Гиалуроновая кислота является одним из самых распространенных внеклеточных матриксов на животных. Доказана важность гиалуроновой кислоты в эмбриональном развитии. Эта модель in vitro полезна для изучения того, как клетки нервного гребня прилипают и мигрируют в богатом гиалуроновой кислотой внеклеточном матриксе.
С помощью нашей методики мы можем оценить миграцию и способность к деградации гиалуроновой кислоты как оптовой популяции, так и отдельных клеток с течением времени. Кроме того, этот метод может быть использован для скрининга лекарств, чтобы найти соединение, которое ускоряет или предотвращает деградацию ГК. Для начала разбавьте матрицу базальной мембраны охлажденным PBS в соотношении 1:50 и держите ее на льду.
Покройте 10-сантиметровую культуральную пластину 10 миллилитрами разбавленного матричного раствора и выдержите пластину при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте тарелку три раза двумя миллилитрами PBS. Для культивирования клеток O9-1 на пластине, покрытой матриксом, нагревают всю среду эмбрионального ствола или ES-клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.
Аккуратно перемешайте суспензию ячеек O9-1 и подсчитайте количество ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Затем отрегулируйте концентрацию клеток до 1,1 миллиона клеток на миллилитр с полной средой ES-клеток. Добавьте восемь миллилитров предварительно разогретой полной среды ES-клеток в 10-сантиметровую культуральную пластину с матричным покрытием и засейте ячейки O9-1 в количестве 1,1 миллиона клеток на пластину.
Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном углекислым газом 5%. На следующий день замените среду свежей полной средой ES-ячейки, предварительно подогретой до 37 градусов по Цельсию. После этого заменяйте свежим средством каждые два-три дня.
Вымойте культуральную тарелку двумя миллилитрами PBS, а затем добавьте два миллилитра предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение пяти минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Добавьте два миллилитра предварительно разогретой полной среды ES-клеток в культуральную пластину и перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте пробирку при 300 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте в пробирку два миллилитра предварительно разогретой полной среды ES-клеток и тщательно ресуспендируйте клетки пипеткой. Затем высевают клетки на новую культуральную пластину с желаемой плотностью клеток.
Осторожно добавьте 50 микролитров неразбавленного триэтоксисилана в 3,5-сантиметровую стеклянную нижнюю посуду и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре, защищенной от света. Вымойте блюдо три раза двумя миллилитрами дистиллированной воды и добавьте 50 микролитров 0,25% глутарового альдегида, разведенного в 100 раз в PBS на блюдо. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем вымойте четыре раза двумя миллилитрами PBS и покройте посуду 300 микролитрами коллагена первого типа в 0,2 нормальной уксусной кислоты при комнатной температуре в течение одного часа.
Снова трижды постирайте двумя миллилитрами PBS. Добавьте 300 микролитров 200 микрограммов на миллилитр флуоресцеинамина, меченного гиалуронатом натрия H2, в каждую чашку и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре. Еще раз постирайте двумя миллилитрами PBS три раза.
После высыхания стеклянной нижней посуды с покрытием прикрепите две вкладыши для культуры к посуде и заполните вкладыши снаружи одним миллилитром PBS. Засейте клетки O9-1 в лунки на 10 000 клеток в 100 микролитрах DMEM, содержащего 2% эмбриональной бычьей сыворотки или FBS на вкладыш. Культивируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, увлажненном углекислым газом, с 5% углекислым газом, захватите фазово-контрастные изображения в качестве начальной точки времени с помощью универсального флуоресцентного микроскопа.
Осторожно снимите вкладыши с посуды со стеклянным дном с покрытием пинцетом и аккуратно вымойте стеклянную посуду с покрытием двумя миллилитрами PBS, чтобы удалить ячейки и клеточный мусор. Добавьте в культивируемую посуду два миллилитра свежего DMEM, содержащего 2% FBS. Культивируйте клетки в течение дополнительных 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и получайте фазово-контрастные изображения через 24 часа и 48 часов в культуре.
Вымойте посуду PBS и зафиксируйте ячейки через 48 часов одним миллилитром 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем вымойте посуду три раза по пять минут каждый с одним миллилитром свежего PBS. Наконец, поместите покровное стекло с монтажной средой для дальнейшего морфологического наблюдения.
На этом рисунке показаны поперечные срезы нервной трубки эмбрионов флага Tmem2 при E9.0. Срезы на уровне черепа и туловища нервной трубки были дважды помечены для флагового белка Tmem2 и гиалуронана. Экспрессия Tmem2 наблюдалась в нервной пластинке и пограничной области нервной трубки, тогда как эти участки были лишены окрашивания гиалуроновой кислотой.
Здесь показана двойная маркировка клеток нервного гребня для флага Tmem2 и Sox9. Поперечные срезы нервной трубки E9.0 окрашивали для флага Tmem2 и Sox9. На этом рисунке показаны репрезентативные изображения обедненных и контрольных клеток O9-1 Tmem2, культивируемых на обычной чашке для культивирования.
Экспрессию Tmem2 в этих клетках оценивали с помощью кПЦР с GAPDH в качестве внутреннего контроля для нормализации. Обедненные и контрольные клетки O9-1 Tmem2 культивировали в течение 48 часов на стеклянных покровных стеклах, покрытых флуоресцеинированным гиалуронаном. Гиалуроновая разрушающая активность проявляется в виде темных участков на флуоресцентном фоне.
Уровень деградации гиалуроновой кислоты также количественно сравнивался между истощенными Tmem2 и контрольными клетками O9-1. Деградация субстрат-связанной гиалуронана в фокальных спайках в клетках O9-1 показана на этом рисунке. Клетки O9-1, культивируемые на смешанных субстратах, состоящих из Col1 / HA, были иммуномечены антителом против винкулина.
Темные пятна или полосы представляют собой активность деградации гиалуроновой кислоты в субстрате FAHA H2. Участки деградации гиалуроновой кислоты и фокальные спайки были локализованы на смешанных субстратах. Покрытие Coval стеклянной нижней посуды гиалуроновой кислотой является критическим шагом в протоколе, поскольку недостаточное покрытие может привести к тому, что гиалуроновая кислота будет легко удалена механической силой во время адгезии и миграции.
Чтобы обеспечить надлежащее покрытие, мы используем глутаровый альдегид, химически иммобилизованный коллаген первого типа для стекла посредством соединения с альдегидом. Можно использовать субстрат внеклеточного матрикса рядом с коллагеном первого типа, но они должны иметь оружающие группы, и могут быть ограничения при нанесении их на стеклянную посуду из-за их химических свойств. Таким образом, для определения наилучшего подхода может потребоваться метод проб и ошибок.
Этот лабораторный эксперимент может быть полезен при изучении того, как определенные молекулы работают во время движения клеток нервного гребня в среду HA или HA вокруг нервной трубки. Это также может быть полезным способом тестирования препарата, который может либо ускорить, либо предотвратить этот процесс миграции. Интересно знать, почему Tmem2 выполняет как функции адгезии к ГК, так и деградации ГК, и почему ГК необходимо разлагать на месте полной когезии.
Поскольку гиалуроновая кислота является наиболее распространенным веществом во внеклеточном матриксе, выяснение ответа на этот вопрос действительно важно в биологии и медицине. Этот экспериментальный протокол ценен тем, что он может быть применен к различным типам клеток, включая фибробласты кожи, эпителиальные клетки и раковые клетки.
