L'acido ialuronico è una delle matrici extracellulari più abbondanti nel modello animale. È stata dimostrata l'importanza dell'acido ialuronico nello sviluppo embrionale. Questo modello in vitro è utile per esplorare come le cellule della cresta neurale aderiscono e migrano all'interno della matrice extracellulare ricca di acido ialuronico.
Con la nostra tecnica, possiamo valutare la migrazione e la capacità di degradazione dell'HA sia della popolazione all'ingrosso che delle singole cellule nel tempo. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per lo screening farmacologico per trovare composti che accelerano o prevengono la degradazione dell'HA. Per iniziare, diluire la matrice della membrana basale con PBS raffreddato in un rapporto 1:50 e tenerlo sul ghiaccio.
Rivestire una piastra di coltura di 10 centimetri con 10 millilitri della soluzione a matrice diluita e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la piastra tre volte con due millilitri di PBS. Per coltivare le cellule O9-1 sulla piastra rivestita di matrice riscaldare l'intero terreno di staminali embrionali o cellule ES in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Mescolare delicatamente la sospensione di celle O9-1 e contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico di celle. Quindi regolare la concentrazione cellulare a 1,1 milioni di cellule per millilitro con il mezzo cellulare ES completo. Aggiungere otto millilitri di mezzo cellulare ES completo preriscaldato alla piastra di coltura da 10 centimetri rivestita di matrice e seminare le cellule O9-1 a 1,1 milioni di cellule per piastra.
Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo di celle ES completo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius. Sostituire con terreno fresco ogni due o tre giorni successivi.
Lavare la piastra di coltura con due millilitri di PBS e quindi aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25%. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere due millilitri di mezzo cellulare ES completo preriscaldato alla piastra di coltura e trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 millilitri.
Centrifugare il tubo a 300g per cinque minuti ed eliminare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere due millilitri di mezzo di celle ES complete preriscaldate al tubo e risospendere completamente le celle mediante pipettaggio. Quindi seminare le cellule su una nuova piastra di coltura alla densità cellulare desiderata.
Aggiungere con cautela 50 microlitri di trietossisilano non diluito a una piastra di vetro da 3,5 centimetri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Lavare il piatto tre volte con due millilitri di acqua distillata e aggiungere 50 microlitri di glutaraldeide allo 0,25% diluito 100 volte in PBS per piatto. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavare quattro volte con due millilitri di PBS e rivestire i piatti con 300 microlitri di collagene di tipo uno in acido acetico normale 0,2 a temperatura ambiente per un'ora.
Ancora una volta, lavare tre volte con due millilitri di PBS. Aggiungere 300 microlitri di 200 microgrammi per millilitro di fluoresceinamina, marcato ialuronato di sodio H2 a ciascun piatto e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Lavare di nuovo con due millilitri di PBS tre volte.
Dopo aver asciugato il piatto inferiore in vetro rivestito, attaccare i due inserti di coltura del pozzetto ai piatti e riempire gli inserti esternamente con un millilitro di PBS. Seminare le cellule O9-1 nei pozzetti a 10.000 cellule in 100 microlitri di DMEM contenente il 2% di siero bovino fetale o FBS per inserto. Coltivare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica, acquisire immagini di contrasto di fase come punto di partenza, utilizzando un microscopio a fluorescenza all-in-one.
Rimuovere accuratamente gli inserti dai piatti inferiori in vetro rivestito con una pinzetta e lavare delicatamente i piatti inferiori in vetro rivestito con due millilitri di PBS per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Aggiungere due millilitri di DMEM fresco contenente il 2% di FBS nei piatti coltivati. Coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e catturare immagini di contrasto di fase dopo 24 ore e 48 ore in coltura.
Lavare i piatti con PBS e fissare le cellule dopo 48 ore con un millilitro di paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i piatti tre volte per cinque minuti ciascuno con un millilitro di PBS fresco. Infine, posizionare un vetrino di copertura con il mezzo di montaggio per un'ulteriore osservazione morfologica.
Le sezioni trasversali del tubo neurale degli embrioni bandiera Tmem2 a E9.0 sono mostrate in questa figura. Le sezioni a livello cranico e del tronco del tubo neurale sono state marcate due volte per la proteina bandiera Tmem2 e ialuronano. L'espressione di Tmem2 è stata osservata nella piastra neurale e nella regione di confine del tubo neurale, mentre questi siti erano privi di colorazione ialuronica.
La doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale per la bandiera Tmem2 e Sox9 è mostrata qui. Le sezioni trasversali del tubo neurale E9.0 sono state colorate per la bandiera Tmem2 e Sox9. Le immagini rappresentative di Tmem2 impoverito e cellule O9-1 di controllo coltivate su un piatto di coltura normale sono mostrate in questa figura.
L'espressione di Tmem2 in queste cellule è stata valutata mediante qPCR con GAPDH come controllo interno per la normalizzazione. Le cellule O9-1 impoverite e controllate di Tmem2 sono state coltivate per 48 ore su vetrini rivestiti con ialuronano fluoresceinato. L'attività degradante di Hyaluronan si rivela come aree scure sullo sfondo fluorescente.
Il livello di degradazione ialuronica è stato anche confrontato quantitativamente tra le cellule Tmem2 impoverite e le cellule O9-1 di controllo. La degradazione dell'acido ialuronico legato al substrato alle aderenze focali nelle cellule O9-1 è mostrata in questa figura. Le cellule O9-1 coltivate su substrati misti costituiti da Col1/HA sono state immunomarcate con un anticorpo anti-vinculina.
Le macchie scure o striature rappresentano l'attività di degradazione ialuronica nel substrato FAHA H2. I siti di degradazione ialuronica e le aderenze focali sono stati co-localizzati sui substrati misti. Il rivestimento Coval delle piastre con fondo in vetro con HA è un passo critico nel protocollo perché un rivestimento inadeguato può comportare la rimozione dell'HA facilmente con la forza meccanica durante l'adesione e la migrazione.
Per garantire un rivestimento adeguato, utilizziamo glutaraldeide, collagene di tipo uno immobilizzato chimicamente al vetro tramite accoppiamento di armamento all'aldeide. È possibile utilizzare il substrato della matrice extracellulare accanto al collagene di tipo uno, ma devono avere gruppi di armamento e potrebbero esserci limitazioni nel rivestimento coval su piatti con fondo di vetro a causa delle loro proprietà chimiche. Quindi potrebbero essere necessari tentativi ed errori per determinare l'approccio migliore.
Questo esperimento di laboratorio può essere utile per studiare come funzionano alcune molecole durante il movimento delle cellule della cresta neurale nell'ambiente HA o HA intorno al tubo neurale. Potrebbe anche essere un modo utile per testare un farmaco che potrebbe accelerare o prevenire questo processo di migrazione. È interessante sapere perché Tmem2 ha sia le funzioni di adesione su HA che la degradazione di HA e perché HA deve essere degradato nel sito di coesione completo.
Poiché l'HA è la sostanza più comune nella matrice extracellulare, capire la risposta a questa domanda è davvero importante in biologia e medicina. Questo protocollo sperimentale è prezioso perché può essere applicato a vari tipi di cellule, tra cui fibroblasti cutanei, cellule epiteliali e cellule tumorali.
