우리는 MJ 팔롭의 도움말 및 대학교 드 발렌시아의 SCSIE의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 또한 도움이 의견과 원고의 논의 안토니아 Follenzi 감사합니다. 그 산탄데르 대학교 글로벌 사업부를 통해 방코 산탄데르에 의해 재단이 보틴,에 의해 Generalitat 발렌시아 (Programa PROMETEO, ACOMP 및 ISIC)과 Ministerio 드 Economìa y를 Competitividad에서 보조금을 지원하는 경우 (MINECO : SAF2011-23331, CIBERNED 및 RETIC 수컷 매) . 이 작품은 또한 (260511- MINECO과 유럽 연구위원회 (ERC) 2012-STG에서 BFU2010-21823 및 RETIC 수컷 매 보조금 지원 PD-HUMMODEL AC BM-P)이다. MINECO의 스페인 FPI의 교제를받는 사람이다.

윤리 선언문 :이 프로토콜은 유럽 지침 63분의 2,010 / EU 준수 발렌시아 대학의 동물 관리 지침을 따른다. 연구를 표시 생체에 대한 LV의 1 세대 (그림 1a 참조) 주의 : 여기에 설명 된 절차에 따라서 생물 학적 후드에서 다음의 모든 절차를 수행, 바이오 안전성 레벨 2입니다. 이 연구 담당자가 적절하게 자격을 갖춘 모든 절차 훈련 있는지 확인. 가운, 이중 장갑과 적절한 눈 보호를 포함한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 마지막으로, 철저하게 (70 % 에탄올, 10 % 표백제 및 / 또는 고압 증기 멸균으로 닦아) 승인 된 시설의 소독 방법에 따라 바이러스에 접촉되었을 수있는 모든 도구와 표면 오염을 제거. <ol><li> 인간 배아 신장 293T 세포에 LV의 생산 <ol><li> 형질 전환을위한 순수한 DNA를 준비하여이 프로토콜을 시작합니다. 준비 및 이중 협동 학습 대학원 각 플라스미드를 정제ient 원심 분리 또는 독소없는 DNA를 산출 다른 상업적으로 이용 가능한 열 방법. 이 프로토콜에서 우리는 전송 벡터 플라스미드 pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre을 사용했다. 추천 코어 포장 플라스미드 pMDLg / pRRE을하고 pRSV.REV하고 플라스미드 pMD2G 13,18,19 봉투. </li><li> 스물 네 시간 형질 감염 전에, Iscove 개변 둘 베코 배지 (IMDM)에서 플레이트 (5) × 106 293T 세포에 대해 약 1/4 1/3 합류 배양을 얻기 위해 10cm 플라스틱 접시 (자재 표 참조) 형질 전환. 5~7%의 CO 2 분위기하에 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 형질 전환 전에 새로운 배지 2 시간과 매체를 교체합니다. </li><li> 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관 믹스에서 10 전이 벡터 플라스미드의 μg의 pRSV.REV의 2.5 μg의 및 pMDLg / pRRE을 포장 플라스미드 5 μg의, 3.5 &amp;로 (유전자의 cDNA를 또는 shRNA를을 포함 배달합니다) #181; 봉투 플라스미드 pMD2G의 g. 0.1X TE 완충액 450 μL의 최종 부피 플라스미드 용액 메이크업 / 0 DH 2 (재료의 도표 참조) (2 : 1). 그런 다음 2.5 M 염화칼슘 (2) 50 μl를 추가합니다. </li><li> 최고 속도로 텍싱 동안 2 배 헤 페스 완충 생리 식염수 500 ㎕를 적가하여 침전물을 형성하는 500 ㎕의 DNA-TE-CaCl2를 혼합물 용액 (HBS를, 재료의 표 참조). </li><li> 즉시 293T 세포 침전물을 추가합니다. 부드럽게 섞어 접시를 소용돌이 친다. 인큐베이터로 세포를 반환하고 형질 전환 한 후 매체 14-16 시간을 변경합니다. </li><li> 미디어를 변경 한 후 세포 상층 액 30 시간을 수집합니다. 0.22 μm의 기공 니트로 셀룰로오스 필터를 통해 뜨는을 필터링하고 농도를 진행합니다. </li></ol></li><li> 정맥 주사의 농도 <ol><li> 2 50,000 XG (SW-28의 초 원심 분리기 로터와 19,000 RPM)에서 초 원심 분리에 의해 조절 매체에 집중30 ㎖ 폴리 프로필렌 투명한 원뿔 로터 튜브를 실온 (RT)에서 HR. 참고 : 원뿔 회 전자 튜브를 사용하여 초 원심 분리기 어댑터 (재료의 표 참조). </li><li> 경사 분리하여 상층 액을 버리고 작은 부피 (200 μL 또는 하나의 원심 분리가 수행되는 경우 이하) 포스페이트 완충 염수에 재현 탁 펠렛 (PBS; 자재 표 참조). 그런 다음 최대 피펫 약 20 배 아래로. </li><li> 현탁액을 풀 실온에서 2 시간 동안 50,000 × g으로 (SW-55 초 원심 분리기 로터와 23,000 RPM)에서 또한, 초 원심 분리에 의해 다시 집중한다. 5 ML의 공칭 볼륨과 폴리 프로필렌 투명 회 전자 튜브를 사용하여 (재료의 표 참조). </li><li> 멸균 PBS 매우 소량 (중간의 시작 양의 1/500 또는 1 / 1,000)에 최종 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 1 시간 동안 회전 진탕 휠. 작은 분취 량 (5 ~ 20 μL) 및 F로 분할-80 ° C에서 그들을 reeze. </li><li> 폐기하기 전에 10 % 표백제와 모든 빈 튜브를 취급합니다. </li></ol></li><li> 렌티 바이러스 적정 유동 세포 계측법을 사용하여 <ol><li> 전날, 플레이트 (2) 둘 베코의 변형 이글의 중간 (DMEM) 용액에 6 잘 조직 배양 플레이트에 웰 당 5 × 10 4 헬라 세포는 (재료의 표 참조). 24 시간 동안 5~7% CO 2 분위기하에 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 적정의 날, 바이러스 주식의 분취 량을 해동과 DMEM에서 10-8로 10-3에서 연속 희석을 준비합니다. <ol><li> 이렇게하려면 24 웰 플레이트를 가지고 다음 우물에 제 1 웰에 DMEM 2 ㎖ 및 1.8 ml에 추가 할 수 있습니다. 다음 (: 1,000 10-3 1의 최종 희석) 제 1 웰에 집중 바이러스 주식의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 완전히 용액 변경 팁 혼합 10-3 희석액 200 ㎕를 전송 수회 피펫 팅 한 후두 번째 잘합니다. 10-8 희석이 될 때까지 다음 우물에 직렬 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 인큐베이터에서 전날 도금 헬라 세포를 가져 가라. 조심스럽게 우물에서 매체를 제거합니다. 헬라 세포 함유 우물 8 ㎎ / ㎖ hexadimethrine 브로마이드 1 μL와 함께 각각의 바이러스 희석 한 ML을 추가합니다. 부드럽게 섞어 접시를 소용돌이 친다. 참고 Hexadimethrine 브로마이드 배양 세포에 바이러스 흡착을 증가 첨가된다. </li><li> 인큐베이터로 세포를 반환하고, 감염이 72 시간 동안 진행 할 수 있습니다. 