אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

אנחנו מדגימים את שיטה לאיסוף חיידקי magnetotactic (MTB) שניתן להחיל על מים הטבעיים. MTB יכול להיות מבודד ומועשר מדגימות משקעות באמצעות התקנה פשוטה יחסית שמנצלת את המגנטיות הטבעית של החיידקים. המבודד MTB אז ניתן לבחון בפירוט שימוש באור ומיקרוסקופ אלקטרונים.

חיידקי Magnetotactic (MTB) הם מיקרואורגניזמים ימיים שקודם תוארו בעיקר בשנת 1975 ¹ מ דגימות משקעות שנאספו בביצות מלח של מסצ'וסטס (ארה"ב). מאז MTB התגלה במים ומרובדת משקעי עמודות מכל רחבי העולם ^2. תכונה אחת משותפת לכל MTB היא שהם מכילים magnetosomes, שהם nanocrystals תאי, קרום בכריכה מגנטית של מגנטיט ₍₃ Fe O ₄₎ ו / או greigite ₍₃ Fe S ₄₎ או שניהם ^{3, 4.} בחצי הכדור הצפוני, MTB נמשכים בדרך כלל לקצה הדרומי של מגנט לבר, ואילו בחצי הכדור הדרומיים שהם בדרך כלל נמשכים לקצה הצפוני של מגנט ^3,5. מאפיין זה יכול להיות מנוצל בעת ניסיון לבודד MTB מדגימות סביבתיות.

אחת הדרכים הנפוצות ביותר למעשירים MTB הוא להשתמש במכל פלסטיק שקוף כדי לאסוף משקעים ומים ממקור טבעי,כגון ברכת מים מתוקים. בחצי הכדור הצפוני, בקצה הדרומי של מגנט בר ממוקם על החלק החיצוני של המכל בדיוק מעל המשקעים בממשק משקעי מים. לאחר זמן מה, החיידקים ניתן להסירו מהצד הפנימי של המכל ליד המגנט עם פיפטה והעשירו עוד יותר על ידי שימוש במסלול מירוצי נימים ⁶ ומגנט. ברגע שהתעשר, החיידקים יכולים להיות ממוקמים בשקופית מיקרוסקופ באמצעות שיטת טיפה תלויה ונצפה במיקרוסקופ אור או שהופקד על רשת נחושת ונצפה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM).

באמצעות שיטה זו, מבודד MTB ניתן ללמוד מיקרוסקופי כדי לקבוע מאפיינים כגון שחי התנהגות, סוג ומספר שוטונים, מורפולוגיה תא של התאים, הצורה של הגבישים המגנטיים, מספר magnetosomes, מספר רשתות magnetosome בכל תא, ההרכב של את גבישי nanomineral ונוכחות וקואולות תאית.

