히알루론산은 동물 모델에서 가장 풍부한 세포외 기질 중 하나입니다. 배아 발달에서 히알루론산의 중요성이 입증되었습니다. 이 시험관 내 모델은 신경 능선 세포가 히알루론산이 풍부한 세포외 기질 내에서 어떻게 부착되고 이동하는지 탐색하는 데 유용합니다.
우리의 기술을 통해 우리는 시간이 지남에 따라 도매 개체군과 개별 세포의 이동 및 HA 분해 능력을 평가할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 HA 분해를 가속화하거나 방지하는 화합물을 찾기 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 시작하려면 기저막 매트릭스를 식힌 PBS로 1:50 비율로 희석하고 얼음 위에 보관하십시오.
희석된 매트릭스 용액 10밀리리터로 10cm 배양 플레이트를 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2 밀리리터의 PBS로 플레이트를 3 번 세척하십시오. 매트릭스 코팅된 플라템에서 O9-1 세포를 배양하기 위해 완전한 배아 줄기 또는 ES 세포 배지를 섭씨 37도의 수조에서 따뜻하게 합니다.
O9-1 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 완전한 ES 세포 배지를 사용하여 세포 농도를 밀리리터당 110만 개로 조정합니다. 매트릭스 코팅된 10cm 배양 플레이트에 8밀리리터의 예열된 완전한 ES 세포 배지를 추가하고 플레이트당 110만 개의 세포로 O9-1 세포를 시딩합니다.
섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 다음날, 배지를 섭씨 37도로 예열된 신선하고 완전한 ES 세포 배지로 교체합니다. 그 후 2-3일마다 새로운 배지로 교체하십시오.
PBS의 2 밀리리터와 배양 플레이트를 세척하고 그리고 나서 예열 된 0.25 % 트립신 EDTA의 2 밀리리터를 추가한다. 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 예열된 완전 ES 세포 배지 2밀리리터를 배양 플레이트에 넣고 해리된 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
튜브를 300g에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다. 2밀리리터의 예열된 완전한 ES 세포 배지를 튜브에 넣고 피펫팅으로 세포를 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 원하는 세포 밀도로 새 배양 접시에 세포를 시드합니다.
희석되지 않은 트리에톡시실란 50마이크로리터를 3.5cm 유리 바닥 접시에 조심스럽게 넣고 빛으로부터 보호되는 실온에서 5분 동안 배양합니다. 2 밀리리터의 증류수로 접시를 3 번 씻고 접시 당 PBS에서 100 배 희석 한 0.25 % 글루 타르 알데히드 50 마이크로 리터를 첨가하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양 한 후 2 밀리리터의 PBS로 4 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 0.2 노멀 아세트산에 300 마이크로 리터의 콜라겐 유형 1로 접시를 코팅합니다.
다시 2 밀리리터의 PBS로 3 번 씻으십시오. 각 접시에 히알루론산 나트륨 H2로 표시된 밀리리터당 200마이크로그램의 플루오레세인아민 300마이크로리터를 넣고 실온에서 밤새 배양합니다. PBS 2 밀리리터로 다시 세 번 씻으십시오.
코팅된 유리 바닥 접시를 건조시킨 후, 두 개의 웰 배양 삽입물을 접시에 부착하고 1밀리리터의 PBS로 삽입물을 외부에 채웁니다. O9-1 세포를 삽입당 2% 태아 소 혈청 또는 FBS를 포함하는 100마이크로리터의 DMEM에 있는 10, 000개의 세포에 있는 웰에 시드한다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 이틀 동안 세포를 배양하고, 올인원 형광 현미경을 사용하여 위상차 이미지를 시작 시점으로 캡처합니다.
핀셋으로 코팅된 유리 바닥 접시에서 삽입물을 조심스럽게 제거하고 코팅된 유리 바닥 접시를 2밀리리터의 PBS로 부드럽게 세척하여 세포와 세포 파편을 제거합니다. 2%FBS를 함유한 신선한 DMEM 2밀리리터를 배양 접시에 넣습니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 추가로 48시간 동안 세포를 배양하고 배양 24시간 및 48시간 후 위상차 이미지를 캡처합니다.