그 후, 매체를 제거 PBS로 한번 세포를 씻어 트립신 EDTA 200 μl를 추가 각도 (재료의 표 참조). </li><li> 37 ° C에서 5 분 후, 튜브 유동 세포 계측법에 각 웰 수확 세포에 PBS 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 300 X g에서 원심 분리기와 뜨는을 대기음. </li><li> 고정 soluti 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁(PBS에 1 % 포름 알데히드 전자 현미경 등급 2 % 소 태아 혈청)을 다음 튜브 소용돌이. </li><li> 15 mW의 전력에서 488 나노 아르곤 ionlaser를 사용하여 사이토 흐름 세포를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 표준 구성 기기 설정 : GFP에 대한 미래 분산 (FS), 측면 산란 (SS) 및 형광 (40분의 525 ㎚). SS 도트 플롯 대 FS의 선택 세포 인구의 게이팅 셀 단위 및 파편을 제외합니다. 로그 스케일에서 형광을 수집합니다. 각 샘플에서 GFP + 세포의 수를 계산한다. </li><li> 다음 식을 이용하여 벡터 역가를 계산한다 : X 희석 인자 감염된 세포 (DF)의 %의 GFP + / 100에서 x = 열 변환 유닛 (TU) / ml로. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53282/53282fig1.jpg" /> 도 1 : 절차의 서로 다른 부분의 도식 표현 t의 (a) 1 부.그 프로토콜 : 적절한 플라스미드 HEK293T 세포의 형질 감염으로부터 생체 표지 연구 정맥 주사의 발생이 표시된 식을 이용하여 유세포 바이러스 역가의 결정에 정맥 주사를 생성한다. 플라스미드 및 원심 로터의 이름 표시된다. (b와 c) 프로토콜의 제 2 부 : 정맥 주사의 정위 주입. &quot;B&quot;는 버니어 스케일 정위 기기의 일부이고 정밀한 측정을 위해 제공하는 장치의 일례를 도시한다. 예를 들어, 화살표는 4.23 cm를 나타낸다. 버니어 스케일 ((ML) 메디 오 - 측면, 그리고 (왼쪽) 최고 뷰와 같이 배측 - 복부 (DV) 축과 시상 섹션의 안테 - 후방에서 좌표 (AP)를 마우스 오른쪽 결정하는 데 사용됩니다 ) 뇌의. &quot;c&quot;를 시상 및 관상 봉합의 교차점으로 브레 그마의 위치를​​ 나타냅니다. 정맥 주사는 주사기를 사용하여 주입된다. (d)에 도식 도면에서는 뇌 난을 보여주는분석을 위해 처리 s의. 두 반구는 분할되어 각각 두 개의 블록으로 분할된다. (; 참조 Paxinos&#39; 아틀라스를 참조 브레 그마 2.46 mm) 이전 기지국을 포함하는 블록 &quot;은&quot;즉시 telencephalon와 OB 접합에 후부 AP 수준에서 관상 절단에 의해 생성된다. 블록 &quot;B&quot;가 두 관상 인하, 레벨에 하나의 단지 (1.7 mm 브레 그마) 뇌량의 가장 주동이의 측면에 전방 두 측면 심실의 접합의 수준에서 두 번째에 의해 생성된다 (브레 그마 -0.22 mm). GL, 사구체 층; GCL, 과립제 전지 층; 일, 줄무늬; CC, 뇌량; 교류, 전방 접합면; 정맥 주사, 측면 뇌실. V-SVZ / 줄무늬 테두리로 또는 측면 심실로 LV 2. 정위 주입은 (그림 1B) <ol><li> 예비 <ol><li> 플런저 70 % 에탄올로 바늘 본체를 분무하여 33 게이지 바늘을 5 μL 용량 주사기 소독모든 방법을 꺼냈다. 반복적으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 에탄올을 기음과 여러 번 모든 방법을 밖으로 배출하고, 그 후 멸균 수로 철저하게 주사기를 씻어. 문화 후드에 안전하게 옆으로 주사기를 놓고는 건조 할 수 있습니다. </li><li> 이 과정에서 모든 폐기물의 침수에 적합한 볼륨에 10 % 표백제와 생물 학적 폐기물 용기를 준비합니다 (일반적으로 500ml의 용기에 200 ㎖). </li><li> 준비하고 물을 밀봉 플라스틱 저장 부대를 작성하고 37 ° C로 예열하여 37 ° C의 물침대를 예열. 이 마우스는 주입 다음 복구 할 수 있습니다. </li><li> 주사를 시작하기 전에 C의 냉동고에 보관 -80 °에서 1 시간을 바이러스 주식을 제거하고 실온에서 회전 바퀴에 병을 놓습니다. 해동 후, 주사의 시간 동안 얼음에 바이러스 재고를 유지한다. LV의 정위 주입하기 전에, 10 (6) TU에 집중 바이러스 주식을 희석 / 문화 후드에 PBS를 사용 μL. </li><li> 70 % 에탄올로 수술을 수행하는 선택된 영역 살균. </li></ol></li><li> LV의 미세 주입 <ol><li> 선택 및 수술 (메스, 드릴, 작은 핀셋)에 필요한 도구를 소독. </li><li> 케타민과 메데 토미의 동물 - 감독 혼합물을 주입 복강 (IP)에 의해 6 ~ 8 주령의 마우스를 마취. 각각의 동물을 체중 및 50-75 mg의 케타민 및 마우스의 체중 kg 당 0.5 mg을 메데 토미 (케타민 100-125 μL 해결 / 메데 토미 마우스 당 용액 작업) 각 선량. </li><li> 발가락, 꼬리 나 귀를 곤란과 동물이 어떤 반응을 보여줍니다하도록하여 마취 비행기를 평가합니다. </li><li> 마우스를 마취되면, 수술 - 후 통증을 최소화하기 위해 마우스 체중 kg 당 0.4-0.5 mg의 최종 투여 량 부토 르파 놀 피하 주사. </li><li> 귀 사이의 영역을 면도 나 요오드 등 iodopovidone 또는 70 % 에탄올을 사용하여 피부를 소독. 멸균면을 사용하여 정화-tipped 어플리케이터. 이 저체온증을 악화시킬 수 있으므로 과도하게 동물을 적시하지 않도록주의. </li><li> 정위 프레임에 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치하고주의 깊게 귀 바, 장치의 미각 지원을 사용하여 머리를 고정합니다. 37 ° C에서 가열 패드 세트와 마우스를 유지하고 눈 안과 윤활제를 적용합니다. </li><li> 종 메스를 이용하여 두피에 1cm 긴 절개를 부드럽게 미세 핀셋을 이용하여 두개골을 노출시키기 위해 피부를 철회. </li><li> 조심스럽게 멸균 면봉와 뼈 표면을 청소합니다. 남아있는 조직의 노출 된 두개골 뼈를 정화. </li><li> 주사기 홀더를 사용하여 정위 장치의 멸균 주사기를 탑재합니다. </li><li> 주사기 바늘의 끝 부분이 정수리, 시상 (종 방향 및 내측) 봉합사는 수직 관상 봉합에 의해 교차되는 결합 점에 위치 할 때까지 (Figur을 주사기 홀더 X, Y 및 Z 축 이동전자 1B). 배측 - 복부 (DV) 축 &quot;제로&quot;위치는 브레 그마의 두개골 표면에 있는지 확인합니다. </li><li> X 및 Y 좌표를 대상으로 주사기를 이동 (표 1 및도 1B 참조). </li></ol></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 주사의 지역 </td><td colspan="3"> 좌표 </td></tr><tr><td> 안테 - 후부 (AP) </td><td> 메디 오 - 측면 (ML) </td><td> 배측 - 복부 (DV) </td></tr><tr><td> SEZ / 줄무늬 테두리 </td><td> 0.6 mm </td><td> 1.2 mm </td><td> -3.0 mm </td></tr><tr><td> 측면 뇌실 </td><td> -0.3 mm </td><td> 1.0 mm </td><td> -2.6 mm </td></tr></tbody></table> 표 1 : 정위는의 좌표용 돌기. AP와 ML 축, x 및 y 좌표의 경우는 브레 그마에서 (mm)에 거리로 제공됩니다. &quot;-&quot; &quot;후방을 향해&quot;을 나타냅니다. DV는 &quot;제로&quot;좌표 정수리 점에서 두개골 표면이며 DV 좌표 다운이 시점에서 (mm)에서의 거리를 나타낸다. <ol start="12" style="margin-left: 40px;"><li> X, Y 및 Z 주석 목적지 나중에 다시 주사 부위에 올 수 있도록하기 위해 버니어 눈금 조정한다. 