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Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.
Apresentamos aqui um protocolo de reprogramação fibroblastos humanos adultos em humanos células pluripotentes induzidas estaminais (hiPSC) utilizando vectores retrovirais que codificam OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) na presença de butirato de sódio 1-3. Usamos este método para reprogramar passagem tardia (> p10) fibroblastos humanos adultos provenientes de paciente ataxia de Friedreich (GM03665, Coriell Repository). A abordagem de reprogramação inclui protocolo de transdução altamente eficiente utilizando centrifugação repetitiva de fibroblastos na presença de vírus que contêm meios de comunicação. As colónias hiPSC reprogramadas foram identificadas utilizando imunomarcação vivo para Tra-1-81, um marcador de superfície de células pluripotentes, separados a partir de fibroblastos não-reprogramadas e manualmente passadas 4,5. Estes hiPSC foram então transferidas para placas de Matrigel e cultivadas em condições isentas de alimentação, directamente a partir da placa de reprogramação. A partir da primeira passagem, as colónias hiPSC demonstrar característica HES-lmorfologia ike. Usando este protocolo mais do que 70% das colónias seleccionadas pode com sucesso ser expandido e estabelecido em linhas celulares. As linhas estabelecidas hiPSC exibido característicos marcadores de pluripotência incluindo marcadores de superfície TRA-1-60 e SSEA-4, bem como marcadores nucleares OCT3 / 4, Sox2 e Nanog. O protocolo apresentado aqui tenha sido estabelecida e testadas usando fibroblastos adultos obtidos a partir de pacientes com AF e indivíduos de controlo 6, fibroblastos humanos recém-nascidos, bem como queratinócitos humanos.
1. Produção de vírus e de transdução
2. Reprogramação
3. Isolamento de colónias hiPSC
4. Os resultados representativos
Transdução eficiente com retrovirus contendo mídia is crítico para a reprogramação. Recomenda-se para conduzir o procedimento de transfecção / infecção inteiro usando um GFP expressando vírus cada experiência única reprogramação para monitorar a eficácia, como mostrado na Figura 1. O título do vírus expressando GFP determinado, como descrito em 10, através da transdução de fibroblastos humanos utilizando meios não-concentrados virais foi tipicamente na gama de 0,5-5 x 10 7 partículas virais por ml (VP / ml).
Fibroblastos alterar a morfologia tão cedo quanto 2 dias após a última infecção. Tripsinizadas fibroblastos humanos devem ser cuidadosamente contadas antes, semeando-os nas células alimentadoras do MEF. Recomenda-se a células de semente menos 3 densidades diferentes (6x10 3, 4 1.2x10, 2.5x10 4 por único poço de uma placa de 6 poços) uma vez que cada linha de células demonstra característica de crescimento diferente e densidade de semeadura é crítica para a eficiência de reprogramação. Butirato de sódio utilizado para ainicial de 7 - 14 dias de reprogramação aumenta a eficiência de formação de hiPSC aproximadamente 5 vezes. Frequentemente, especialmente quando fibroblastos infectados foram semeadas a densidade mais elevada, as células de fibroblasto-like pode overgrow um prato de cultura e cobrir colónias hiPSC como mostrado na Figura 2A. Neste caso, a camada de fibroblastos podem ser cuidadosamente levantado e retirado para descobrir colónias hiPSC (Figura 2B). Subsequentemente, as colónias hiPSC deve ser lavado com HES meios de comunicação e coradas com Tra-1-81 de anticorpos. Dependendo das células de fibroblasto, cerca de 20 - 40% de colónias demonstrando com iPSC-like morfologia não mancham com Tra-1-81 de anticorpos. Identificados colónias hiPSC pode ser transferido a partir de uma placa de dentro 12 próxima - 24h. Incubação prolongada irá resultar em diferenciação rápida de hiPSCs. As colónias pode ser manualmente passadas para tanto células alimentadoras MEF ou Matrigel placas revestidas. Após a expansão estabelecido clones hiPSC devem ser testados usando imunocitoquímica (ICC) para a expressão de pluripotency marcadores como demonstrado na Figura 3. Além disso, uma caracterização molecular detalhada das geradas linhas de células iPS deve incluir: análises da expressão do gene pluripotência utilizando RT-PCR, na demonstração da desmetilação DNA com os promotores de genes pluripotência e análises dos transgenes silenciamento 9.
Figura 1. A eficiência de transdução virai determinada utilizando retrovírus GFP expressando. (A, B) fibroblastos humanos adultos derivados de paciente Friedreich ataxia (GM03665, Coriell Repository) foram visualizadas após duas infecções consecutivos com meios GFP retrovirais. (C, D) fibroblastos humanos foram infectadas com o mesmo lote de os meios de comunicação GFP retrovirais seguido por centrifugação das células directamente sobre as placas de 6 poços durante 1 hora à 1600g. As imagens foram capturadas 48h após a infecção.
