Hyaluronsäure ist eine der am häufigsten vorkommenden extrazellulären Matrizen im Tiermodell. Die Bedeutung von Hyaluronsäure für die Embryonalentwicklung wurde nachgewiesen. Dieses In-vitro-Modell ist nützlich, um zu untersuchen, wie Neuralleistenzellen in der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix haften und wandern.
Mit unserer Technik können wir die Migration und die HA-Abbaufähigkeit sowohl der Großbevölkerung als auch einzelner Zellen im Laufe der Zeit bewerten. Darüber hinaus kann diese Technik für das Wirkstoffscreening verwendet werden, um Verbindungen zu finden, die den HA-Abbau beschleunigen oder verhindern. Verdünnen Sie zunächst die Basalmembranmatrix mit gekühltem PBS im Verhältnis 1:50 und bewahren Sie sie auf Eis auf.
Bestreichen Sie eine 10 Zentimeter große Kulturplatte mit 10 Millilitern der verdünnten Matrixlösung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Teller dreimal mit zwei Millilitern PBS. Um die O9-1-Zellen auf der matrixbeschichteten Platine zu kultivieren, wird das gesamte embryonale Stamm- oder ES-Zellmedium in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius erwärmt.
Mischen Sie die O9-1-Zellsuspension vorsichtig und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Stellen Sie dann die Zellkonzentration mit dem kompletten ES-Zellmedium auf 1,1 Millionen Zellen pro Milliliter ein. Geben Sie acht Milliliter vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die matrixbeschichtete 10-Zentimeter-Kulturplatte und säen Sie die O9-1-Zellen mit 1,1 Millionen Zellen pro Platte.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes ES-Zellen-Komplettmedium. Danach alle zwei bis drei Tage durch frisches Medium ersetzen.
Waschen Sie die Kulturplatte mit zwei Millilitern PBS und fügen Sie dann zwei Milliliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA hinzu. Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium auf die Kulturplatte und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes ES-Komplettzellmedium in das Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren gründlich. Anschließend werden die Zellen auf einer neuen Kulturplatte mit der gewünschten Zelldichte ausgesät.
50 Mikroliter unverdünntes Triethoxysilan vorsichtig in eine 3,5 Zentimeter große Glasbodenschale geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Waschen Sie die Schüssel dreimal mit zwei Millilitern destilliertem Wasser und fügen Sie 50 Mikroliter 0,25%iges Glutaraldehyd, 100-fach verdünnt in PBS, pro Schüssel hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann viermal mit zwei Millilitern PBS waschen und das Geschirr eine Stunde lang mit 300 Mikrolitern Kollagen Typ eins zu 0,2 normaler Essigsäure bei Raumtemperatur bestreichen.
Auch hier dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen. 300 Mikroliter von 200 Mikrogramm pro Milliliter Fluoresceinamin, markiert als Natriumhyaluronat H2, in jede Schale geben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen.
Befestigen Sie nach dem Trocknen der beschichteten Glasbodenschale die beiden Wellkultureinsätze an den Schalen und füllen Sie die Einsätze außen mit einem Milliliter PBS. Säen Sie die O9-1-Zellen mit 10.000 Zellen in 100 Mikrolitern DMEM, die 2 % fötales Kälberserum oder FBS pro Einsatz enthalten, in die Vertiefungen. Kultivieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, nehmen Sie Phasenkontrastbilder als Startzeitpunkt mit einem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop auf.
Entfernen Sie die Einsätze vorsichtig mit einer Pinzette von den beschichteten Glasbodenschalen und waschen Sie die beschichteten Glasbodenschalen vorsichtig mit zwei Millilitern PBS, um die Zellen und Zellrückstände zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter frisches DMEM mit 2 % FBS in die kultivierten Gerichte. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und nehmen Sie nach 24 Stunden und 48 Stunden in Kultur Phasenkontrastbilder auf.