마크 수술 마커 펜을 사용하여 x 및 y 좌표에있는 뼈. </li><li> 작업 영역에서 멀리 주사기를 이동합니다. </li><li> 전기 드릴 신중하지 두개골에 구멍을 사용하면 뇌가 손상 될 수 있습니다. 이 뇌 표면에 손상을 줄 수 있으므로 pial 표면을 드릴하지 마십시오. </li><li> 10 6 TU / μL 바이러스 솔루션의 1 μL와 주사기를로드합니다. 선단 10 ~ 12 °의 각도가 33 게이지 경 사진 날카로운 바늘을 사용합니다. 90 ° 중앙에 주사기 바늘의 위치를제작 뇌 표면에 대하여. </li><li> 다시 주사 부위에 주사기를 이동하고 끝이 pial 표면에 닿을 때까지 아래로 이동합니다. </li><li> DV 축 좌표 Z에 주사기와 뇌를 침투. </li><li> 천천히 과도한 유체 압력 뇌 조직의 손상을 최소화하기 위해, 0.2 μL / 분의 속도로, 바이러스 현탁액을 해제. </li><li> 바이러스 현탁액의 역류를 최소화하기 위해 5 ~ 10 분 동안 기다린 후 아주 천천히 주사기를 철회. 닦아 실험실을 사용하여 주사기의 수축의 결과로 표면에 표시하고, 표백제 함유 바이오 안전성 폐기물 용기에 즉시 배치 할 수 액체의 초과를시킨다. </li><li> , 정위 세트에서 동물을 따뜻한 패드에 배치, 피부 접착제를 사용하여 상처를 닫습니다. 0.1 ~ 1.0 ㎎ / ㎏ 체중 atipamezole을 사용하여 마취 역방향. </li><li> 피하 0.1 밀리그램 당 kg 마우스 중량 매 12 시간의 마지막 투여 량을 주입 Bupenorphrine,짧은 지속 부토 르파 놀의 진통제의 투여 후 4 시간을 시작. </li><li> 따뜻한 패드 개별 새장에 동물을 배치하고 마우스가 마취에서 회복 될 때까지 긴밀하게 모니터링 할 수 있습니다. 복구 후 동물의 수화물을 돕기 위해 새장에 하이드로 겔의 한 가방을 놓습니다. </li><li> 액체 표백제 생물 학적 처리의 모든 생물 오염 된 폐기물 폐기하십시오. 흡입 및 에탄올의 배출에 의해 주사기를 청소하고 물로 씻어. 지역, 정위 세트와 표백제 및 70 % 에탄올에 사용 된 수술 재료를 소독. </li><li> 그들은 기존의 주거 시설로 전송할 수 있습니다 후 24 ~ 48 시간 동안 바이오 안전성 레벨 2 방에 격리 주입 된 쥐를 유지 </li></ol> 3. 조직 학적 분석 <ol><li> 관류, 조직 수집 및 단면 <ol><li> 깊이 메데 토미와 케타민의 수의학 - 감독 혼합물을 사용하여 쥐를 마취시키다 (t 곤란하여 마취면을 평가OES, 꼬리 나 귀), 전술 한 바와 같이. </li><li> 동일한 속도로 transcardially 17 PB 75 ml의 4 % PFA이어서 식염수 25 ㎖로 쥐를 관류. </li><li> 뇌를 추출하고 16 시간 (증가 후 고정 시간은 어떤 항원의 면역 반응을 감소시킬 수있다)에 대한 PB 차가운 4 % PFA의 10 배 볼륨에 침지하여 포스트 - 수정. PB 충분히 남아 PFA 씻으십시오. </li><li> 그림 1D의 표시 다음 뇌를 잘라 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 vibratome의 홀더에 결과 블록을 붙입니다. </li><li> vibratome를 사용하여 30 μm의 두께 시리얼 코로나 섹션을 수집합니다. 4 ° C에서 PB와 24 멀티 웰 플레이트의 뇌 조각을 저장합니다. 오염을 방지하기 위해 0.05 % 나트륨 아 지드 PB 용액에 첨가 할 수있다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 <ol><li> 0.05 % 아 지드 화 나트륨, 1 % 글리신, 5 % 정상 염소 혈청 완충액 (PB 블로킹 부동성 섹션을 인큐베이션하고 0.1 % TritX-100) 부드러운가 흔들 플랫폼에서 진탕 실온에서 1 시간에 대한합니다. </li><li> 조심스럽게 버퍼를 차단에 방지 GFP 토끼 차 항체 (재료의 표 참조)의 적절한 희석을 추가, 피펫 차단 버퍼를 제거하고 부드러운 흔들림 4 ° C에서 48 시간 동안이 희석 조직을 품어. </li><li> 차 항체 용액을 PB로 3 회 최소 하나의 세척 매 10 분을 씻으십시오. </li><li> 차단 솔루션에 형광 접합 된 이차 항체의 적합한 희석와 자유 떠있는 부분)을 품어 (RT 부드러운 흔들림에서 1 시간 동안) 재료의 표를 참조하십시오. 배양 중에 직접 빛의 섹션을 보호합니다. </li><li> PB, 3 번에 한번 10 분간 함께 차 항체 용액을 세정하고, 5 분 동안 물에 1 ㎎ / ㎖에서 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌)을 섹션을 배양하여 조직을 Counterstain과. 두 번 빠르게 재치를 세척하여 DAPI 솔루션을 씻어시간 물. </li><li> 부드럽게 잘 페인트 브러시를 사용하여 현미경 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 조직 위에 (자재 표 참조) 형광 제제 매체 장착 몇 방울 붓고 신중 장착 용액 정확하게 전체면에 걸쳐 분산되고, 기포가 없는지 검사 위에 커버 슬립을 놓는다. 부드럽게 매체 장착 과잉 드레인 커버 슬립을 짠다. </li><li> 장착 용액 (2-16 시간)를 마르면 때 488 nm의 레이저와 공 초점 레이저 주사 현미경으로 샘플을 분석한다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche.">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li><li>Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+and+their+niche:+a+dynamic+duo+during+homeostasis,+regeneration,+and+aging.">Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).</li><li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone.">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li><li>Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain.">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).</li><li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain.">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li><li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells.">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li><li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subventricular+zone+en-face:+wholemount+staining+and+ependymal+flow.">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Ramirez-Castillejo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+epithelium-derived+factor+is+a+niche+signal+for+neural+stem+cell+renewal.">Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).