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我々はとレトロOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc(OSKM)をコードするベクターとライブ染色により正しく再プログラムhiPSCの識別を用いたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)TRA-にヒト体細胞の効率的なリプログラミングのためのプロトコルを提示1から81抗体。
ここに我々は1-3ナトリウム、酪酸の存在下でOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc(OSKM)をコードするレトロウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)にヒト成人線維芽細胞を再プログラミングのプロトコルを提示します。我々は、フリードライヒ失調症患者(GM03665、コーリエル医学リポジトリ)から派生した遅く通路(> P10)ヒト成人線維芽細胞を再プログラムするためにこのメソッドを使用していました。プログラミングのアプローチは、ウイルス含有培地の存在下で線維芽細胞の反復的な遠心分離を用いた高効率伝達プロトコルが含まれています。書き換えhiPSCコロニーがTRA-1-81、多能性細胞の表面マーカーのライブ免疫染色を用いて同定した、非書き換え線維芽細胞から分離し、手動で4,5継代。これらのhiPSCその後、マトリゲルプレートに移し、直接プログラミングプレートから、フィーダーフリーの条件下で増殖させた。最初の通過から始めて、hiPSCのコロニーは、hES-L特性を実証IKE形態。このプロトコルを使用して、選択したコロニーの70%以上が正常に拡大し、細胞株に確立することができます。確立されhiPSC行は表面マーカーTRA-1-60及びSSEA-4と同様に、核のマーカーOCT3 / 4、Sox2、及びNanogの特徴を含む多能性マーカーを表示されます。ここで紹介するプロトコルが確立され、フリードライヒ失調症患者と対照個体6、人間の新生児線維芽細胞と同様に、ヒトケラチノサイトから得られた成人の繊維芽細胞を用いてテストされています。
1。ウイルスの生産と伝達
2。再プログラミング
3。 hiPSCコロニーの単離
4。代表的な結果
レトロウイルス含有培地iの効率的な伝達の成功したリプログラミングの重要な。これは、図1に示すように、効率性を監視するウイルスごとに、単一のプログラミング実験を発現してGFPを用いて全体のトランスフェクション/感染症の手順を行うことをお勧めします。一般的に0.5の範囲であった非濃縮ウイルスメディアを用いたヒト線維芽細胞の情報伝達を介して、10で説明したようにGFP発現ウイルスの力価は、決定- 5×10ミリリットル(VP / ml)のあたり7ウイルス粒子。
線維芽細胞は2日最後の感染後できるだけ早く形態を変更します。トリプシン処理ヒト線維芽細胞は、慎重にMEFフィーダー細胞上に播種する前にカウントする必要があります。これは、各細胞株以来、3つの異なる密度(6×10 3、1.2×10 4、6ウェルプレートの1ウェルあたり2.5×10 4)で種子細胞に推奨されている別の成長特性および播種密度は、プログラミングの効率化のために重要であるを示しています。使用される酪酸ナトリウム最初の7 - プログラミングの14日間hiPSC形成の約5倍の効率を向上させます。頻繁に、感染した線維芽細胞を高い密度で播種した場合は特に、線維芽細胞様細胞は培養皿の生い茂る、図2Aに示すようにhiPSCコロニーをカバーすることができます。このケースでは、線維芽細胞層は慎重に持ち上げてhiPSCコロニー(図2B)を明らかにするために削除することができます。その後、hiPSCコロニーはヒトESメディアでリンスし、TRA-1から81抗体で染色する必要があります。線維芽細胞に応じて、約20 - IPSCのような形態を実証するコロニーの40%は、TRA-1-81抗体で染色されません。 24 - 識別hiPSCコロニーは、次の12内のプレートから転送することができます。長時間のインキュベーションは、hiPSCsの急速な分化になります。コロニーは、手動でMEFフィーダー細胞またはマトリゲルをコートしたプレートのどちらかに継代することができます。展開が確立した後hiPSCクローンpluripotenの発現のための免疫細胞化学(ICC)を使用してテストする必要がありますCYマーカーは、図3に示した。さらに、生成されたiPS細胞の詳細な分子特性を含める必要があります:RT-PCR、9サイレンシングの導入遺伝子の多能性遺伝子および分析のプロモーターのDNAメチル化のデモを使用して多能性遺伝子発現の解析を。
図1。 GFPを発現するレトロウイルスを用いて決定し、ウイルス形質導入の効率が向上します。(A、B)がフリードライヒ失調症患者(GM03665、コーリエル医学リポジトリ)由来のヒト成人線維芽細胞は、GFPレトロウイルスメディアを持つ2つの連続した感染症の後に可視化した。 (C、D)ヒト線維芽細胞は、1600グラムで直接1hの6ウェルプレート上での細胞の遠心分離に続いてGFPレトロウイルス媒体の同じバッチで感染させた。画像は、感染後48時間捕獲された。
