Raccolta, isolamento e di arricchimento di batteri naturalmente presenti magnetotactic dall'ambiente

Dimostriamo un metodo per raccogliere batteri magnetotactic (MTB) che possono essere applicati alle acque naturali. MTB può essere isolato e arricchita da campioni di sedimento con una configurazione relativamente semplice che sfrutta il magnetismo naturale dei batteri. Isolato MTB può essere esaminata in dettaglio utilizzando sia la luce e la microscopia elettronica.

Batteri magnetotactic (MTB) sono microrganismi acquatici che sono stati in particolare di cui nel 1975 ¹ da campioni di sedimenti raccolti in saline di Massachusetts (USA). Da allora MTB sono stati scoperti in stratificato di acqua e sedimenti-colonne provenienti da tutto il mondo ^2. Una caratteristica comune a tutti MTB è che contengono magnetosomes, che sono intracellulari, nanocristalli di membrana magnetici di magnetite (Fe ₃ O ₄₎ e / o greigite (Fe ₃ S ₄₎ o entrambi ^{3, 4.} Nell'emisfero settentrionale, MTB sono in genere attratti dal lato sud di un magnete, mentre nel Sud del mondo di solito sono attratti dal lato nord di un magnete ^{da 3,5.} Questa proprietà può essere sfruttata quando si cerca di isolare MTB da campioni ambientali.

Uno dei modi più comuni per arricchire MTB è di usare un contenitore di plastica trasparente per raccogliere sedimenti e acqua da una fonte naturale,come uno stagno di acqua dolce. Nell'emisfero settentrionale, all'estremità sud di un magnete è posizionato contro la parte esterna del contenitore sopra il sedimento al sedimento-acqua. Dopo qualche tempo, i batteri possono essere rimossi dall'interno del contenitore in prossimità del magnete con una pipetta e poi arricchito ulteriormente utilizzando un circuito capillare ⁶ ed un magnete. Una volta arricchito, i batteri possono essere posizionati su un vetrino da microscopio utilizzando un metodo goccia pendente e osservato in un microscopio ottico o depositato su una griglia di rame e osservato con microscopia elettronica a trasmissione (TEM).

Usando questo metodo, isolato MTB possono essere studiate al microscopio per determinare caratteristiche quali nuoto comportamento, tipo e numero di flagelli, morfologia cellulare delle cellule, la forma dei cristalli magnetici, numero di magnetosomes, numero di catene magnetosome in ogni cella, la composizione di i cristalli nanomineral, e la presenza di vacuoli intracellulari.

1. MTB Collezione

1. Al momento di decidere su un sito per la raccolta d'acqua dolce batteri magnetotactic (MTB), spesso è meglio cominciare con un laghetto o lento flusso che è uno strato morbido sedimento fangoso. In questa dimostrazione abbiamo raccolto un campione sul bordo del fiume Olentangy nel campus della Ohio State University (OSU) a Columbus, Ohio (USA). Mentre questo era una posizione comoda per la nostra dimostrazione, il protocollo qui descritto è applicabile a qualsiasi posizione acquatico. I materiali utilizzati in questo protocollo può essere trovata nella tabella 1. Trovare una posizione dove la profondità dell'acqua è tra 10 e 100 cm. In tale posizione, si dovrebbe raccogliere più in alto strato di sedimento con una chiara, con tappo a vite contenitore. Raccogliere il sedimento e acqua nel contenitore fino a quando non è riempito con un terzo alla metà sedimenti e il restante volume con acqua. Mantenere il contenitore sommerso fino a riempirlo con acqua e poi ermeticamente tappare il contenitore with il suo tappo a vite del coperchio. Non è necessario mescolare il sedimento. Pulire l'esterno del contenitore con un asciugamano e poi prendere il campione al laboratorio. Non è necessario correre il campione di nuovo al vostro laboratorio. Abbiamo lasciato i campioni MTB in contenitori di plastica nel campo per diversi giorni prima di portare di nuovo al nostro laboratorio. La MTB deve essere valida per diverse settimane o mesi, a condizione che si memorizzano i campioni in un luogo fresco e ombreggiato in campo.
2. Una volta che il campione è in laboratorio, allentare il tappo e lasciare che copre il contenitore per ridurre la quantità di evaporazione. Conservare il contenitore a temperatura ambiente in una stanza buia, cassetto o coprire completamente il contenitore con un foglio di alluminio. Permettono il sedimento e particelle fini di risolvere completamente il fondo del contenitore lasciando il campione indisturbato per diverse ore a diversi giorni. Non è necessario mescolare il sedimento, MTB preferiscono un ambiente indisturbato. Le pareti trasparenti del contenitore di plasticavi permetterà di confermare che le particelle hanno depositata sul fondo. A seconda del campione, MTB può rimanere in vita nel campione per molti mesi.