1. MTB אוסף

1. כאשר מחליטים על אתר מים מתוק לאסוף חיידקי magnetotactic (MTB), הוא לעתים קרובות טוב ביותר להתחיל עם אגם או נחל איטי שיש שכבת משקע בוצית רכה. בהפגנה זו אספנו מדגם בקצה נהר Olentangy בקמפוס של אוניברסיטת אוהיו (OSU) בקולומבוס, אוהיו (ארה"ב). אמנם זה היה במיקום נוח להפגנה שלנו, הפרוטוקול המתואר כאן הוא ישים לכל מיקום מימי. החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת 1. מצא את מיקום שבו עומק המים הוא בין 10 ל 100 סנטימטר. במיקום כזה, אתה צריך לאסוף את השכבה העליונה ביותר של שימוש במכל ברור, מתברג משקעים. סקופ משקעים ומים לתוך המכל עד שהוא מלא בסחף שליש למחצית ונפח שנותר במים. שמור את המכל השקוע עד שהוא מלא במים ולאחר מכן בחוזקה מכסה את מכל with המכסה מתברג. זה לא הכרחי כדי לערבב את המשקע. נגב את החלק החיצוני של המכל במגבת היבש ולאחר מכן לקחת את הדגימה למעבדה שלך. זה לא הכרחי למהר מדגם בחזרה למעבדה שלך. השארנו לי דגימות MTB במכלי פלסטיק בתחום במשך כמה ימים לפני שהחזרת אותם למעבדה שלנו. MTB צריך להיות בת קיימא במשך כמה שבועות עד חודשים, כל עוד אתה שומר את הדגימות במקום קריר ומוצל בתחום.
2. ברגע שהמדגם הוא במעבדה שלך, שחרר את המכסה ולהשאיר אותה מכסה את המכל כדי להפחית את כמות האידוי. אחסן את המכל בטמפרטורת חדר בחדר חשוך, מגירה, או לכסות את המכל בנייר אלומיניום לחלוטין. אפשר המשקעים וחלקיקים להתיישב לחלוטין לתחתית המכל על ידי השארת המדגם באין מפריע במשך כמה שעות לכמה ימים. אין צורך לערבב את המשקעים, MTB מעדיף סביבה באין מפריע. הקירות הברורים של מכל הפלסטיקיאפשר לך לאשר כי החלקיקים התיישבו לתחתית. בהתאם לדוגמא שלך, MTB יכול להישאר בחיים במדגם במשך חודשים רבים.

2. בידוד MTB

1. כאשר אתה מוכן לבודד את MTB, מגנטי המקום בצדדים של מכל הפלסטיק כ 1 סנטימטר מעל לממשק משקעי מים (איור 1 א). היזהר שלא להפריע למשקעים בתחתית המכל. הנח את הקוטב הדרומי של מגנט לבר בצד אחד של המכל והצד הצפוני של מגנט עוד בר בצד השני (איור 1 א). כמעט כל מגנט יכול לשמש, כגון בר סערה מגנטית או מגנט למקרר גדול. כל דבר יכול לשמש כדי לתמוך במגנטים בגובה הנכון מעל לממשק משקעי מים. אנחנו מצאנו שנחנו את המגנטים על גבי קרטון או קופסא פלסטיק הוא טוב ביותר, עם זאת, את המגנטים יכולים גם להיות מודבקים מחוץ לקופסא הפלסטיק. חכה 30 דקות לכמהשעות עבור החיידקים לשחות אל המגנט.
2. השתמש פיפטה סטרילית, כדי לאסוף את המים בזהירות מתוך המכל (איור 1 א) בסמוך לעמדתו של בר מגנט דרום מוט (לדוגמאות שנאספו בחצי הכדור הצפוני). מים זה צריכים להכיל MTB שנמשך למגנט לבר דרום מוט. בשלב בא, מסלול מירוצי נימים יש להשתמש כדי להעשיר MTB נוסף.

3. מסלול מרוצה MTB

1. על מנת להעשיר את המדגם שלך עם חיידקי magnetotactic, מסלול מירוצי נימים הוא הכרחי (1B 1C ואיורים). אלה צריכים להיעשות לפני מבודדים את התאים מיכל הפלסטיק שקוף.
2. השתמש 5.75 אינץ' (146 מ"מ) הזכוכית פיפטה פסטר להפוך את מסלול מרוצה. השתמש בעט יהלומים או קובץ לחתוך את החלק העליון של פיפטה, אורכו של פיפטה הוא לא קריטי, אבל זה צריך להיות מסוגל להכיל כ 1-2 מ"ל של מים. בשלב הבא, להשתמש במבער בונזן כדי להמס את הקצה כך שהוא הופך להיות אטום (האיור 1C). פיפטה התוצאה צריכה להיות סוף פתוח וסוף סגור.
3. הפוך כמה ממסלולים המרוצים אלה ולאחר מכן חיטוי. בנוסף, תצטרך חיטוי הכותנה וכמה מחטי מתכת ארוכות.
4. הוסף מים מסוננים מדגם, נאספו ליד ממשק מי משקעים שמוצגים באיור 1 א ', למסלול מירוצי autoclaved באמצעות מחט מתכת ארוכה המחובר למזרק מסונן. הגודל הנקבובי של המסנן צריך להיות 0.22 מ"מ לחסל פסולת ומזהמים מהמים. חשוב להיות בטוח לחלוטין שאין בועות אוויר בזכוכית נימים.
5. חבר את החלק התחתון של מסלול המירוצים עם כותנת סטרילי (האיור 1B). השתמש במחט המתכת לדחוף צמר גפן לקראת הסוף החתום של מסלול המירוצים אז זה 0.5-1 סנטימטר מרחק מהקצה האטום (האיור 1C).
6. באמצעות פיפטה סטרילית, להוסיף את המים המכילים MTB (מסעיף 2.2) למדגם reservoir (סוף פתוח) של מסלול מירוצי MTB מוכן (1B איור).