</li><li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone:+go+with+the+flow!.">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li><li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NT-3+delivered+by+vasculature+and+CSF+promotes+quiescence+of+subependymal+neural+stem+cells+through+nitric+oxide+induction.">Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction.</a> Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).</li><li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression.">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li><li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin.">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lake-front+property:+a+unique+germinal+niche+by+the+lateral+ventricles+of+the+adult+brain.">Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain.</a> Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).</li><li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferr&#242;n, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone.">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li><li>Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+subventricular+zone+astrocytes.">In vivo targeting of subventricular zone astrocytes.</a> Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).</li><li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fari&#241;as, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex/in+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells.">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li><li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System.">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier:+pathogenic+trickery.">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li><li>Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lentiviral+vector-mediated+transduction+on+the+tightness+of+a+polarized+model+of+airway+epithelium+and+effect+of+cationic+polymer+polyethylenimine.">Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine.</a> J Biomed Biotechnol. , (2010).</li><li>Bonazzi, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impenetrable+barriers+or+entry+portals?+The+role+of+cell-cell+adhesion+during+infection.">Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection.</a> J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).</li><li>Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junction+formation+inhibits+lentivirus+entry+and+gene+transfer.">Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer.</a> PLoS One. 8 (11), (2013).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum.">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li></ol>

모든 조작은 바이오 안전성 수준이 방에서 이루어졌다. 동물 프로토콜은 발렌시아 대학의 윤리위원회의 승인과 유럽 지침 63분의 2,010 / EU 준수 모든 있었다되었다.

정맥 주사는 성인의 유전자 변형 NSCs의 16, 18에 대한 다른 바이러스 시스템에 비해 중요한 장점을 제공합니다. V-SVZ 틈새 시장에 렌티 바이러스의 정위 배달 레이블 만 세포를 대상으로 여러 세포 분열, 또는 레트로 바이러스 후 희석 등의 BrdU의 같은 다른 일반적으로 사용되는 방법의 한계를 극복 B1-NSCs을 나누어 자주 추적하는 효율적인 방법을 나타냅니다 즉, 응용 프로그램의 순간에 확산된다. 정맥 주사는 함께 아데노 바이러스와 독립적으로 순환 상태의 세포를 감염시킬 수 이것은 성인 NSCs의 16, 18과 같이, 같은 뇌실막 세포로하지주기를 수행하거나 상대적으로 정지하고, 따라서 거의 분열하지 세포에 특히 적합하다. 유전자가 안정적으로 통합 고효율 형질 도입 된 세포 및 그 자손의 형태 학적 특성을 표현할 수있게된다. NSCs의는 이웃 세포와 고도로 전문화 된 틈새에 숨겨된다등의 뇌실막 또는 혈관 세포뿐만 아니라 자신의 세포 자손 따라서 엄격하게 규제 환경 (2)를 작성. 많은 태아 NSCs을 마찬가지로, B1 셀 옆 뇌실에 거짓말과 심실은 심실 CSF 1 (그림 2a)에 침지 한 비 운동성이 차 섬모의 끝 작은 혀끝의 과정을 통해 유체를 문의하십시오. 이 세부 조직은 특히 바이러스 역가 및 배달 영역의 제어를 통해 틈새 시장에서 뇌실막 세포 또는 모든 셀을 대상으로 악용 될 수 있습니다. 편광 상피에서 Adherens 및 꽉 접합은 때때로 때문에 접합부 단지에 바이러스 항목 수용체 (즉, CAR 수용체)의 제한된 위치, 세포와 조직에 외국 바이러스의 유입을 방해하는 것으로 나타났다. 간 부착 중단 따라서, 렌티 바이러스 (LV)를 포함하여 다른 종류의 바이러스에 의해 감염을 선호한다. 사용할 때 흥미롭게도, 정맥 주사는 접합부 단지를 중단하는 것으로 나타났다폐 상피 20-23에서 높은 농도에서. 