2. MTB isolamento

1. Quando si è pronti per isolare i magneti, posto MTB sui lati del contenitore di plastica di circa 1 cm sopra il sedimento-acqua (Figura 1A). Attenzione a non disturbare il sedimento nel fondo del contenitore. Posizionare il polo sud di un magnete su un lato del contenitore e il lato nord di un altro magnete di barra sul lato opposto (Figura 1A). Quasi qualsiasi magnete può essere usato, ad esempio una barra di agitazione magnetica o magnete grande frigorifero. Tutto può essere usato per supportare i magneti alla giusta altezza sopra del sedimento-acqua. Abbiamo trovato che i magneti appoggiata sulla parte superiore di una scatola di cartone o plastica è meglio, tuttavia, i magneti possono anche essere incollata al di fuori del contenitore di plastica. Attendere 30 minuti a diverseore per i batteri a nuotare al magnete.
2. Utilizzare una pipetta sterile per raccogliere accuratamente l'acqua all'interno del contenitore (Figura 1A) vicino alla posizione del polo magnetico sud-bar (per campioni raccolti nell'emisfero Nord). L'acqua deve contenere la MTB che sono stati attratti dal polo sud-barra magnetica. Successivamente, una pista capillare deve essere utilizzato per arricchire ulteriormente la MTB.

3. MTB Racetrack

1. Al fine di arricchire il vostro campione con batteri magnetotactic, una pista capillare è necessario (1B e 1C figure). Questi devono essere fatte prima di isolare le cellule dalla chiara del contenitore plastico.
2. Utilizzare un 5,75 pollici (146 mm) in vetro pipetta Pasteur per fare una pista. Utilizzare una penna diamante o file per tagliare la parte superiore della pipetta, la lunghezza della pipetta non è determinante, ma dovrebbe essere in grado di contenere circa 1-2 ml di acqua. Quindi, utilizzare un becco Bunsen per fondere la punta in modo chediventa sigillato (Figura 1C). La pipetta risultante dovrebbe avere una estremità aperta ed una estremità chiusa.
3. Fare alcuni di questi circuiti e poi autoclave. Inoltre, è necessario sterilizzare in autoclave cotone e molti aghi metallici lunghi.
4. Aggiungere acqua campione filtrato, raccolti dal vicino all'interfaccia acqua sedimento mostrato in Figura 1A, ad una pista sterilizzato utilizzando un lungo ago di metallo attaccato ad una siringa filtrato. La dimensione dei pori del filtro dovrebbe essere 0,22 millimetri per eliminare i residui e contaminanti dall'acqua. E 'importante essere assolutamente certi che non ci siano bolle d'aria nel vetro capillare.
5. Inserire il fondo della pista con cotone sterile (Figura 1B). Utilizzare l'ago metallico per spingere il cotone verso l'estremità sigillata del circuito così è 0,5-1 cm dalla punta chiusa (Figura 1C).
6. Usando una pipetta sterile, aggiungere l'acqua contenente MTB (dalla sezione 2.2) al campione reservoir (estremità aperta) di una pista preparata MTB (Figura 1B).

4. MTB Arricchimento

1. Una volta che la pista è piena di fluido campione, si trovava su un lato su una superficie orizzontale (ad esempio, un banco) e posizionare il polo sud di un magnete (nell'emisfero settentrionale) accanto alla punta sigillata della pista (Figure 1B e 1C).
2. Attendere 5 a 30 minuti per la MTB a migrare attraverso il cotone. Poi si dovrebbe raccogliere il fluido vicino alla punta della pista. Attendere troppo a lungo possibile introdurre contaminanti, come altri batteri motili, alla punta del capillare. Facoltativamente, è possibile utilizzare un microscopio ottico per vedere la punta del circuito e guardare la MTB raccogliere sulla punta del circuito di. Questo vi permetterà di determinare quanto tempo ci vuole la MTB a migrare attraverso il tappo di cotone.
3. Delicatamente usare il coltello di diamante per fare un piccolo graffio vicino tappo di cotone e far scattare la fine della pista.
4. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago sottile (25 o 27 gauge) per rimuovere il liquido dalla punta della pista. Questo campione di liquido dovrebbe ora contenere la MTB arricchito.