4. העשרת MTB

1. ברגע שמסלול המירוצים מלא בנוזל דגימה, ולהניח אותה בצד שלה על משטח אופקי (למשל, benchtop) ולמקם את הקוטב הדרומי של מגנט לבר (בחצי הכדור הצפוני) בסמוך לקצה האטום של מסלול המירוצים (האיורים 1B ו1C).
2. לחכות 5 עד 30 דקות לMTB להעביר דרך הבד. אז אתה צריך לאסוף את הנוזל שבקצה המסלול. מחכה זמן רב מדי יכול להציג את חומרים מזהמים, כמו חיידקים ניעתי אחרים, לקצה הנימים. לחלופין, אתה יכול להשתמש במיקרוסקופ אור כדי להציג את קצה מסלול המירוצים ולצפות MTB לאסוף בקצו של המסלול המרוצה. זה יאפשר לך לקבוע כמה הזמן לוקח לMTB נודד דרך תקע הכותנה.
3. בעדינות להשתמש בסכין היהלום לעשות שריטה קטנה ליד תקע כותנה ולהטיח סוף המסלול המרוצה.
4. השתמש במזרק 1 מ"ל עם מחט צר (25 או 27 מד) כדי להסיר את הנוזל מקצה המסלול המרוצה. דגימת נוזל זה צריכה עכשיו מכילה המועשר MTB.

5. תצפית MTB ידי מיקרוסקופי אור

1. הנח טיפה (10-20 μl) של מדגם MTB המועשר על coverslip.
2. מהר להעיף את coverslip על כך הטיפה כעת פונה כלפי מטה ותלוי מcoverslip.
3. הנח את coverslip על גבי טבעת O-המונחת על משטח זכוכית. O-הטבעת צריכה להיות בקוטר קטן מעט יותר ואז coverslip (כ 1 סנטימטר; איור 2).
4. הנח טיפה תלויה זה על במת מיקרוסקופ אור ולהתמקד בקצה אחד של הירידה. אובייקטיבי יבש 60x עובד טוב מאוד, כי רוב יש צמצם מספרי גבוה (NA; למשל, 0.93), אך אינו דורשים שמן, שקשה להשתמש בשיטת הטיפה התלויה (איור 2).
5. הנח את הקצה הדרומי של מגנט קרוב לבר ד התלייהROP וMTB יתחילו לנדוד לכיוון הקצה של הירידה הקרובה ביותר למגנט (איור 3). תוך כמה דקות MTB רב צריך להיות בקצה הירידה (איור 3). להוכיח לעצמך שאת החיידקים הם על ידי היפוך מגנטיים של מגנט המוט ולאחר מכן לבחון את החיידקים לשחות בכיוון ההפוך.