이 측면 뇌실 (24)에 주입 정맥 주사에 의한 B1-NSCs의 감염 이전 보고서를 설명 할 수있다. B1-NSCs의이 전방과 등쪽으로 마이그레이션 자손을 생산하기 때문에, GFP 양성 세포는 RMS의 모든 수준에서뿐만 아니라 그들이 말기 각각의 뉴런 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 OB 및 코퍼스의 callosum에서 찾을 수 있습니다. 그러나, 우리는 신경 또는 oligodendrogenesis의 환율 유전자 변형의 효과를 확인하기 위해 기자의 표현을 사용하지 마십시오. 한편, 뇌량 따라서 표시된 표시되는 일부 세포 주입 과정 직접 감염의 결과 일 수 있고, 바늘 트랙 경로이고. V-SVZ에서 모든 세포 타입에 감염 될 수 있기 때문에, 한편, 표지 OB 뉴런 B1 셀 또는 음식물의 유전 적 변형의 결과인지를 구별 할 수 없다enitor 유도체. 단 ependyma 감염시킨 실험의 경우, B1 및 자손 세포는 리포터 표지되지 않으며, 따라서 신경 또는 oligodendrogenesis가 추적 될 수 없다. 그러나, 하나는 B1-NSC에게 OB 또는 oligodendrogenesis 뇌량에뿐만 아니라 감염된 마우스의 V-SVZ에서 천천히-분할 NSCs을의 증식 활동에 의존 신경을 분석 BrdU의 보존을 이용할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스의 BrdU 17 십일 정맥 주사로 감염 후 이전에 발행 프로토콜에 따라 21 일간 생존 수를 주입 할 수있다. V-SVZ에서 BrdU의 보존 활성화 B1 셀 (13)의 수의 추정치로 간주 될 수있는 반면 OB / 뇌량의 BrdU의 검출은, 신경 / oligodendrogenesis의 속도를 결정하는데 사용될 수있다. 여기에 설명 된 절차는 기능 획득 전 대한 관심의 유전자의 발현을 위해 사용될 수있다위한 실험뿐만 아니라 RNA 간섭 또는 CRE 재조합 효소의 전달을위한 기반 구조를 침묵의 전달에 사용될 수는 V-SVZ 세포에서 세균 라인 전송 floxed 대립 유전자를 불 활성화하는 구성한다. 렌티 단일 가이드의 RNA를 주입 Cre 호텔 의존 Rosa26 Cas9 올림피아 마우스 (25)와 조합하여 사용하는 경우 또한,이 기술은 또한 CRISPR 매개 게놈 편집에 사용될 수있다. 중요한 단계 1. 매우 작은 볼륨은 뇌 조직에 손상을주지 않고 stereotaxically 주입 할 수 있기 때문에, 렌티 바이러스 제조 및 조작의 특정 뇌 영역에 정맥 주사와 생체 내 유전자 전달 애플리케이션은 높은 역가 벡터 제제를 필요로한다. 렌티 바이러스 제제는 정맥 주사로 인해 일시적 공동 형질 감염 시스템에서 생성된다는 사실로 정제하여 효율적 뇌에 주입하기 전에 농축 할 필요가있다. 본원에 기술 된 절차를 따라서 모든 절차 바이오 레벨 2 인 것을바이러스의 조작이 BSL2 시설에서 수행해야합니다. 연구 인력이 적절하게 모든 절차에 자격과 훈련을해야합니다. 또한, 수술은 동물 복지에 대한 지방 자치 단체의 승인 루틴 다음 완전히 훈련 된 연구자에 의해 수행되어야하며, 바이오 안전성 수준이 지역에서 제대로 소독 장비와 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 동물의 수술 전 충분한 및 수술 후 관리가 수행되어야하며, 설립 수의학 의료 및 간호 관행에 따라야한다. 보다 구체적으로는, 모든주의 사항은 마취 및 진통제의 투여를 포함하여 동물에게 가해진 고통과 스트레스를 최소화하기 위해주의해야한다. 동물에서 바이러스의 사용에 관한 모든 단계는 제도적 당국의 승인과 지역 규정에 따라 수행해야합니다. 개인 보호 장비는 가운, 이중 장갑과 적절한 눈 보호를 포함하여 착용해야합니다. 지느러미동맹, 바이러스에 접촉되었을 수있는 모든 도구와 표면은 철저하게 (70 % 에탄올, 10 % 표백제 및 / 또는 고압 증기 멸균으로 닦아) 소독 관행을 승인 facility&#39;s에 따라 오염 제거해야합니다. 우리의 경험에서, 칼슘 포스페이트 형질 전환 방법은 293T 세포에 DNA를 도입하는 매우 효율적이고 저렴한 기술이다. 그러나 상용의 DNA 형질 전환 시약은 또한이 단계에서 제조사의 프로토콜에 따라 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 293T 세포의 미디어 교체 후 30 시간 동안 바이러스 상등액의 수집에 최적화되어 있습니다. 렌티 바이러스 상층 액을 24 수집 및 48 시간 미디어 교체 후 할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험에서 30 시간에서 단일 컬렉션 고역가 렌티 바이러스 벡터를 생산한다. 중요한 단계 2 : 수식을 사용하여 벡터 역가의 계산의 실제 예 : 세포 감염 X 희석 FA의 %의 GFP + / 100 × 번호ctor에 (DF) = 열 변환 단위 (TU) / ㎖. 이러한 예에서, 5 × 104 세포 (293T)은 105 세포의 형질 도입을 허용 전날 접종된다. 프로토콜에 기술 된 바와 같이 유동 세포 계측법하여 형질 세포의 %를 수득 한 후, 형질 도입 된 세포의 두 값이 전달 포화도 너무 낮도가되는 희석에 상응하는 이들의 계산을 위해 선택된다. 예를 들면 다음과 같습니다 희석 요인 10-6은 8.08 %의 세포가 감염 산출하고, 희석 배수 (10)는 -5 수율 61.78 %의 세포 감염. 역가 형질 세포 및 해당 희석 계수의 값을 이용하여 수식을 적용하여 렌더링 된 값의 평균이다. 이 예에서 : 희석 요인 10-6 = (8.08 / 100)에 대한 역가는 10 × 106 = 8.08 · 10 9 TU / ㎖을 X 희석 요인 10-5 = (61.78 / 100)에 대한 역가는 10 × 10 (5) X= 6.178 · 10 9 TU / ㎖ 평균 = (8.08 + 6.178) / 2] * 109 = 7.1 * 109 TU / ㎖ 중요한 단계 3 : 정위 주입. 여기에 설명 된 방법은 특정 위치에 정맥 주사 stereotaxically 안내 배달의 높은 역가의 낮은 볼륨의 사용에 의존한다. 이 프로토콜에 주어진 정위 좌표는 C57 / BL6 마우스 설립되었으며, 다른 마우스 변종에 적합하지 않을 수 있습니다. 정위 좌표는 종래 실험에 빠른 그린 등의 염료를 사용하여 각각의 균주 및 연령 결정되어야한다. 이를 위해, 염료를 주입하고, 마우스를 희생 한 후, 뇌를 추출하여 하나 hrat -20 ° C에 대해 고정된다. 뇌 경화 후에는 주사 부위에서 블레이드 슬라이스 및 주사 부위 특정 실험 목적을 위해 최적화되어 있는지 여부를 확인하기 위해 해부 현미경 하에서 관찰 될 수있다. 중요한 단계4 : 후 생존 시간. 후 생존 시간은 주사 부위에 따라 다릅니다. 장기 생존 시간은 뇌 조직과, 더 중요한 것은 60 일 후 RMS와 OB에서 관찰 된 세포가 상대적으로 대기 B1-NSCs을의 파생 상품은 사출 병변에서 복구 할 수 있습니다. 측면 뇌실에 주입 물리적으로 V-SVZ 해가되지 않습니다. 따라서, 15 일의 기간이 뇌실막 세포에서 유전자의 발현을 보장하기에 충분하다. 중요한 단계 5 : 후 고정 시간. 뇌 조직의 과도한 후 고정으로 인해 이러한 파라 포름 알데히드와 같은 시약의 가교 활동, 일부 항원의 마스크를 생성 할 수있다. 이러한 셀 구조를 보존에 좋지만 에피토프에 결합하는 항체를 방해 할 수있는 가교 일부 단백질의 항원 성을 감소시킬 수있다. 항원 검색 기술은 긴 정착 배양 시간이 존재하는 경우에 특히 요구 될 수있는 경우 또는 가교 (F)의 비율이 높은ixative이 사용됩니다. 또는, 1 시간의 사후 고정 짧은 기간의 조직 구조를 유지할뿐만 아니라 항원을 검색하는 절차를 사용하지 않고 세포 내의 양호한 항원 성을 보장하기 위해 우리의 경험에서 충분히 입증되었다.