5. MTB osservazione al microscopio ottico

1. Mettere una goccia (10-20 pl) del campione arricchito MTB su un vetrino coprioggetti.
2. Rapidamente capovolgere il coprioggetto sopra in modo che il calo è ora rivolta verso il basso e appeso alla coprioggetto.
3. Posizionare il vetrino su un o-ring che si riposa su un vetrino. L'o-ring deve avere un diametro leggermente più piccolo allora il coprioggetto (circa 1 cm; Figura 2).
4. Posizionare questa goccia su un palco microscopio ottico e concentrarsi su un bordo della goccia. Un obiettivo 60X secco funziona molto bene perché hanno una più elevata apertura numerica (NA, ad esempio, 0,93) ma non richiedono l'olio, che è difficile da usare per il metodo della goccia pendente (Figura 2).
5. Posizionare l'estremità sud di un magnete vicino bar per l'impiccagione dPOR e MTB inizierà a migrare verso il bordo della goccia più vicino al magnete (Figura 3). In pochi minuti MTB molti dovrebbe essere al bordo della goccia (Figura 3). Dimostra a te stesso che i batteri sono magnetici invertendo il polo del magnete e poi osservare i batteri nuotano nella direzione opposta.

6. Osservazione MTB da microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

1. Posizionare una goccia (~ 20 pl) della MTB arricchito su una griglia di rame e consentire ai batteri di depositarsi per 10 min.
2. Wick l'acqua in eccesso con un foglio di carta filtro.
3. Facoltativamente, la griglia può essere negativamente colorate con acetato di uranile 2%, 2% pH acido fosfotungstico 7,2, o 2,5% di sodio molibdato ^{7, 8, 9.} Questo viene fatto mettendo il reticolo di rame su una goccia di colorante immediatamente dopo incubazione della griglia con la MTB arricchito. Incubare la griglia con la macchia negativa, i tempi variano a seconda del stain utilizzato, e quindi favorire il liquido con un foglio di carta filtro.
4. Osservare la MTB con microscopia elettronica a trasmissione (TEM, Figura 4). Per il lavoro qui descritto MTB sono stati adsorbiti a formvar stabilizzato e di carbonio rivestiti 200 reti in rame maglia (Ted Pella # 01800). Le griglie sono stati collocati con il lato di carbonio su una goccia di sospensione cellulare per fino a 10 minuti, poi subito lavato una volta disponendo la griglia in una goccia di acqua per 30 sec. Per la colorazione, le griglie sono stati posti su una goccia di acetato di uranile 2% (Ted Pella # 19.481) per 30 sec per 5 minuti e poi asciugati completamente con un pezzo di carta da filtro. Le griglie sono state analizzate mediante TEM utilizzando uno Spirito FEI Tecnai a 80kV o FEI Tecnai F20 con alta STEM anulare angolo di campo scuro a 200kV.

Un magnete è uno strumento efficace che può essere utilizzata per isolare batteri magnetotactic (MTB) contenute in campioni ambientali (Figura 1A). Un circuito capillare (Figura 1B) utilizza le proprietà magnetiche di MTB attrarre attraverso un tappo di cotone dove possono essere separati dai non-magnetotactic microrganismi anche contenuti all'interno del campione ambientale.

Figura 1. Una bottiglia di plastica trasparente contenente un campione di sedimenti e acqua raccolta dal fiume Olentangy a Columbus, Ohio (USA). Il flacone contiene circa metà sedimenti e metà acqua. L'estremità sud di un magnete è posizionato a circa 1 cm sopra il sedimento per diverse ore (A). Dopo la rimozione del fluido da vicino il magnete all'interno del contenitore, viene posto all'interno di un capillare racetrack dove la nuotata MTB attraverso un tappo di cotone (freccia) verso l'estremità sud di un magnete (B). Un vicino di vista della pista capillare che mostra il campione, il cotone, il liquido filtrato, all'estremità chiusa del tubo capillare e alla fine a sud di un magnete a barra (C).