6. תצפית MTB על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM)

1. הנח טיפה (~ 20 μl) של המועשר MTB על רשת נחושת ולאפשר לחיידקים להתיישב למשך 10 דקות.
2. פתילה את עודפי מים עם פיסת נייר סינון נקי.
3. לחלופין, אפשר לצבוע את הרשת באופן שלילי עם 2% יצטטו uranyl, pH החומצה phosphotungstic 2% 7.2, או 2.5% נתרן ^{7 molybdate, 8, 9.} הדבר נעשה על ידי הצבת רשת הנחושת על ירידה של כתם מייד לאחר דגירת הרשת עם המועשר MTB. דגירת הרשת עם הכתם שלילי, הזמנים משתנים בהתאם לרחעין בשימוש, ולאחר מכן את פתיל הנוזל בפיסת נייר סינון נקי.
4. שים לב MTB באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM, איור 4). לעבודה מתוארת כאן MTB היה adsorbed לFormvar התייצב ו200 רשתות פחם מצופות רשת נחושת (טד פלה # 01800). הרשתות הונחו בצד הפחם על ירידה של השעית תא לתקופה של עד 10 דקות, ולאחר מכן שטף מייד פעם אחת על ידי הצבת הרשת על טיפת המים למשך 30 שניות. לצביעה, הרשתות הונחו על ירידה של 2% יצטט uranyl (טד פלה # 19481) למשך 30 שניות עד 5 דקות ולאחר מכן ייבשו באמצעות פיסת נייר סינון לחלוטין. הרשתות נותחו על ידי TEM או באמצעות רוח Tecnai פיי ב80kV או פיי Tecnai F20 באמצעות STEM הגבוה זווית הכהה טבעתי בתחום 200kV.

מגנט הוא כלי יעיל שניתן להשתמש בו כדי לבודד חיידקי magnetotactic (MTB) הכלולים בדגימות סביבתיות (איור 1 א). מסלול מירוצי נימים (האיור 1B) משתמש בתכונות המגנטיות של MTB כדי למשוך אותם דרך תקע כותנה שבו הם יכולים להיות מופרדים ממיקרואורגניזמים שאינם magnetotactic הכלולים גם בתוך המדגם הסביבתי.

איור 1. בקבוק פלסטיק שקוף המכיל דגימת משקעים ומים שנאסף מנהר Olentangy בקולומבוס, אוהיו (ארה"ב). הבקבוק מכיל משקעים כמחצית ומי מחצית. הקצה הדרומי של מגנט ממוקם כ 1 סנטימטר מעל למשקעים עד כמה שעות (). לאחר הסרת חלק מהנוזל מליד המגנט בתוך המכל, היא ממוקמת בתוך r נימיםacetrack בי שחיית MTB באמצעות תקע כותנה (חץ) לכיוון הקצה הדרומי של מגנט לבר (B). מקרוב תצוגה של מסלול מירוצי הנימים מראים דוגמה, כותנה, נוזל מסונן, סוף חתום של צינור הנימים וקצה דרומי של מגנט לבר (C).

איור 2. רגע MTB התעשר ממסלול המירוצים, ירידה קטנה ניתן להציב על coverslip, אשר לאחר מכן הוא התהפך כשראשו למטה והונח על O-טבעת שמונחת על שקופית. כריך זה שקופית-O-טבעת coverslip ניתן להציב על במת מיקרוסקופ אור ולצפות בסרטים באמצעות אובייקטיבי יבש 60x (עדשות נפט הן נוחות לשימוש עם טיפה תלויה).

איור 3. תמונה מוארת תחום המיקרוסקופ של שחיית MTB (דקהחיצים ארוכים) ואיסוף בקצה הטיפה התלויה (חיצים קצרים) שנמצאה ליד הקוטב הדרומי של מגנט לבר.

איור 4. תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של חיידק magnetotactic יחיד המועשרים ממדגם משקעים סביבתיים. המורפולוגיה של התא (פתל) וmagnetosomes הם נראים בבירור יחד עם השוטון אחת.