Spülen Sie das Geschirr mit PBS und fixieren Sie die Zellen nach 48 Stunden mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie dann das Geschirr dreimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter frischem PBS. Zum Schluss legen Sie ein Deckglas zur weiteren morphologischen Beobachtung auf das Eindeckmedium.
Querschnitte des Neuralrohrs von Tmem2-Flag-Embryonen bei E9.0 sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Schnitte auf Schädel- und Rumpfebene des Neuralrohrs waren doppelt markiert für das Tmem2-Flag-Protein und Hyaluronsäure. Die Expression von Tmem2 wurde in der Neuralplatte und im Grenzbereich des Neuralrohrs beobachtet, während diese Stellen keine Hyaluronsäurefärbung aufwiesen.
Die Doppelmarkierung der Neuralleistenzellen für Tmem2 flag und Sox9 ist hier dargestellt. Querschnitte des Neuralrohrs E9.0 wurden für Tmem2 flag und Sox9 gefärbt. Die repräsentativen Bilder von Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen, die auf einer normalen Kulturschale kultiviert wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt.
Die Expression von Tmem2 in diesen Zellen wurde mittels qPCR mit GAPDH als interne Kontrolle zur Normalisierung evaluiert. Tmem2-depletierte und Kontroll-O9-1-Zellen wurden 48 Stunden lang auf Glasdeckgläsern kultiviert, die mit fluoresceinierter Hyaluronsäure beschichtet waren. Die Hyaluronsäure-abbauende Aktivität zeigt sich in dunklen Bereichen im fluoreszierenden Hintergrund.
Der Grad des Hyaluronsäureabbaus wurde auch quantitativ zwischen Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen verglichen. Der Abbau von substratgebundener Hyaluronsäure an den fokalen Adhäsionen in O9-1-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt. O9-1-Zellen, die auf gemischten Substraten aus Col1/HA kultiviert wurden, wurden mit einem Anti-Vinkulin-Antikörper immunmarkiert.
Die dunklen Flecken oder Streifen stellen die Abbauaktivität von Hyaluronsäure im FAHA H2-Substrat dar. Die Stellen des Hyaluronsäureabbaus und der fokalen Adhäsionen wurden auf den gemischten Substraten kolokalisiert. Die Coval-Beschichtung der Glasbodenschalen mit HA ist ein kritischer Schritt im Protokoll, da eine unzureichende Beschichtung dazu führen kann, dass die HA während der Adhäsion und Migration leicht durch mechanische Kraft entfernt werden können.
Um eine ordnungsgemäße Beschichtung zu gewährleisten, verwenden wir Glutaraldehyd, chemisch immobilisiertes Kollagen vom Typ eins, das über eine scharfe Kopplung an den Aldehyd an das Glas angeschlossen wird. Es ist möglich, extrazelluläres Matrixsubstrat neben Kollagen vom Typ eins zu verwenden, aber sie müssen Scharfschaltungsgruppen haben und es kann aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften Einschränkungen geben, sie auf Glasbodenschalen zu beschichten. Es kann also notwendig sein, Versuch und Irrtum zu finden, um den besten Ansatz zu finden.
Dieses Laborexperiment kann hilfreich sein, um zu untersuchen, wie bestimmte Moleküle während der Bewegung von Neuralleistenzellen in die HA oder HA-Umgebung um das Neuralrohr herum funktionieren. Es könnte auch ein nützlicher Weg sein, um Medikamente zu testen, die diesen Migrationsprozess entweder beschleunigen oder verhindern könnten. Es ist interessant zu wissen, warum Tmem2 sowohl die Funktionen der Adhäsion über HA als auch des Abbaus von HA hat und warum HA an der vollständigen Kohäsionsstelle abgebaut werden muss.
Da HA die häufigste Substanz in der extrazellulären Matrix ist, ist es in der Biologie und Medizin sehr wichtig, die Antwort auf diese Frage herauszufinden. Dieses experimentelle Protokoll ist wertvoll, weil es auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann, darunter Hautfibroblasten, Epithelzellen und Krebszellen.