Figura 2. Identificação e isolamento de colónias hiPSC. (A) da imagem de contraste de fase de uma placa contendo hiPSCs rodeadas por fibroblastos. As células foram cultivadas durante 21 dias em CTeh meios de comunicação. (B, C) colónia O mesmo hiPSC após a remoção da camada de fibroblastos circundante. (D) A correcta reprogramadas colónias hiPSC são identificados através de coloração vivo com Tra-1-81 superfície anticorpo marcador, cortados com uma agulha estéril (E, F) e transferidos para poços separados de uma placa de 24 cavidades.
Figura 3. Expressão dos marcadores específicos pluripotência OCT3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 e Tra-1-60 em hiPSCs foi determinada por imunocitoquímica.
O estudo de doenças humanas, especialmente neurológicas e neurodegenerativas, foi particularmente difícil devido à falta de acesso aos humanos adequados modelos de celulares. A capacidade de reprogramar células somáticas de fácil obtenção em células tronco pluripotentes induzidas e potencial para diferenciá-las em diversos tipos celulares abriu uma possibilidade de criar modelos celulares de doenças genéticas. Além disso, iPSCs realizar uma grande promessa para o futuro da medicina regenerativa. Portanto, é essencial para desenvolver e otimizar métodos confiáveis, eficientes e seguros de reprogramação de células somáticas de pluripotência.
Do ponto de vista de aplicações terapêuticas, é fundamental para desenvolver abordagens seguras de geração iPSC faltando pegada mutações no genoma do hospedeiro. Métodos de células somáticas de reprogramação sem a introdução de alterações permanentes no genoma de células reprogramadas tais como a transfecção de vectores epissomais, a utilização de coletável transposons, infecção adenoviral e entrega direto de mRNA ou de proteínas já foram estabelecidas 11-15. Até agora a eficiência de reprogramação utilizando estes métodos transgene livres é baixa e depende do tipo de caracteres, e da idade de células somáticas reprogramadas. Por conseguinte, estes protocolos não são adequados para a reprogramação passagem tarde, as células somáticas adultas frequentemente depositado em depósitos de células. Além disso, para permitir a caracterização detalhada das linhas de IPSC múltiplos e para estabelecer novos modelos de doenças humanas e para conduzir telas de alto rendimento de drogas, de reprogramação de células somáticas, utilizando entrega virais dos factores de transcrição é uma estratégia adequada. Até agora mais de 20 estudos relatou a geração de paciente-específicas iPSCs a modelo humano doenças neurológicas e neuromusculares. Em todos os casos, mas uma das iPSCs foram gerados utilizando transdução retroviral lentiviral ou 16.
Os nossos dados demonstram que um protocolo simples baseado em the entrega retroviral de factores de transcrição OSKM pode ser utilizado de forma eficiente reprogramar fibroblastos humanos adultos, mesmo de uma passagem elevada. A quantidade de vírus obtido a partir de uma transfecção única de células Phoenix em 10 centímetros da placa é suficiente para mais de 10 experiências de reprogramação. Existem três passos críticos no nosso protocolo de reprogramação de fibroblastos adultos: (i) a transdução altamente eficiente viral facilitada por um passo de centrifugação adicional durante a transdução que aumenta dramaticamente a eficiência de transdução, (ii) densidade semeadura do fibroblasto transduzidas para o MEFs e ( iii) utilização de coloração vivo com o anticorpo Tra-1-81 marcador para facilitar a selecção de colónias potencialmente totalmente reprogramadas que podem ser directamente transferidos para alimentador-free culturas. A eficiência de reprogramação é significativamente aumentada, usando butirato de sódio durante a segunda semana de reprogramação. Além disso, observou-se que uma maior fração das colônias cultivadas no IPSCpresença da droga pode ser expandido e estabelecida em totalmente reprogramadas linhas IPSC.
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado pela Aliança de Friedreich Ataxia Research e uma subvenção piloto da Família Arnold Foundation e O Centro de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento no MD Anderson Cancer Center.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagente | Companhia | Número de Catálogo | |
DMEM | Invitrogen | 11965 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
KSR | Invitrogen | 10828 | |
Aminoácidos não essenciais | Invitrogen | 11140 | |
Butirato de sódio | Sigma | B5887 | |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
Tra-1-81 anticorpo | Stemgent | 09-0069 | |
OCT3 / 4 anticorpo | Santa Cruz | sc-8628 | |
Nanog anticorpo | Cell Technology Sinalização | 4903S | |
Tra-1-60 anticorpo | Millipore | MAB4360 | |
Sox2 anticorpo | Cell Technology Sinalização | 3579S | |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
Marcador objetivo | Nikon | MBW10010 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 | |
β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 | |
polibrene | Sigma | H9268 | |
Marcador de objeto | Nikon | MBW10010 |
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