חיידקי Magnetotactic לא נמצאים בהכרח בכל סביבה מימית ⁸ אבל כאשר הם עושים להתרחש, ניתן למצוא אותם בצו של 100 - 1000 תאים למ"ל ^2. כדי לצפות בMTB באמצעות מיקרוסקופיה אופטית, תצטרך כ 50 חיידקים / מ"ל במדגם שלך ^8. אם אין או מעטי MTB בדוגמא שלך, אז אתה גם צריך לבחור אתר סביבתי חדש כדי לאסוף הדגימות שלך או שאתה צריך לנסות את אחד או יותר מהטכניקות שנדונו בסעיף הבא.

ראשית, אתה צריך לנסות לאסוף יותר משקע מהסביבה באמצעות אמבטיה גדולה פלסטיק ^8. זו שימושית במיוחד אם מספר גדול של MTB unculturable יש צורך. בהתאם לדוגמת איכות הסביבה, זה לא יכול להיות אפשרי לבודד דגימות MTB יש ריכוז של 50 חיידקים / מ"ל ​​מייד לאחר איסוף הדגימה. לכן, כאשר אתם מביאים הדגימה הסביבתית שלך חזרה ללהboratory, זה עשוי להיות מועיל להמתין למדגם להסתגל לתנאי מעבדה לפני שאנסה לבודד MTB שימוש במגנט בר. תקופת הסתגלות זו תאפשר לקהילת החיידקים להתבגר ולאכלס מחדש את התרבות שמובילה לריכוזים גבוהים יותר של חיידק שחפת. טכניקה פשוטה נוספת שלעתים קרובות מייצרת דגימות MTB מרוכזות יותר היא להשאיר את המגנט לבר בצד של מכל המדגם (איור 1 א) לתקופה ארוכה יותר של זמן (כמה ימים, לדוגמה). זה אמור לאפשר זמן MTB יותר להגר למגנט. טכניקה אחת אחרונה, שעשוי להיות שימושי, היא להשתמש בכמה מסלולים מרוצים (התרשים 1B) בפעם אחת ולאחר מכן לשלב MTB מכל מסלול מירוצים לדגימה אחת. אם אתה מאמין שיש בעיה במסלול מירוצים, או אם יש יותר מדי מיקרואורגניזמים מזהמים (כלומר, שאינו MTB) במדגם המועשר שלך, אתה יכול למקם את המסלול המרוצים תחת מיקרוסקופ אור להתבונן MTB כשהם שוחים בכותנה pluוגרם לקצה. זה יאפשר לך לקבוע אם מיקרואורגניזמים מזהמים גם באים דרך תקע הכותנה ומתי להפסיק את תהליך ההעשרה.

אנחנו צריכים להזכיר שיש דרכים מתוחכמות יותר לבודד MTB, אך שיטות אלה מחייבים שימוש בציוד מיוחד יותר. דוגמה אחת כרוכה בשימוש בסליל מגנטי, במקום מגנט לבר, וכלי זכוכית מותאמים אישית לבודד MTB ממשקעי מים מתוקים ^{10, 11.} הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה זולה ויעילה לקביעה אם אתר מכיל MTB סביבתי. בידוד זה ופרוטוקול העשרה ואכן, די שתלמידי מיקרוביולוגיה יכולים לשלוט בקלות וב" כוונון עדין ", כך שתשואות גבוהות יותר של MTB יכולות להיות מושגת. ברגע MTB היה מבודד, ניתוחים אחרים כגון הכלאת פלואורסצנטי באתרו, 16S rRNA רצף לניתוח קהילה, ספקטרוסקופיה אנרגיה הנפיצה (EDS), TEM, מיקרוסקופיה אופטיתומדידות מגנטיות ניתן לבצע על ^{12 MTB, 13, 14.}

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המדע הלאומי האמריקנית (EAR-0920299 וEAR-0745808); קרן המדע הלאומי של ארה"ב למזרח אסיה ומכונה קיץ פסיפיק; החברה הגיאולוגית של אמריקה תכנית מענק מחקר והמענקים בוגר למחקר ומלגות למוסמכים מאוניברסיטת אוהיו. ברצוננו להודות לעורך ושני בודקי אנונימיים להערות תובנה שלהם.