경마장의 끝을 스냅하는 다이아몬드 칼을 사용합니다.
<리> 경마장의 끝에서 유체를 제거하는 좁은 바늘 (25 또는 27 게이지)가 1 ML의 주사기를 사용합니다. 이 액체 샘플은 현재 강화 MTB를 포함해야합니다.

5. 가벼운 현미경에 의한 MTB 전망대

1. coverslip 위에 강화 MTB 샘플의 드롭 (10-20 μl)를 배치합니다.
2. 그렇게 빨리 드롭이 현재 줄어들고 직면하고 coverslip에 달려있다 위에 coverslip을 뒤집기.
3. 유리 슬라이드에 휴식하는 O-링에 coverslip를 놓습니다. O-링는 약간 작은 직경 coverslip을 (; 그림 2 약 1 cm)이 있어야합니다.
4. 가벼운 현미경 단계에이 매달려 드롭을 배치하고 드롭 중 하나를 가장자리에 초점을 맞 춥니 다. 하지만 매달려 드롭 방식 (그림 2)을 사용하기 어려운 오일을 필요로하지 않는다 가장 높은 수치 조리개 값 (예를 들어, 0.93 NA)를 가지고 있기 때문에 60X 건조 목적은 잘 작동합니다.
5. 매달려 D에 바 자석 가까이의 남쪽 끝을 배치ROP와 MTB는 자석 (그림 3)에 가장 가까운 드롭의 가장자리으로 마이그레이션하기 시작합니다. 몇 분 이내에 많은 MTB는 드롭의 가장자리 (그림 3)에 있어야합니다. 박테리아가 자석의 극을 반대로하여 자기 것을 이룬 후 박테리아가 반대 방향에서 수영 관찰합니다.

6. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 MTB 관측

1. 구리 그리드로 강화 MTB의 드롭 (~ 20 μl)을 놓고 박테리아가 10 분 동안 해결 할 수 있습니다.
2. 깨끗한 필터 종이를 초과 물을 위크.
3. 선택적으로, 그리드에 부정적인 2 % uranyl 아세테이트, 2% phosphotungstic 산성 산도 7.2, 또는 2.5 %의 나트륨 molybdate ^{7, 8, 9} 물들 할 수 있습니다. 이것은 즉시 강화 MTB와 격자를 잠복기 후 얼룩 한 방울에 구리 그리드를 배치하여 이루어집니다. 부정적인 얼룩으로 격자를 길러, 시간은 세인트에 따라 달라집니다아니야!는 사용 후 깨끗한 필터 종이와 유체를 등심.
4. 전송 전자 현미경 (TEM, 그림 4)를 사용하여 MTB를 관찰. 일이 여기에 설명 된 내용은 MTB는 Formvar 안정화와 탄소 코팅 200 메쉬의 구리 격자 (테드 펠라 # 01800)에 adsorbed되었습니다. 격자는 최대 10 분까지에 세포 현탁액의 드롭 탄소 측에 아래로 배치 된 후 즉시 30 초에 물 한 방울에 격자를 배치하여 한 번 씻어. 착색를 들어, 격자는 초는 5 분, 30에 2 % uranyl 아세트산 (테드 펠라 # 19481)의 드롭 위치하고 완전히 필터 종이를 사용하여 건조 하였다. 격자는 TEM은 200kV에서 높은 각도 환형 암시 줄기를 사용하여 80kV 또는 페이 Tecnai F20에 두 페이 Tecnai 정신을 사용하여 분석 하였다.

자석은 환경 샘플 (그림 1A)에 포함 된 magnetotactic 세균 (MTB)를 분리하는 데 사용할 수있는 효과적인 도구입니다. 모세관 경마장 (그림 1B)은 그들이 또한 환경 시료 내에 포함 된 비 magnetotactic 미생물에서 분리 될 수있는면 플러그인을 통해 유치를 MTB의 자기 속성을 사용합니다.

그림 1. 침전와 물 샘플을 포함하는 투명한 플라스틱 병 콜럼버스, 오하이오 (USA)의 Olentangy 강에서 수집. 병은 약 1 반 침전 한 반 물을 포함하고 있습니다. 자석의 남쪽 끝 (A) 몇 시간 동안 침전 위의 약 1cm를 배치하고 있습니다. 컨테이너 내부에 자석 근처에서 유체의 일부를 제거 후, ​​모세관 R의 내부 배치됩니다acetrack있는 바 자석 (B)의 남쪽 끝 부분면 플러그 (화살표)을 통해 MTB 수영. ,면을 샘플을 보여 모세관 경마장의 전망을 최대 가까이, 필터링 유체의 모세관 튜브 및 막대 자석 (C)의 남쪽 끝의 봉인 끝.