Figura 2. Dopo la MTB sono stati arricchiti dalla pista, una piccola goccia può essere collocato su un vetrino, che viene poi capovolti e posti su un O-ring che si riposa su un vetrino. Questa slide-o-ring-coprioggetto panino può essere posizionato su un palco microscopio ottico e visualizzati utilizzando un obiettivo 60X secco (lenti di petrolio sono scomodi da usare con una goccia).

Figura 3. Luminosa immagine al microscopio campo del nuoto MTB (sottilefrecce lunghe) e la raccolta sul bordo della goccia (frecce corte) che si trova vicino al polo sud di una barra magnetica.

Figura 4. Cambio di immagine al microscopio elettronico di un batterio magnetotactic unico arricchito da un campione di sedimento ambientale. La morfologia della cellula (spirillum) e magnetosomes sono chiaramente visibili con un singolo flagello.

Magnetotactic batteri non sono necessariamente presenti in ogni ambiente acquatico ⁸ ma quando si verificano, possono essere trovati dell'ordine di 100 - 1000 cellule per millilitro ^2. Al fine di osservare la MTB con microscopia ottica, avrete bisogno di circa 50 batteri / ml nel campione ^8. Se ci sono pochi o nessun MTB nel campione, allora si avrà sia bisogno di selezionare un nuovo sito ambientale per raccogliere i vostri campioni o hai bisogno di provare una o più delle tecniche descritte nella sezione successiva.

In primo luogo, si dovrebbe provare la raccolta di sedimenti più l'ambiente utilizzando una grande vasca di plastica ^8. Ciò è particolarmente utile se un gran numero di MTB non coltivabile sono necessari. Secondo il campione ambientale, potrebbe non essere possibile isolare MTB campioni aventi una concentrazione di 50 batteri / ml immediatamente dopo la raccolta del campione. Pertanto, quando portate il vostro campione ambientale torna al latorio, può essere vantaggioso per attendere il campione si adatti a condizioni di laboratorio prima di tentare di isolare il MTB utilizzando una barra magnetica. Questo periodo di acclimatazione consentirà alla comunità batterica di maturare e ripopolare la cultura che porta a concentrazioni più elevate di MTB. Un'altra tecnica semplice che spesso produce MTB campioni più concentrati è lasciare la barra magnetica sul lato del contenitore del campione (Figura 1A) per un periodo di tempo più lungo (per esempio, alcuni giorni). Questo dovrebbe permettere al MTB più a migrare verso il magnete. Una tecnica finale che può essere utile, è quello di utilizzare circuiti diversi (Figura 1B) in una sola volta e poi unire il MTB da ciascun circuito in un campione. Se ritieni che ci sia un problema con una pista o se ci sono microrganismi contaminanti troppi (cioè, non MTB) nel campione arricchito, è possibile inserire il circuito sotto un microscopio ottico per osservare la MTB mentre nuotano attraverso il plu cotoneg e nella punta. Questo vi permetterà di determinare se i microrganismi contaminanti sono anche venuta attraverso il tappo di cotone e quando interrompere il processo di arricchimento.

Dobbiamo ricordare che ci sono modi più sofisticati per isolare MTB, ma questi metodi richiedono l'uso di più attrezzature specializzate. Un esempio riguarda l'uso di una bobina magnetica, invece di un magnete, e contenitori in vetro personalizzati per isolare MTB da sedimenti d'acqua dolce ^{10, 11.} Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo economico ed efficace per determinare se un sito contiene MTB ambientale. Questo isolamento e il protocollo di arricchimento è abbastanza semplice che gli studenti di microbiologia può padroneggiare e facilmente "mettere a punto" in modo che rendimenti più elevati di MTB può essere raggiunto. Una volta che la MTB sono stati isolati, altre analisi come la fluorescenza in situ ibridazione, 16S rRNA sequenziamento per l'analisi di comunità, spettroscopia a dispersione di energia (EDS), TEM, microscopia otticae misure magnetiche può essere condotta in MTB ^{12, 13, 14.}

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal US National Science Foundation (EAR-0920299 e EAR-0745808); US National Science Foundation dell'Asia orientale e del Pacifico Estate Istituti, Geological Society of America del Programma di Ricerca Grant e le sovvenzioni per la ricerca Alumni Laurea e borse di studio da The Ohio State University. Vorremmo ringraziare l'editore e due revisori anonimi per i loro commenti penetranti.