우리는 그녀의 지원에 대 한 Gundula Hertl를 인정 하 고 싶습니다.

이 프로토콜의 모든 절차는 독일 동물 복지 법률과 지침에 의해 승인 되었습니다. 10 월에 12 주 된 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 마우스를 사용 하 여 고려 (기증자: 오래 된 여성, 받는 사람: 남성) 실험을 통해. 섬 격리 NMRI 누드 마우스를 사용 합니다. 로컬 동물 시설 규정에 따라 정의 된 조건 하에서 생쥐를 유지 합니다.
1입니다. 당뇨병 Streptozotocin으로 유도
<ol><li>-4 일에 10 ~ 12 주 된 NMRI 누드 마우스 및 무게 기계를 사용 하 여 C57Bl/6 쥐의 몸 무게를 측정 합니다.</li>
	<li>측정 된 몸 무게에 따라 마우스 당 염 분의 0.1 ml에서 streptozotocin의 180 mg/kg의 복용량을 준비 합니다. 참고: Streptozotocin 해야 갓 사용 하기 전에 준비 되며, 그것은 빛에 민감한 알루미늄 호 일로 덮여.</li>
	<li>Syngeneic 및 수용자 마우스 각각 streptozotocin (180 mg/kg)의 0.1 mL의 단 하나의 복용량 intraperitoneally 26 G 바늘을 사용 하 여 주사.</li>
	<li>날-3,-2와-1 비 단식 쥐의 꼬리 정 맥을 puncturing 의해 2-4 µ L의 혈액을 수집 합니다.</li>
	<li>테스트 스트립 당 혈액 샘플의 2-4 µ L를 사용 하 여 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 쥐에서 혈당을 측정 참고:이 시점에서 쥐의 80% 해야 될 당뇨병 (20 mmol/L).<ol>
<li>그들의 혈액 포도 당 수준을 20 mmol/l.에 도달 작은 섬이 식을 위한 마우스를 사용</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 쥐에서 췌 장 독도의 격리
<ol><li>26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize. 참고: 마 취 제 및 xylazine의 볼륨 (0.10 mL/10 g) 동물의 몸 무게에 따라 결정 됩니다.</li>
	<li>부정사 위치에 쥐를 유지 하 고 소독 povidone-요오드 솔루션. 페달 반사를 확인 하 여 적절 한 안락사를 확인 합니다. 참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.</li>
	<li>피부 미세 집게로 잡고 고 중간 절 개를가 위로 복 부 구멍을 폭로. 멸 균 거 즈 압축에 내장 사이트 왼쪽 및 복 부 구멍의 외부를 배치 합니다.</li>
	<li>췌 장 및 다른 관련 된 위치를 다른 방향으로 위 조정 조직.</li>
	<li>대동맥에 도달 하 고 혈액을 배수 하기 위하여 작은 상처를. 멸 균 거 즈를 사용 하 여 혈액 흡수에 대 한.</li>
	<li>조심 스럽게 소장 제거. 위장과 비장 췌를 구분 합니다.</li>
	<li>삭제할 췌 하 고 신선한 페 트리 접시에 두십시오. 지방, 집게를 사용 하 여 같은 모든 원치 않는 자료를 제거 합니다.</li>
	<li>콜라의 4 mL와 5 mL 주사기를 췌 26 G 바늘으로 주입 (재고 솔루션: 행 크의 솔루션의 12 mL에서 콜라의 30 밀리 그램).</li>
	<li>향상 된 소화와 12 mL 빨간 모자 튜브에 대 한 표면적 증가 위 췌를 말하다. 참고: 행 크의 균형 소금 솔루션: HBSS 10 배 (100 mL), 페니실린-스 (10 mL), Gentamycin (1 mL), Ciprofloxacin (10 mL), HEPES (35 mL), 소 주 H2O (900 mL)</li>
	<li>떨고 물 욕조에 37 ° C에서 10 분을 소화를 수행 합니다. 와 15에 대 한 일정 한 간격에 몇 번이 고 샘플 동 s.</li>
	<li>3 분 동안 손으로 소화 췌를 적극적으로 혼합 하 고 10 얼음에 s.</li>
	<li>소화 반응 및 실 온에서 3 분 560 x g에서 원심 분리기를 막으려고 찬 행 크의 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 파커/태아 종 아리 혈 청 (P/FCS) 중간의 10 mL에 펠 릿을 디졸브. 참고: P/FCS 매체: TCM-199 10 배 (100 mL), FCS (50 mL), 페니실린-스 (10 mL), HEPES (20 mL), 소 주 H2O (900 mL)</li>