뮤린 심실-뇌실 영역 (V-SVZ)는 선조체 대향 뇌실의 벽에서 매우 활성 종자 영역 인 후각 망울의 지속적인 생산 전구 세포 복제 및 분화 결과 연속 처리 (OB )의 interneurons 및 뇌량의 희소 돌기 아교 세포 (1). , 성상 세포 항원 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)을 표현하고 같은 네 스틴, Id1을 같은 세포 마커 줄기, 이러한 세포의 평생 세대는 신경 줄기 세포 (또한 B1 세포라고 NSCs을)이 지역의 존재에 의해 지원 될 것으로 보인다 및 Sox2이 2. B1 세포가 교통 전구를 증폭 전사가 Dlx2 요인 표현 (TAP) 세포 (C 세포) 생성 GFAP 발현 (말초없는 호 메오 박스 2) Ascl1 (포유류 achaete-schute 동족체 1) 그들이 야기하기 전에 신속하게 몇 번 분할 마이그레이션 neuroblasts (세포) 또는 oligodendroblasts 3. prolif 새로 생성하는 다각적 neuroblasts는 세분화 및 차별화 된 억제의 interneurons으로 사구체 층에 통합 OB에 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 형성, 전방으로 이동한다. 이주 젊은 oligodendroblasts는 로컬 분할 또는 성숙 myelinating의 희소 돌기 아교 세포 1,4로 분화 계속 미숙 NG2 양성 세포가 CC로 이동합니다. 태아 방사형 신경 교세포에서 파생 B1 세포는, 그들의 전임자의 연장 및 편광 형태를 유지하고 자신의 틈새 고도로 전문화 된 관계를 나타낸다. 그들은 어느 선 심실과 V-SVZ 틈새 시장을 관개 혈관의 네트워크까지 ependyma 사이에 걸쳐. 자신의 기초 과정은 나에이 틈새 결말을 관개 평면 혈관 신경 얼기에 접근하는 긴 거리를 확장하는 반면 multiciliated ependymocytes 중 B1 세포하게 인터의 작은 혀끝의 과정과는 단일 비 운동성이 차 섬모에 종료총 모세관 2,5-8의 ASAL의 얇은 판. 그대로 V-SVZ 틈새에도 GFAP + 아르 비 신경 인성 성상 세포,에서 B1-NSCs을 구별하는 가장 신뢰할 수있는 방법을 기반으로 한 후 3 차원 공 초점 현미경에 의한 심실 측벽의 준비 및 분석을 전체 마운트 GFAP에 대한 면역 염색은 세포막을 묘사하기 위해 얇은 B1-NSC 혀끝의 과정, β-catenin이 레이블, 각 섬모 5,8의 범위를 라벨을 cilial 기초 단체 또는 아세틸 화 α-튜 불린의 마커로 γ-tubulin의 하나입니다. 심실 표면에서 이러한 전체 마운트 관찰 B1과 뇌실막 세포는 하나 또는 여러 개의 GFAP + B1 셀의 uniciliated 혀끝의 프로세스가 multiciliated 뇌실막 세포의 장미에 의해 둘러 쌓여되는 &quot;바람개비&quot;5 배열되어 있음을 지적했다. B1 세포의 특성 형태는 실험적 증거와 상관 관계 전NSCs의 2,6,9-11에 작용하는 수용성 신호의 조절 소스를 구성하며 그 혈관 / 내피 세포를 ndicating 및 뇌척수액 (CSF)를 심실. 심실 표면, 동형 및 뇌실막 및 B1 셀을 포함하는 이형 apico-측면의 상호 작용에 꽉 접합 및 adherens 접합 5,12-을 포함한다. 또한, 이러한 N 헤린 및 V-CAM 등 B1 및 뇌실막 세포 사이의 접합부 복합체에 관여 부착 분자는 V-SVZ 틈새 B1의 고도로 조직화 된 위치뿐만 아니라 조절하는 것으로 알려져 왔지만, 또한 정지 12 13. -B1 뇌실막 세포 단층은 확산 CSF로부터 물 및 작은 분자 조절 플럭스 배리어 허용하지만, 많은 단백질 10,11의 세포 간 통로를 제한하는 역할을 보인다. 실험 증거는 고유 위치 B1 셀 혀끝의 섬모가 CSF 2에 존재하는 폴리 펩타이드 신호의 센서로 역할을 할 수 있음을 나타냅니다5-7. 뇌실막 세포 자체, NSC 동작 14,15의 조절에서 역할 용해성 막 결합 신호 또한 소스이다. 예컨대 브로 모 우리 딘 (BrdU의) 또는 레트로 바이러스 뉴 클레오 시드가 추적 가능한 널리 생체에 포함 NSCs의 전구 세포를 라벨 사용되어왔다. BrdU의 신호가 반복 세포 분열 및 레트로 바이러스를 통해 희석 우선적으로 전달 (16, 17)에 대한 세포 증식 자신의 요구에 의한 세포를 증폭 일시적 대상으로 표시하기 때문에,이 방법은 장기간의 운명 추적을위한 최적되지 않습니다. 틈새 구성 요소와 상호 작용을 포함하여 생체 내에서 NSC의 생리를 조사하기 위해, 라벨 및 B1-NSCs을 크게 대기하고 자신의 주변 뇌실막 세포 생리 학적 조건 3에서 분할 결코로, 거의 구분되지 세포를 추적하는 방법을 설정하는 데 매우 중요합니다. 여기서는 렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)을 고효율 유전자 마크 있도록 보여ING와 능력 형질 도입하고 세포주기 독립적 인 방식으로 표적 세포의 게놈에 통합이 가장 합리적으로 인해 성인 NSCs의 비 분할 뇌실막 세포의 장기 수정. 또한, 우리는 배달 및 바이러스 역가 도움의 경로를 구체적으로하여 NSCs의 틈새 시장에 의존, 뇌실막 효과의 분석을 가능하게 B1 셀을 뇌실막 세포를 형질 도입,하지만하는 방법을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XL-100K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>358126</td>
			<td>25X89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326819</td>
			<td>13X51 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge adapters</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>358156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>PLC-20101</td>
			<td>100x20 style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Afora</td>
			<td>DE400800</td>
			<td>12x75 mm, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cup sterile FACS filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>340626</td>
			<td>30 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &#956;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Blue laser 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>FPE-204-500&#160;</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12251</td>
			<td>Core packaging plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV.REV plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12253</td>
			<td>Core packaging plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2G plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td>Envelope plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12252</td>
			<td>Transfer vector plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0101-500</td>
			<td>For HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>For 293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,&#160; DNAse/RNAse-free, 0.2 &#181;m sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X HBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B-500</td>
			<td>Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100</td>
