El ácido hialurónico es una de las matrices extracelulares más abundantes en el modelo animal. Se ha demostrado la importancia del ácido hialurónico en el desarrollo embrionario. Este modelo in vitro es útil para explorar cómo las células de la cresta neural se adhieren y migran dentro de la matriz extracelular rica en ácido hialurónico.
Con nuestra técnica, podemos evaluar la migración y la capacidad de degradación de HA tanto de la población mayorista como de las células individuales a lo largo del tiempo. Además, esta técnica se puede utilizar para la detección de drogas para encontrar compuestos que aceleren o prevengan la degradación de HA. Para comenzar, diluya la matriz de la membrana basal con PBS refrigerado en una proporción de 1:50 y manténgala en hielo.
Cubra una placa de cultivo de 10 centímetros con 10 mililitros de la solución de matriz diluida e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS. Para cultivar las células O9-1 en la placa recubierta de matriz, caliente el tallo embrionario completo o el medio de células madre embrionarias en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Mezcle suavemente la suspensión de celdas O9-1 y cuente el número de celdas usando un contador de celdas automatizado. Luego ajuste la concentración celular a 1.1 millones de células por mililitro con el medio completo de células ES. Agregue ocho mililitros de medio celular ES completo precalentado a la placa de cultivo de 10 centímetros recubierta de matriz y siembre las células O9-1 a 1.1 millones de células por placa.
Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio de células madre embrionarias completo fresco precalentado a 37 grados centígrados. Reemplácelo con medio fresco cada dos o tres días a partir de entonces.
Lave la placa de cultivo con dos mililitros de PBS y luego agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% precalentado. Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Agregue dos mililitros de medio celular ES completo precalentado a la placa de cultivo y transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 300 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Agregue dos mililitros de medio celular ES completo precalentado al tubo y resuspenda completamente las células mediante pipeteo. Luego siembra las células en una nueva placa de cultivo con la densidad celular deseada.
Agregue cuidadosamente 50 microlitros de trietoxisilano sin diluir a un plato con fondo de vidrio de 3,5 centímetros e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave el plato tres veces con dos mililitros de agua destilada y agregue 50 microlitros de glutaraldehído al 0,25% diluido 100 veces en PBS por plato. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego lavar cuatro veces con dos mililitros de PBS y cubrir los platos con 300 microlitros de colágeno tipo uno en 0,2 ácido acético normal a temperatura ambiente durante una hora.
Nuevamente, lave tres veces con dos mililitros de PBS. Agregue 300 microlitros de 200 microgramos por mililitro de fluoresceinamina, etiquetado hialuronato de sodio H2 a cada plato e incube durante la noche a temperatura ambiente. Lavar de nuevo con dos mililitros de PBS tres veces.
Después de secar el plato con fondo de vidrio recubierto, conecte los dos insertos de cultivo de pozo a los platos y llene los insertos externamente con un mililitro de PBS. Siembre las células O9-1 en los pocillos a 10, 000 células en 100 microlitros de DMEM que contienen 2% de suero bovino fetal o FBS por inserto. Cultive las células durante dos días a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%, capture imágenes de contraste de fase como punto de inicio, utilizando un microscopio de fluorescencia todo en uno.
Retire las inserciones cuidadosamente de los platos con fondo de vidrio recubierto con pinzas y lave suavemente los platos con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS para eliminar las células y los desechos celulares. Agregue dos mililitros de DMEM fresco que contenga 2% de FBS en los platos cultivados. Cultive las células durante 48 horas adicionales a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y capture imágenes de contraste de fase después de 24 horas y 48 horas en cultivo.
Lave los platos con PBS y fije las células después de 48 horas con un mililitro de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego lave los platos tres veces durante cinco minutos cada una con un mililitro de PBS fresco. Finalmente, coloque un cubreobjetos con el medio de montaje para una mayor observación morfológica.
Las secciones transversales del tubo neural de los embriones bandera de Tmem2 en E9.0 se muestran en esta figura. Las secciones en los niveles craneal y troncal del tubo neural fueron doblemente marcadas para la proteína bandera Tmem2 y el hialuronano. La expresión de Tmem2 se observó en la placa neural y la región fronteriza del tubo neural, mientras que estos sitios carecían de tinción de hialuronano.
Aquí se muestra el doble etiquetado de las celdas de la cresta neural para la bandera Tmem2 y Sox9. Las secciones transversales del tubo neural E9.0 se tiñeron para la bandera Tmem2 y Sox9. En esta figura se muestran las imágenes representativas de células de O9-1 agotadas y control de Tmem2 cultivadas en una placa de cultivo regular.
La expresión de Tmem2 en estas células se evaluó mediante qPCR con GAPDH como control interno para la normalización. Las células O9-1 agotadas y controladas de Tmem2 se cultivaron durante 48 horas en hojas de cubierta de vidrio recubiertas con hialuronano fluorescente. La actividad degradante del hialuronano se revela como áreas oscuras en el fondo fluorescente.
El nivel de degradación del hialuronano también se comparó cuantitativamente entre las células de O9-1 de control y las células de control de O9-1. La degradación del hialuronano unido al sustrato en las adherencias focales en las células O9-1 se muestra en esta figura. Las células O9-1 cultivadas en sustratos mixtos que consisten en Col1/HA fueron inmunomarcadas con un anticuerpo anti-vinculina.
Las manchas oscuras o rayas representan la actividad de degradación del hialuronano en el sustrato FAHA H2. Los sitios de degradación del hialuronano y las adherencias focales se colocalizaron en los sustratos mixtos. El recubrimiento de Coval de los platos con fondo de vidrio con HA es un paso crítico en el protocolo porque un recubrimiento inadecuado puede resultar en que el HA se elimine fácilmente por fuerza mecánica durante la adhesión y la migración.
Para garantizar un recubrimiento adecuado, utilizamos glutaraldehído, colágeno tipo uno químicamente inmovilizado al vidrio a través del acoplamiento armado al aldehído. Es posible utilizar sustrato de matriz extracelular además de colágeno tipo uno, pero deben tener grupos armantes y puede haber limitaciones en el recubrimiento de coval en platos con fondo de vidrio debido a sus propiedades químicas. Por lo tanto, el ensayo y error puede ser necesario para determinar el mejor enfoque.
Este experimento de laboratorio puede ser útil para estudiar cómo funcionan ciertas moléculas durante el movimiento de las células de la cresta neural en el entorno HA o HA alrededor del tubo neural. También podría ser una forma útil de probar un medicamento que podría acelerar o prevenir este proceso de migración. Es interesante saber por qué Tmem2 tiene tanto las funciones de adhesión sobre HA como la degradación de HA y por qué HA necesita ser degradado en el sitio de cohesión completa.
Dado que HA es la sustancia más común en la matriz extracelular, averiguar la respuesta a esta pregunta es realmente importante en biología y medicina. Este protocolo experimental es valioso porque se puede aplicar a varios tipos de células, incluidos fibroblastos de la piel, células epiteliales y células cancerosas.