	<li>가벼운 현미경 (회전 타원 체, 골든-브라운 색) 그들의 형태에 따라 독도 식별 합니다. 어두운 센터와 함께 독도를 하지 마십시오. 순도 생존에 대 한 가벼운 현미경 얼룩 dithizone 수행 하 여 확인 하십시오. 참고: Dithizone 아연 이온을 하 고는 독도에 붉은 색 얼룩을 제공 합니다.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 계산 하 고 가벼운 현미경 독도 따 고 P/FCS 매체의 4 mL를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (60 m m x 15 m m)에 그들을 전송. 참고: 볼륨의 P /페 트리 접시에 FCS 매체 산소 가용성을 보장 하기 위해 4 mL를 초과 해서는 안됩니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C에서 P/FCS 매체 하룻밤 4 mL에 격리 된 독도 유지.</li>
</ol>3입니다. 섬 이식에 대 한 동물의 준비
<ol><li>37 ° C 배양 기에서 격리 된 독도 제거 하 고 흐름 벤치에서 그들을 배치. 페 트리 접시의 원형 스윙 모션 독도 센터.</li>
	<li>P/FCS 매체의 0.1 mL에 1 mL 주사기 (블루 23 G 바늘)를 채우십시오. 그런 다음, 행 크의 솔루션의 0.3 ml에서 350 독도 추가 합니다. 정착 독도 수 있도록 수직 위치에 주사기를 유지.</li>
	<li>0.05 mL를 볼륨을 감소 하 고 갈색 26 G 바늘으로 블루 23 G 바늘을 바꿉니다. 같은 주사기를 주사기에 0.2 mL의 최종 볼륨에 도달 가기 Ficoll (밀도 그라데이션 중간)의 0.15 mL를 추가 합니다. 공기 방울을 피하십시오.</li>
	<li>수직 위치에서 주사기를 유지 하 고 독도의 응집을 피하기 위해 약간 그것을 회전. 독도 2-3 분 이내 주사기에 정착 됩니다.</li>
	<li>받는 사람 마우스;의 몸 무게와 혈액 포도 당 수준을 측정합니다 혈액 포도 당 수준이 약 20 mmol/l. 해야 합니다.</li>
	<li>26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize.</li>
	<li>따뜻한 열 플레이트 (37 ° C)에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.</li>
	<li>Povidone-요오드 솔루션 (피부 살 균 제)와 복 부 지역 청소. 눈이 건조 하지 않도록 유지 그들 눈 연 고와 촉촉한. 참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.</li>
</ol>4. 섬 이식 Intraportal 경로 통해
<ol><li>0 일에는 개복 술과 집게와 피부를 유지 하 고 2-3 cm에 의해 시작-한가 위 절 개 긴 중간. 장소는 메 마른 젖은 거 즈 촉촉한 유지 하 상처 가장자리 압축.</li>
	<li>멸 균 거 즈 압축에 왼쪽 및 복 부 구멍 밖에 내장 사이트를 놓습니다. 참고: 내장 프로시저 미리 따뜻하게 0.9 %NaCl 용액 또는 일반 식 염 수에 담근 멸 균 거 즈를 통해 촉촉한 유지.</li>
	<li>십이지 장 이동한 췌를 찾습니다. 문맥 췌를 위로 밀어 복 부 사이트에서 위치를 찾습니다. 손가락 및 엄지를 사용 하 여 포털 정 맥 노출, 노출, 일단 간 가까이 펑크.</li>
	<li>1 분 이내 천천히 그리고 꾸준히 독도의 어떤 누설을 피하기 위해 돋보기의 검사에서 문맥에 독도 (0.2 mL 3.4 단계에서)을 주사. 참고: 후 주입, 항상 확인 주사기에 남아 있는 독도 대 한. 받아 P/FCS 미디어의 1 mL 주사기, 신선한 페 트리 접시를 현미경 하에서 계산으로 플러시.</li>
	<li>펑크 사이트에서 살 균 계기를 배치 하 고 검지 손가락으로 압력을 적용 (침투 깊이: 0.5-1 c m) 6 분 출혈을 멈추게. 참고: 주입 볼륨 0.2 mL를 초과 하지 않아야 합니다. 과도 한 볼륨 및 압력 전단 응력으로 인해 독도 손상 수 있습니다.</li>
	<li>조심 스럽게 내장 사이트, 복 막, 복 부 근육 층과 근 막에 다시.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 피부, 근육 절 개 흡수 실크 봉합, 그리고 2-3 클립 위쪽 피부 레이어를 닫습니다.</li>
	<li>피부 소독 제와 표면 청소, 상처 치유, 적용 하 고 개별 장에 쥐를 놓습니다. 상처 치유 및 단식 및 이차 감염에서 보호 방수 아크릴 레이어를 제공 합니다. 참고: 때까지 그들은 충분 한 의식 회복가지고 쥐를 관찰, 체액 함께 tramadol (마우스 당 0.2 mg)을 제공 합니다. 이 프로토콜에서 마우스 마 취에서 빠르게 회복 하 고 tramadol 관리 고통을 감소. 7 일 후 상처를 치유 한다.</li>
	<li>일반 음식과 물 쥐 먹이. 음식과 물 소비 및 소변 배설 streptozotocin 주입 후 증가할 것 이다.</li>
	<li>첫 주 한 주 syngeneic 마우스에 다음 번에 대 한 매일 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 수용자 마우스에서 최대 15 일 동안 일주일에 세 번 혈액 포도 당 수준을 측정 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자 들은 관심의 충돌을 선언 합니다.