			<td>Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td>Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline&#160; (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde EM grade 16%</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.leicabiosystems.com/">Vernier stereotaxic instrument</a></td>
			<td>NeuroLab, Leica</td>
			<td>39463001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cunningham mouse and neonatal rat adaptor</td>
			<td>NeuroLab, Leica</td>
			<td>39462950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe holder</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS-311-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>P/N&#160;&#160;&#160; 84851/00</td>
			<td>#85RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric drill</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>98096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal blanket</td>
			<td>Ufesa</td>
			<td>AL5512/01</td>
			<td>230-240 V, 100-110 W, type C_AL01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver&#160;</td>
			<td>Jata</td>
			<td>MP373N</td>
			<td>Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Esteve</td>
			<td>DOMTOR&#160;</td>
			<td>Comercial solution at 1 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalgene 500&#160;</td>
			<td>Comercial solution at 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidina/ketamine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>Torbugesic</td>
			<td>Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Esteve</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% saline solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td>13465412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>Topical skin adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HydroGel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td>11x21 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach/Virkon</td>
			<td>Dupont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical marker pen</td>
			<td>Staedler</td>
			<td>313-9</td>
			<td>Permanent lumocolor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant &#160;</td>
			<td></td>
			<td>SICCAFLUID</td>
			<td>0.5 g/dosis, carbomer 974P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td>694109.6</td>
			<td>10% povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Part 3: Histological analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-07524-55</td>
			<td>Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump head</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-07518-00</td>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube</td>
			<td>Cole-Parmer Inst. Co.</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Platinum L/S 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalp vein set</td>
			<td>Vygon V-green</td>
			<td>70246.05T</td>
			<td>25G, 30 cm tube length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FluoView FV10i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Tehtnica</td>
			<td>SHP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141451.1211</td>
			<td>Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55&#8211;60 &#176;C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.9% NaCl in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>LOCTITE</td>
			<td>767547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122712.1608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP rabbit antibody</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-215</td>
			<td>Use at a 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Use at a 1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td>Mounting medium for fluorescent preparations</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stable and efficient genetic modification of cells in the adult mouse v-svz for the analysis of neural stem cell autonomous and non-autonomous effects

상대적으로 대기 체세포 줄기 세포는 대부분의 성인 조직에서 평생 세포 재생을 지원합니다. 성인 포유류 뇌의 신경 줄기 세포는 두 가지 특정 신경 인성 틈새로 제한됩니다 해마의 치아 이랑과 심실-뇌실 영역의 subgranular 영역, 측면의 벽 (V-SVZ는 subependymal 영역 또는 SEZ라고도 함) 심실. 장기 줄기 세포에서 원하는 유전자의 발현 및 유래 자손 결과 성체 줄기 세포 집단에 대한 생체 내 유전자 전달 전략의 개발 (즉, 포유 동물의 뇌들)은 현재 생물 의학 및 생명 공학 연구에서 중요한 도구이다. 여기서, 직접 생체 내 방법은 정맥 주사에 의한 세포주기 독립적 감염 V-SVZ 틈새 고도로 전문화 cytoarchitecture 활용 성인 마우스 V-SVZ 세포의 안정한 유전 적 변형을 위해 제공된다. 구체적으로는, 현재 프로토콜을 포함V-SVZ 자체 하나에 특정 유전자의 발현 카세트를 인코딩 빈 정맥 주사 (제어) 또는 정맥 주사의 주입은 뇌실막의 타겟팅, 생체 내 틈새에있는 세포의 모든 유형의 타겟팅, 또는 측면 뇌실 루멘으로,이야 세포 만. 발현 카세트는 허용, 또한 정맥 주사에​​ 의해 코딩되는 형질 세포 및 형광 단백질의 게놈 내로 통합되는 표지화 된 세포 및 세포 자율 및 비 - 자율 틈새 의존적 효과 분석 형질 세포의 검출 그들의 자손.