PBS로 접시를 씻고 48 시간 후에 4 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터로 실온에서 15 분 또는 섭씨 4도에서 밤새 세포를 고정시킨다. 그런 다음 1 밀리리터의 신선한 PBS로 5 분 동안 접시를 세 번 씻으십시오. 마지막으로 추가 형태학적 관찰을 위해 장착 매체와 함께 커버 슬립을 놓습니다.
E9.0에서 Tmem2 플래그 배아의 신경관의 횡단면이 이 그림에 나와 있습니다. 신경관의 두개골 및 몸통 수준의 섹션은 Tmem2 플래그 단백질과 히알루로난에 대해 이중 라벨이 붙었습니다. Tmem2 발현은 신경판과 신경관의 경계 영역에서 관찰된 반면, 이들 부위에는 히알루론산 염색이 없었습니다.
Tmem2 플래그 및 Sox9에 대한 신경 능선 세포의 이중 라벨링이 여기에 표시됩니다. E9.0 신경관의 횡단면을 Tmem2 플래그 및 Sox9에 대해 염색하였다. 일반 배양 접시에서 배양된 Tmem2 고갈 및 대조군 O9-1 세포의 대표 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.
이들 세포에서 Tmem2의 발현을 정상화를 위한 내부 대조군으로서 GAPDH를 사용한 qPCR에 의해 평가하였다. Tmem2가 고갈되고 대조군 O9-1 세포는 형광 히알루로난으로 코팅된 유리 커버 슬립 상에서 48시간 동안 배양되었습니다. 히알루론산 분해 활성은 형광 배경의 어두운 영역으로 드러납니다.
히알루론산 분해 수준은 또한 Tmem2 고갈 세포와 대조군 O9-1 세포 사이에서 정량적으로 비교되었습니다. O9-1 세포의 국소 접착에서 기질 결합 히알루론산의 분해가 이 그림에 나와 있습니다. Col1/HA로 구성된 혼합 기질에서 배양된 O9-1 세포는 항-빈쿨린 항체로 면역 표지되었습니다.
어두운 반점 또는 줄무늬는 FAHA H2 기질에서 히알루론산 분해 활성을 나타냅니다. 히알루론산 분해 부위와 국소 접착 부위는 혼합 기질에 공동 국소화되었습니다. 유리 바닥 접시에 HA를 코팅하는 것은 프로토콜에서 중요한 단계인데, 부적절한 코팅으로 인해 접착 및 이동 중에 기계적 힘에 의해 HA가 쉽게 제거될 수 있기 때문입니다.
적절한 코팅을 보장하기 위해 글루타르알데히드, 알데히드에 대한 무장 결합을 통해 유리에 화학적으로 고정된 1형 콜라겐을 사용합니다. 1형 콜라겐 외에 세포외 기질 기질을 사용하는 것이 가능하지만, 무장기가 있어야 하며, 화학적 특성으로 인해 유리 바닥 접시에 코팅하는 데 한계가 있을 수 있습니다. 따라서 최상의 접근 방식을 결정하기 위해 시행 착오가 필요할 수 있습니다.
이 실험실 실험은 신경능선 세포가 신경관 주변의 HA 또는 HA 환경으로 이동하는 동안 특정 분자가 어떻게 작동하는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 이러한 이동 과정을 가속화하거나 예방할 수 있는 약물을 테스트하는 유용한 방법이 될 수 있습니다. Tmem2가 HA에 대한 접착력과 HA의 분해 기능을 모두 갖는 이유와 HA가 전체 응집 부위에서 분해되어야 하는 이유를 아는 것은 흥미로울 것입니다.
HA는 세포외 기질에서 가장 흔한 물질이기 때문에 이 질문에 대한 답을 찾는 것은 생물학과 의학에서 정말 중요합니다. 이 실험 프로토콜은 피부 섬유아세포, 상피 세포 및 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에 적용할 수 있기 때문에 가치가 있습니다.