본이 연구에서는 섬 이식의 intraportal 경로 탐구 된다. 이 프로토콜 당뇨 스트레스 완화에 매우 효율적 이며 섬 이식 연구를 탐구 하는 깊이 있는 기회를 제공 합니다. 이 프로토콜은 약 350 murine 독도 hyperglycemic 상태를 역전 할 수 있다 확인 한다. 또한, 쥐의 절차 동안, 죽 었 고 glycemic 제어 모든 받는 사람에 달성 했다. 몸 무게와 혈액 포도 당 수준의 능력, 표준, 및 반대로 혈당에 이식된 독도의 기능을 반영 하기 위해 정기적으로 기록 되었다. Syngeneically 이식된 생쥐에서 혈액 포도 당 수준은 첫 번째 주를 일주일에 한 번 그 후 매일 측정 했다. 독도 이식, hypoxic 조건 등 후 요인 14 일 후 신생 프로 요인 VEGF 등을 분 비 하 고 그림 3에서처럼 간에서 혈관 engraftment 증가를 내 피 세포를 트리거합니다. 수용자 쥐에서 혈액 포도 당 수준 까지의 15 일 동안 일주일에 세 번을 측정 했다. 15 일 후 이식된 독도 거절 되었다 면역 공격으로 인해 수용자 모델에서 면역 억제 약은 관리 하지 않는 한
문학10,11에 게시 하는 여러 섬 격리 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 가장 간단한 콜라 소화 후 수동으로 그들의 크기와 형태에 근거 하 여 독도 선택 하는 것입니다. 독도을 선택 하는 가장 중요 한 단계 중 하나 이며 외 분 비 세포, 파편, 등 선택한 독도 피하기 위해 밤새 소화 하는 동안 발생 하는 기계적 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 인큐베이터에서에서 37 ° C에서 유지 되어야 한다 절차입니다. Streptozotocin 투여 및 intraportal 섬 이식의 선택이이 프로토콜에 키도 있습니다. 체온 통제 되어야 하 고 수술에 걸쳐 열 플레이트를 사용 하 여 유지. 멸 균 거 즈를 출혈을 피하기 위해 펑크의 사이트에서 6 분에 대 한 최소한의 압력으로 적용 되어야 한다. 그들은 충분 한의 식이 되 찾을 때까지 마우스 움직임만 유지 되어야 한다.
이 프로토콜의 특정 단계를 수정할 수 있습니다. 예를 들어 소화 시간의 최적화와 콜라의 볼륨 다른 쥐 긴장에 독도의 수율을 증가할 수 있습니다. 당뇨병 (streptozotocin 180 mg/kg)의 급속 한 유도, 대신 천천히 혈당을 증가 유도 될 수 있는 시간의 연장된 기간 동안 낮은 복용량을 사용 하 여 (예를 들어, 40 mg/kg/5 일 연속 하루 streptozotocin). 이 이식된 독도의 더 나은 engraftment를 제공할 수 있습니다. Intraportal 정 맥을 대신 골, omental 주머니, 근육 지역, 위 점 막 표면, 비장, 신장 등 다른 사이트를 탐험 수 있습니다.
이식된 독도의 가난한 engraftment 아직도 임상 시험에서 주요 관심사입니다. 기타 기증자, 이식, 면역 억제, 및 혈액 중재 반응12,13후 혈액 포도 당 수치를 유지 하는 불일치의 부족을 포함. 적절 한 engraftment를 평가 하는 방법의 부족은 또 다른 장애물입니다. 자기 공명 또는 생물 발광 영상 이식된 독도 추적 가능 하 게 포도 당 내성 검사 등 c-펩 티 드 클래식 메서드를 대체할 수 있다. 미래에 독도 함께 이식 하는 줄기 세포 영양 제공 그리고 면역 조정 지원14.