図2。 hiPSCコロニーの同定および単離(A)線維芽細胞に囲まれたhiPSCsを含むプレートの位相コントラスト画像。細胞はヒトESメディアで21日間培養した。周囲の線維芽細胞層を除去した後(B、C)と同じhiPSCコロニー。 (D)が正しく書き換えhiPSCコロニーはTRA-1から81の表面マーカー抗体を用いたライブ染色により識別され、無菌の注射針(E、F)を使用してカットし、24ウェルプレートの個々のウェルに移した。
図3。多能性特異的なマーカーOCT3 / 4、Nanogの、レトロウイルスベクター、SSEA4とhiPSCsでTRA-1-60の発現は、免疫細胞化学によって決定された。
特に神経系と神経ヒトの疾患、勉強、特に十分なヒト細胞モデルの到達不能に起因する困難されています。多様な種類の細胞にそれらを区別するために誘導多能性幹細胞および潜在的に容易に得られる体細胞を再プログラムする能力は、遺伝性疾患の細胞モデルを作成する可能性を開いた。さらに、性IPSCは、再生医療の将来非常に有望なものである。したがって、多能性に体細胞を再プログラミングの信頼性の高い効率的で安全な方法を開発し、最適化することが不可欠です。
治療への応用の観点から、それが宿主ゲノムにフットプリントの変異を欠いているIPSC世代の安全なアプローチを開発することが重要です。そのようなエピソームベクトルのトランスフェクションとして再プログラム細胞のゲノムに恒久的な変化を導入することなくプログラミング体細胞の方法は、切除可能TRAの使用nsposons、アデノウイルス感染症、およびmRNAまたはタンパク質の直接配信は、すでに11-15確立されている。これまでのところ、これらの遺伝子フリーの方法を使用してプログラミング効率が低く、再プログラム体細胞の性質、種類、年齢に依存しています。したがって、これらのプロトコルは遅れて通路を再プログラミングには適していません、成人の体細胞は、頻繁にセルリポジトリに堆積させた。また、複数のIPSCラインの詳細な特性を有効にするとヒトの疾患の新しいモデルを確立し、転写因子のウイルス送達を使用して、体細胞の再プログラミング、高スループットの薬物画面を実施するためには、適切な戦略である。 20以上の研究を最新の状態にすると、モデルの人間の神経と神経筋疾患の患者特有のiPSCsの生成を報告した。すべてが1つのケースで性IPSCは、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入16を使用して生成された。
我々のデータは単純なプロトコルが目に基づいて実証するOSKM転写因子のレトロウイルスの電子配信を効率的にも高い通路の成人ヒト線維芽細胞を再プログラムすることができます。 10cmのプレート上にフェニックス細胞の単一トランスフェクションから得られたウイルスの量は、10以上のプログラミング実験のために十分である。成人線維芽細胞の我々のプログラミングプロトコルの3つの重要なステップがあります。劇的に伝達の効率を向上させる情報伝達中に追加の遠心分離工程によって容易に(i)の非常に効率的なウイルスの形質導入し、(ii)播種MEFの上に導入線維芽細胞の密度と( ⅲ)直接フィーダーフリーの培養液に移すことができる潜在的に完全に書き換えコロニーの選択を容易にするために、TRA-1から81までのマーカー抗体を用いたライブ染色の使用しています。プログラミングの効率が大幅に再プログラミング第2週に酪酸ナトリウムを使用することによって強化されています。さらに、IPSCコロニーの大きい画分がで培養することが観察薬剤の存在は完全に再プログラムIPSC行に拡大し、確立することができます。
著者らは、開示することは何もありません。
この作品は、フリードライヒ失調研究アライアンスとアーノルドファミリー財団とMDアンダーソンがんセンターの幹細胞と再生科学総合研究センターからのパイロット助成金によって支えられている。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
試薬 | 会社 | カタログ番号 | |
DMEM | インビトロジェン | 11965 | |
DMEM/F12 | インビトロジェン | 11330 | |
KSR | インビトロジェン | 10828 | |
非必須アミノ酸 | インビトロジェン | 11140 | |
酪酸ナトリウム | シグマ | B5887 | |
Y27632 | Stemgent | 04から0012 | |
bFGFの | Stemgent | 03から0002 | |
TRA-1-81抗体 | Stemgent | 09から0069 | |
Oct3 / 4の抗体 | サンタクルス | SC-8628 | |
NANOG抗体 | に:Cell Signaling Technology | 4903S | |
TRA-1-60抗体 | ミリポア | MAB4360 | |
Sox2の抗体 | に:Cell Signaling Technology | 3579S | |
SSEA4 | ミリポア | MAB4304 | |
CF1のMEF | Globalstem | GSC-6201G | |
客観的マーカー | ニコン | MBW10010 | |
マトリゲル | BDバイオサイエンス | 354277 | |
mTeSR1 | StemCellテクノロジーズ | 05850 | |
β-メルカプトエタノール | シグマ | M7522 | |
FuGENE 6トランスフェ | ロシュ社 | 11814443001 | |
ポリブレン | シグマ | H9268 | |
オブジェクトマーカー | ニコン | MBW10010 |
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