LV - 매개 유전자 전달 시스템은 증식, 이동 및 분화 중에 그들의 추적 및 유전 적 변형을 허용 성인 마우스 V-SVZ 세포의 생체 내 전달에 장기간 사용할 수있다. 감염과 표현은 매우 효과적이며, 기자가 포함의 식으로 다른 감염되지 않은 세포들 사이를 쉽게 구별 할 수있는 다수의 세포를 얻을. 우리는 지금까지 보편적으로 발현 포스 포 키나제 프로모터에 의해 구동 GFP 형광 리포터 형질 세포를 시각화했지만, 다른 리포터 나 표지 단백질이 또한 사용될 수있다. 우리는 일상적으로 대신이 강한 형광 신호를 산출으로 기자 방출의 직접 검출에 의존 GFP에 대한 항체를 사용합니다. 또한, 뇌 신선한 해부 및 정착에 몰두하지만, 훨씬 더 나은 결과를 transcardial 관류에 의해 얻어진다 될 수있다. 정제, 농축 벡터 주식은 내가 천천히입니다줄무늬와 한계에 V-SVZ에 정위지도하에 njected (도 2a, b)에 나타낸다. 두 달 주사 후 수많은 GFP + 세포는 V-SVZ 및 주사 부위에서 대략 1mm 반경에서 발견되었다 (도 2a, b). (;도 15 참조 그림 2C) 뇌실막 세포에 의한 기자의 V-SVZ 및 발현 세포의 모든 종류의 전달에 정맥 주사 결과에 감염 정맥 주사가 효율적으로 비 분열하는 세포를 타겟팅 할 수 있음을 나타냅니다. V-SVZ에서 GFP 라벨링 패턴 이주 18 후 발견 된 것과 유사 하였다. 장기간의 수술로 부상 입은 조직을 회복 할 수 있으므로 조직 반응의 흔적은, 그러나, 포스트 분사 2개월 검출이 없었다. 2 개월의 기간 동안 TAP 감염된 세포 향해 OB 영역을 이전 A-neuroblasts로 진행. 이 프로세스는 GFP의 며칠 3 존재 걸리므RMS 60 일 neuroblasts을 + 감염은 정맥 주사는 신경 인성 B1-NSCs을 (그림 2D)을 대상을 나타냅니다 후. B1, C의 전달 및 OB (도 2E) 주사 수율의 GFP +의 interneurons시 세포. 높은 역가의 작은 부피의 주입 ependymocytes 만 (그림 2 층-H)의 감염 측면 뇌실 결과에 LV의 주식을 집중. 단백질 S100β 바인딩 칼슘을 포함 대부분의 뇌실막 세포는 감염 (그림 2I)에서 15 일 후 기자를 표현한다. V-SVZ / 선조체 한도 내로 주입 달리 어떠한 GFP + 세포 subependymally 위치하거나 관찰 절차 (도 2H, J)를 사용하여 RMS 또는 OB이다. 설명 된 바와 같이 감염의 유형 모두 V-SVZ 관통 부에서 분석 될 수있다. 그들은 또한 분석 할 수있는 측면 통풍구의 준비를 전체 마운트ricle 벽 (8 프로토콜 참조). 최근에, 우리는 ependymocytes에 B1 세포의 N-cadherin의 매개 세포 - 세포 접착가 정지를 조절하는 방법을 설명했다. 우리는 N-cadherin의 불 활성화의 결과 도미넌트 네거티브 구조 헤린 반송 정맥 주사를 제공하기 위해 여기에 설명 된 절차를 사용 하였다. 우리 NSCs의 및 뇌실막 세포 또는 뇌실막 세포에서 N-cadherin의 손실만을 동형 세포 - 세포 상호 작용의 붕괴로 인해 NSCs의 수 및 세포주기 항목의 증가를 촉진한다는 증명 하였다 (도 3A, B; ) 15을 참조하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53282/53282fig2.jpg" /> 그림 2 : 주입 된 쥐의 섹션에서 면역 형광에 의해 기자 검출 성인 서브 심실 영역 틈새 시장의 () 도식 표현.. 휴대 componen의 단순화틈새 시장의 TS가 도시되어있다. B1 셀은 편광이고 틈새 특수한 관계를 나타낸다. 그들은 어느 선 심실과 V-SVZ 틈새 시장을 관개 혈관의 네트워크까지 ependyma 사이에 걸쳐. 자신의 기초 과정은 총 모세 혈관의 기저 얇은 판으로 끝나는이 틈새 시장을 관개 평면 혈관 신경 얼기에 접근하는 확장 반면 multiciliated ependymocytes 중 B1 세포하게 인터의 작은 혀끝의 과정과는 단일 비 운동성이 차 섬모의 끝납니다. B1 셀 유도체는 적극적으로 혈관의 환경과 틈새 성상 세포와 접촉 후각 전구으로 neuroblasts의 마이그레이션 체인에서 증식 중간 조상이다. 반구 통해 관상 단면 (b) 회로도 주입 레벨 V-SVZ / 선조체 경계에 주입 용 주사기 바늘의 위치를 나타내는. (c) 현미경 개략적 STA에 나타내는 동일한 레벨에서 찍은(; 왼쪽 회색)와 GFP의 면역을위한 DAPI와 함께 리트 (녹색, 오른쪽) 육십일 주사 후. 점선은 뇌량의 한계를 나타냅니다. (d) 상기 V-SVZ를 통해 코로나 섹션의 V-SVZ 부근 또는 줄무늬 테두리에 주입 된 GFP 기자의 면역 검출의 높은 배율. 점선은 V-SVZ의 한계를 나타냅니다. 많은 세포가 V-SVZ 틈새 시장에 감염되어 있습니다. 뇌실막 세포 심실 루멘을 한정 입방 셀들로 인식 할 수있다. (마) GFP (녹색)에 대한 면역 형광 및 neuroblast 마커 PSZ-NCAM (빨간색). 육십일 전에 감염 NSCs의에서 neuroblasts의 생성을 나타내는 이중 양성 세포의 존재를합니다. 화이트 화살촉은 neuroblasts에서 가리 킵니다. 세트는 흰색 사각형 내에 둘러싸인 영역에 해당합니다. 분사의 수준과 위치를 나타내는 하나의 반구를 통해 (f)의 관상 단면의 도식측면 뇌실에 주입 용 주사기 바늘. (녹색, 오른쪽) (왼쪽 회색)와 GFP의 면역에 대한 (g) 현미경 DAPI로 염색 설계도에 표시된 동일한 수준에서 찍은 십오일 주사 후. 점선은 뇌량의 한계를 나타냅니다. (H)을 통해 V-SVZ 관상 섹션 뇌실 주입 GFP 리포터의 면역 검출 고배율. 점선은 V-SVZ의 한계를 나타냅니다. 만 뇌실막 세포가 감염되어 있습니다. GFP에 대한 - (I J) 면역 형광 및 뇌실막 세포 마커 S100β. 지느러미 (i) 및 복부 (J) V-SVZ을 따라 다수의 이중 양성 세포의 존재를합니다. 선조체 실질의 성상 세포에서 화살촉 점, 또한 S100β으로 표시. 케이. GFP 및 면역 (GRE, DAPI (왼쪽 회색)로 염색 OB 통해 코로나 섹션엉; 오른쪽) 육십일 V-SVZ / 선조체 주입 후 흰색 사각형으로 둘러싸인 지역. 수많은 레이블 뉴런을 알 수 있습니다. (녹색, 오른쪽) GFP 및 면역 (L) DAPI로 염색 OB 통해 코로나 섹션 (왼쪽 회색) 사십오일 측면 뇌실 주입 후 흰색 사각형으로 둘러싸인 지역입니다. 표지에는 OB 뉴런이 없음을 알 수 있습니다. CX, 대뇌 피질; 정맥 주사, 측면 뇌실; STR, 줄무늬; GL, 사구체 층; GCL, 과립제 전지 층; MCL, 승모판 세포 층. 스케일 바 : C, G = 500 μm의; D는, E는 10 μm의 HJ =; KL = 250 μm의; 100 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53282/53282fig3.jpg" /> 그림 3 :. 성인 NSCs을 더 적극적으로 그들의 틈새에서 분리 될 때 증식 () 빈 정맥 주사 (상단 패널) 또는 정맥 주사 카의 선조체 주사를받은 쥐의 V-SVZ를 통해 섹션 공 초점 현미경LV 리포터 GFP (녹색), NSC 마커 GFAP (적색), 세포주기 마커 사료된다 (시안), 및 DAPI (청색)의 검출 60 일 이후에 대한 면역 염색 도미넌트 네거티브 헤린 구조체 (하단 패널) 잉 감염. (우측 회색) 각 마커에 대한 독립적 인 패널이 표시됩니다. (b)는 LV 기자 GFP의 검출을위한 면역 염색 측면 뇌실에 지배적 인 음성 cadherin의 구조 (하단 패널)을 들고 빈 정맥 주사의 주사 (상단 패널) 또는 정맥 주사를받은 쥐의 V-SVZ를 통해 섹션 공 초점 현미경 (녹색), NSC 마커 GFAP (적색), 세포주기 마커 사료된다 (시안), 및 DAPI (청색), 감염 후 15 일입니다. (우측 회색) 각 마커에 대한 독립적 인 패널이 표시됩니다. 흰색 화살표는 GFAP / GFP 더블 양성 세포를 가리과 흰색 화살촉은 그 핵이 두 경우 모두에 노란색 별표로 표시됩니다 GFAP / 사료된다 / GFP 트리플 양성 세포에 가리 킵니다. 정량 분석​​이 더 자전거 NSCs의를 표시 할 때 N-CAD재 산 수준은 NSCs을 자신이나 만 뇌실막 세포 (15)에 감소했다. 규모 : 10 μm의.

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Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

stable-efficient-genetic-modification-cells-adult-mouse-v-svz-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K 조회수.  Spanish National Cancer Research Centre (CNIO). Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.