섬 이식1타입-1 당뇨병 치료 하는 유망한 접근 이다. 당뇨병 환자로 양 췌 장 부분을 전송 하는 첫 번째 시도 1893 년에 왓슨 윌리엄스에 의해 수행 되었다. 그러나, 임상 작은 섬 이식에 중요 한 돌파구에 드 몬 튼 프로토콜 달성 했으며 이후, 국가 프로그램의 일련의 개발된2. 과거에는, 골 수, omental 주머니, 근육 지역, 위 점 막 표면, 비장, 신장 캡슐 등 여러 사이트 전 임상 모델에서 탐구 했다 하지만 포털 정 맥 시스템은 적합 하 고 효과적인 사이트 중 하나로 간주 됩니다. 대 한 임상 프로그램3,4,,56.
인슐린의 외 인 관리 섬 포털 정 맥으로 주입 하 여 교체하실 수 있습니다. 산소 공급은 하류 위치 네이티브 췌에 포털 동맥과 정 맥의 합류에의 하기 때문에 선호 하는 사이트는 것입니다. 또한, 거기는 큰 표면적은 독도의 3 차원 구조를 유지 수 있습니다, 그리고 vascularization 촉진된5수 있습니다. 받는 사람 당뇨병 마우스, 2000 또는 돼지 섬 등가물 또는 350 마우스에서 독도 hyperglycemic 국가7,8반대로 적절 한 있습니다. Euglycemic 레벨 syngeneic 마우스 대 마우스 이식에서 120 일 이상 xenogeneic 독도 수용자 마우스 마우스 모델에서 마우스 받는 모델에 15 일 동안 보고 했다.
문맥을 통해 섬 이식의 효능 관련 요소는 적절 한 마 취, 펑크, 그리고 hemostasis9의 방법. 마 취는 흡입 (5 %isoflurane) 또는 주입 (마 취 제, xylazine, 또는 pentobarbital)에 의해 유도 될 수 있다 그리고 물질 자주 결합. 깊이의 제어 및 마 취의 시간에 대 한 마우스, 점 막, 눈 뚜껑, 각 막 반사, 호흡 속도, 그리고 체온의 색 등의 상태에 관심을 지불 합니다. 그것은 동물 고군분투 하지 하 고 그것은 작동 살아 난다는 것이 중요입니다. 온도 유지 될 수 있다 난방 패드, 등 다른 난방 장치에 의해 레드 전구, 등 A 따뜻한 열 플레이트 마우스와의 발생을 방지 하는 작업 테이블을 25-30 ° C의 온도 유지 하는 데 사용 되었습니다. 저체온증입니다. 마 취약의 복용량은 중요 하다, 그들 모두는 간장에 의해 대사는 하 고 간 기능을 뚜렷이 섬 서 스 펜 션. 의 주입에 의해 무질서 수 있습니다. 문맥에 대 한 이상적인 펑크 점은 첫 번째 및 두 번째 지류 정 맥 사이 위치입니다.
독도 의도 주입 볼륨의 수 또한 영향을 미칠는 이식의 결과 과도 한 볼륨 전단 응력을 증가 수 있습니다. 0.2 mL 볼륨 포털 정 맥으로 작은 섬 이식에 대 한 적절 한 간주 됩니다. 찌른 상처 (26-게이지 바늘) 신속 하 고 효과적인 방식으로 중지 하는 문맥에서 출혈을 유도 합니다. 멸 균 거 즈 나 손가락은 출혈을 멈추게 하는 약 6 분 빵 꾸의 사이트에 최소한의 압력으로 적용할 수 있습니다. 찍은 함께, 포털 섬 주입 효과적 이며 화학적으로 유도 된 당뇨병 마우스 모델에서 혈액 포도 당 수준 이상의 레 귤 레이 션을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>NMRI nude mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Bela-pharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 23G and 26G needle</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze</td><td>Fuhrmann</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water bath</td><td>Kotterman</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Braun</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Meter&amp;nbsp;</td><td>One Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm Thermal Plate</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braunol (povidone-iodide solution)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)</td><td>Dr. G Mann Chem.-Pharm.&amp;nbsp; GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fa. Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Bench</td><td>Herdus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Suture Vicryl</td><td>Braun</td><td></td><td>(7.5 *1.75mm)</td></tr><tr><td>Michel Clamps (clips)</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>P/FCS Solution</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>TCM-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Biochrom</td><td>L 1613</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Calbiochem</td><td>572204</td><td></td></tr><tr><td>OPSITE-spray (wound healer)</td><td>Smith and nephew</td><td>66004978</td><td></td></tr><tr><td>Reugular food</td><td>Altromin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Head light LED 16042 (magnifying glass)</td><td>Eschenbach</td><td>16042</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody</td><td>Millipore, Chemicon</td><td>CBL1337</td><td>Dilution (1:100)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>712095153</td><td>Dilution (1:400)</td></tr><tr><td>Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Dilution (1:500)</td></tr><tr><td>Donkey anti-guinea pig secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>706-259-148</td><td>Dilution (1:400)</td></tr></tbody></table>

intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model

췌 장 섬 이식 혈당을 줄이기 위해 화학적으로 유도 된 당뇨병 설치류에서 매우 성공적 이다. 실험적인 섬 이식에 가장 일반적인 이식 사이트 신장 캡슐 이다. 그러나,로 적은 혈액 성분과 췌 장 독도의 상호 작용에 대 한 알려져 있다, 그것은 또한 의미가 실험 섬 이식에서 문맥 접근 방식을 활용 하 있습니다.
이 프로토콜에서는 NMRI 누드 마우스에는 intraportal 섬 이식 기법을 보여 줍니다. Streptozotocin (180 mg/kg)은 받는 사람 쥐에서 혈당을 유도 하기 위해 intraperitoneally 주입 하 고 있다. 그들은 20 mmol/l. 보다 큰 비 단식 혈액 포도 당 수준에서 당뇨병 환자로 간주 됩니다. 1 일 이전에 이식, 마우스 췌 장 독도 콜라 소화;에 의해 기증자 췌 격리 최소 350 독도 당뇨병 받는 당 활용 됩니다. 섬 격리 수율에 따라, 두 개 이상의 기증자 마우스 받는 사람 마다 활용 됩니다. 37 ° C에서 야간 문화, 후 독도 문맥을 통해 받는 사람 간으로 관리 됩니다. 수술 후, 쥐 빨간색 Makrolon 주택에 보호 및 관찰까지 깨어 있다. 이 프로토콜 syngeneic 마우스에 120 일 및 15 일 수용자 쥐에 glycemic 통제를 유지 한다.