MTB는 경마장에서 풍부하게 한 후 그림 2., 작은 드롭 그런 다음 거꾸로 뒤집힌와 슬라이드에 휴식하는 O-링에 삽입되는 coverslip에 배치 할 수 있습니다. 이 슬라이드-O-링 coverslip 샌드위치는 가벼운 현미경 단계에 위치하며 60X 건조 목표를 (석유 렌즈가 매달려 드롭을 사용하기 불편한 아르)를 사용하여 볼 수 있습니다.

그림 3. MTB 수영의 밝은 필드 현미경 이미지 (얇은긴 화살표)와 바 자석의 남극 옆에있는 매달려 드롭 (짧은 화살표)의 가장자리에 모여.

그림 4. 환경 침전 샘플에서 농축 한 magnetotactic의 세균의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 셀 (나선균)과 magnetosomes의 형태는 단일 편모와 함께 명확하게 볼 수 있습니다.

Magnetotactic 박테리아는 반드시 모든 수생 환경 ⁸ 찾을 수 없습니다하지만이 발생 할 때, 100의 순서에서 찾을 수 있습니다 - ^{밀리리터이} 1000 셀. 광학 현미경을 사용하여 MTB를 관찰하기 위해, 당신은 약 50 균 / 샘플 ⁸ ML이 필요합니다. 샘플에 또는 몇 MTB가없는 경우, 당신은 이걸 샘플을 수집하거나 다음 섹션에서 설명하는 기술 중 하나 이상을 시도해야합니다 새로운 환경 사이트를 선택해야합니다.

첫째, 큰 플라스틱 욕조 ^8을 사용 환경에서 더 많은 퇴적물을 수집하려고합니다. unculturable MTB 많은 수의이 필요한 경우이 특히 유용합니다. 환경 시료에 따라서는 즉시 샘플을 수집 한 후 50 세균 / ML의 농도를 갖는 MTB 샘플을 분리 할 수​​없는 경우가 있습니다. 따라서 LA로 다시 환경 샘플을했을 때boratory, 그것은 바 자석을 사용하여 MTB를 분리하기 전에 실험실 조건에 순응하는 샘플이 나올 때까지 기다리는 것이 좋을 것입니다. 이 acclimation 기간은 박테리아 커뮤니티 MTB 높은 농도로 이어지는 문화를 성숙하고 repopulate 할 수 있습니다. 더 자주 집중 MTB 샘플을 생산하고 또 다른 간단한 기술은 오랜 기간 (예를 들어, 몇 일)에 대한 샘플 컨테이너 (그림 1A)의 측면에 막대 자석을 떠날 것입니다. 이 자석으로 마이그레이션 할 수있는 더 많은 MTB 시간을 허용해야합니다. 마지막으로이 기술은 유용 할 수 있습니다, 하나 샘플로 각 경마장에서 MTB를 조합 한 번에 여러 racetracks을 (그림 1B)를 사용하는 것입니다. 당신은 경마장과 나 풍부한 샘플에 너무 많은 오염 미생물 (즉, 비 MTB)가있는 경우, 당신은 사람들이면 plu을 통해 수영로 MTB를 관찰 할 수있는 빛 현미경으로 경주를 배치 할 수있는 문제가되었다고 판단되는 경우g 및 팁에. 이 오염 미생물도면 플러그를 통해 올 때와 농축 프로세스를 중지하는 경우가 결정 할 수 있습니다.

우리는 MTB를 분리하는보다 정교한 방법이 있다는 것을 언급해야하지만, 이러한 방법은보다 전문적인 장비의 사용을 필요로합니다. 하나의 예는 담수 퇴적물 ^{10, 11 일부터} MTB를 분리 할 수있는 자기 코일의 사용, 대신 바 자석, 및 사용자 정의 유리 선박을 포함한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 환경 사이트가 MTB를 포함 여부를 결정 저렴하고 효과적인 방법을 나타냅니다. 이 절연 및 농축 프로토콜은 미생물학 학생들이 MTB보다 높은 수익률을 달성 할 수 있도록 "미세 조정"쉽게 습득 할 수있는 충분한 간단합니다. MTB는 분리 한 후, 이러한 형광에 원위치 하이브리드 화 등의 분석, 16는 지역 사회 분석, 에너지 흩어지는 분광법 (EDS), TEM, 광학 현미경에 대한 시퀀싱 rRNA및 자기 측정 MTB ^{12, 13, 14 일에} 실시 할 수 있습니다.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 동아시아 및 태평양 서머 연구소; 미국 연구 기금 프로그램의 지질 사회와 대학원 연구 장학금 졸업생 교부금이 작품은 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (EAR-0920299 및 EAR-0745808)의 보조금에 의해 지원되었다 오하이오 주립 대학에서. 우리는 자신의 통찰력 덧글에 대한 편집기와 두 개의 익명 리뷰어 감사드립니다.