이식된 독도의 역량은 화학적으로 유발 된 당뇨 쥐에서 연구 했다. 독도 당뇨병 쥐 모델에서 포털 정 맥 시스템을 통해 이식 했다. 기증 받는 사람 비율 2:1 이었다. Syngeneic 마우스 모델에서 두 기증자 쥐 350 독도를 활용 했다. 독도 다음 당뇨병 쥐에 이식 했다. 혈액 포도 당 수준에 있는 감소는 이식, 이식된 췌 장 독도 혈액 포도 당 수준을 감소에서 역할을 제안 후 1 일에 관찰 되었다. Streptozotocin 증가 혈액 포도 당 수준을 약 22 m m o l/l. 4.6 mmol/l (1 일) 혈액 포도 당 수준에 있는 하락 후에 작은 섬 이식 (그림 1A) 관찰 되었다. 그림 1A와 같이 Normoglycemia 최대 121 일 동안 유지 되었다. 몸 무게와 혈액 포도 당 수준 대략 동일한 패턴을 따 랐 다. Streptozotocin 주입 및 수술 후 체중 감소. 앞으로 하루 2에서 그것은 그림 1B와같이 25.3 g (주 4) 29.7 g (121 일)에서 정상을 향해 상승 경향이 있었다.
중요 한 조직 적합성 (MHC)의 경우 일치 하지 않는 쥐, 두 C57Bl/6 (h 2d) 마우스에서 350 독도 BALB/c (h 2b) 당뇨병 쥐에 이식 했다. 후에 streptozotocin 주입, 혈액 포도 당 증가 최대 26.6 m m o l/l. 섬 이식 후 혈액 포도 당 수준이 떨어졌다 4.4 mmol/L (하루 1; 그림 2A)입니다. Normoglycemia (4.44 7.2 mmol/l)는 최대 10 일 동안 하지만 15 일 (20.1 mmol/L) 후 관찰 되었다. 당뇨병 쥐의 몸 무게 23 g (매일 0)과 21.5 g (주 1) 추가 26 g (하루-3)에서 떨어졌다. 이식 후 몸 무게 점차적으로 복구 23 g (주 2)에서 25 g (10 일). MHC-일치 하지 않아, 혈액 포도 당 수준을 증가 하 고 체중 감소 작은 섬 이식 (그림 2B) 후 10 일.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig1.jpg"> 그림 1 : Syngeneic 섬 이식의 효과. (A) 혈액 포도 당 수준 streptozotocin 유도 당뇨 마우스에서 다른 시간 지점에서 측정 되었다 (n = 3). Streptozotocin (180 mg/kg)의 단 하나의 복용량 (0 일) 각 받는 사람에 게 350 독도의 이식 하기 전에 주입 했다. 혈액 포도 당 수준 (mmol/L) 최대 121 일 동안 측정 되었다 (일-3: 17 ± 2.3; 0: 22.6 ± 1, 하루 1: 4.6 ± 0.3; 하루 5: 7.5 ± 0.4; 및 하루 121: 5.3 ± 0.09). (B) 섬 이식 후 체중 증가. 위의 데이터는 평균 ±를 표준 편차를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig2.jpg"> 그림 2 : 수용자 섬 이식의 효과. (A) 혈액 포도 당 수준 streptozotocin 유도 당뇨 마우스에서 다른 시간 지점에서 측정 되었다 (n = 2). Streptozotocin (180 mg/kg)의 단 하나의 복용량 350 췌 장 독도 (0 일)의 이식 하기 전에 주입 했다. 혈액 포도 당 수준 (mmol/L)까지 15 일 동안 측정 되었다 (주-1: 25.5 ± 5.3; 0: 26.6 ± 1.4; 하루 2: 8 ± 0.9, 하루 10: 6.2 ± 0.08; 및 하루 15: 20.1 ± 1.6). Normoglycemic 상태 최대 10 일 동안 그리고 그 후, 혈액 포도 당 농도 증가 유지 했다. (B) 섬 이식 전후 몸 무게의 속 행. 데이터는 평균 ±를 표준 편차를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig3.jpg"> 그림 3 : 간으로 이식된 췌 장 독도의 대표 immunostaining 그림: PBS, 10% 당나귀 혈 청 인슐린 1 차적인 항 체 (1: 500)와 혈소판 4 ° C에서 하룻밤 부 화 뒤 블록 간 섹션 (5 µ m) 세척 내 피 세포 접착 분자 PECAM-1 1 차적인 항 체 (1: 100). 다음 날, 1 시간에 대 한 2 차 항 체로 얼룩 PBS, Hoechst와 카운터 얼룩을 세척 하 고 Leica 형광 현미경 이미지를 캡처. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

intraportal-transplantation-of-pancreatic-islets-in-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.5K 조회수.  Clinical Research Lab. 췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

비디오: Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

연구

의학

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

당뇨병 마우스의 신장 캡슐으로 췌장 아일 레츠의 이식

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

생물학

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

생체공학

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

췌 장 이식 수정된 팔목 기술을 사용 하 여 마우스 모델

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

마우스에서 간내 섬 이식 중 주입 후 포털 정맥 출혈 최소화

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

췌장섬 접목: 생체 내 이미징을 위해 췌장섬을 마우스 눈의 전방에 이식하는 방법

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...