Nos gustaría reconocer Gundula Hertl por su apoyo.

Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por normas y ley de Bienestar Animal de alemán. Considere el uso de ratones desnudos de 10 a 12 semanas de edad NMRI y ratones C57Bl/6 (donante: mujer vieja; destinatario: masculino) a lo largo de los experimentos. Utilizar ratones desnudos NMRI para aislamiento de islotes pancreáticos. Mantener los ratones bajo condiciones definidas según las regulaciones locales de Animalario.
1. inducción de la Diabetes por Streptozotocin
<ol><li>Día -4, medir el peso corporal de 10 a 12 semanas de edad NMRI desnudas ratones y ratones C57Bl/6 con una máquina de pesaje.</li>
	<li>Según el peso del cuerpo medido, preparar una dosis de 180 mg/kg de streptozotocin en 0,1 mL de solución salina por ratón. Nota: Streptozotocin debe ser recién preparada antes de su uso y cubierto con papel de aluminio, ya que es sensible a la luz.</li>
	<li>Inyectar a los ratones syngeneic y alogénicos cada uno con una dosis única de 0,1 mL del streptozotocin (180 mg/kg) por vía intraperitoneal utilizando una aguja de 26 G.</li>
	<li>Día -3, -2 y -1 recogen 2-4 μL de sangre por punción de las venas de la cola de los ratones no ayunó.</li>
	<li>Usar 2-4 μL de la muestra de sangre por tira reactiva para medir la glucosa en sangre en ratones desnudos NMRI y ratones C57Bl/6 Nota: En este punto, el 80% de los ratones debe llegar a ser diabético (20 mmol/L).<ol>
<li>Utilizar ratones para el trasplante de islote cuando sus niveles de glucosa en sangre 20 mmol/L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento de islotes pancreáticos de ratones
<ol><li>Anestesiar los ratones con ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (20 mg/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal con una aguja de 26 G. Nota: Los volúmenes de ketamina y xilacina se determinaron según el peso corporal de los animales (0,10 mL/10 g).</li>
	<li>Mantener los ratones en posición supina y desinfectar con solución de povidona-yodo. Confirmar la correcta eutanasia activando el reflejo pedal. Nota: En caso de C57Bl/6 afeite la región abdominal.</li>
	<li>Mantener la piel con unas pinzas finas y hacer una incisión de línea media con unas tijeras para exponer la cavidad abdominal. Coloque el situs del intestino a la izquierda y fuera de la cavidad abdominal sobre una compresa de gasa estéril.</li>
	<li>Ajustar el estómago en otra dirección para localizar el páncreas y otros asociados los tejidos.</li>
	<li>Llegar a la aorta y hacer una pequeña incisión para drenar la sangre. Usar gasa estéril para la absorción de la sangre.</li>
	<li>Retire con cuidado el intestino. Separar el páncreas del estómago y el bazo.</li>
	<li>Suprimir el páncreas y colocar en una placa Petri fresca. Retire todos los materiales no deseados, tales como grasa, con unas pinzas.</li>
	<li>Llene una jeringa de 5 mL con 4 mL de colagenasa e inyecte en el páncreas con una aguja de 26 G (solución de stock: 30 mg de colagenasa en 12 mL de solución de Hank).</li>
	<li>Pique el páncreas con tijeras para aumentar el área superficial para una mejor digestión y transfiéralo a un tubo de tapa roja de 12 mL. Nota: Hank equilibrada solución de sal: HBSS 10 x (100 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), gentamicina (1 mL), ciprofloxacino (10 mL), HEPES (35 mL), agua destilada H2O (900 mL)</li>
	<li>Realizar una digestión durante 10 min a 37 ° C en un baño. Vórtice la muestra tres veces a intervalos regulares de 15 s.</li>
	<li>Mezcla el páncreas digerido vigorosamente a mano durante 3 minutos y coloque en hielo por 10 s.</li>
	<li>Añadir 6 mL de solución de Hank fría para detener la reacción de digestión y centrifugar a 560 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y disolver el precipitado en 10 mL de medio de suero (P/FCS) becerro fetal Parker a temperatura ambiente. Nota: Medio P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), HEPES (20 mL), agua destilada H2O (900 mL)</li>
	<li>Identificar los islotes basados en su morfología (esferoide, color dorado) bajo un microscopio de luz. Evite los islotes con centros oscuros. Comprobar la pureza y viabilidad realizando ditizona tinción bajo un microscopio de luz. Nota: Ditizona se une al ion zinc y proporciona color rojo colorante a los islotes.</li>
	<li>Usar una pipeta de 1 mL para contar y dedazo islotes bajo un microscopio y transferirlas a un fresco plato de Petri (60 x 15 mm) que contiene 4 mL de medio P/FCS. Nota: El volumen de P /medio de FCS en el plato de Petri no debe exceder 4 mL para asegurar la disponibilidad de oxígeno.</li>
	<li>Mantener los islotes aislados en 4 mL de medio P/FCS durante la noche a 37 ° C en una incubadora.</li>
</ol>3. preparación de animales para el trasplante de islotes pancreáticos
<ol><li>Quitar los islotes aislados de la incubadora de 37 ° C y colocarlos en un banco del flujo. Centro de los islotes con un movimiento circular de la placa de Petri.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 mL (aguja de 23 G azul) con 0,1 mL de medio P/FCS. Luego, agregar 350 islotes en 0,3 mL de solución de Hank. Mantenga la jeringa en posición vertical para permitir que los islotes resolver.</li>
	<li>Disminuir el volumen de 0.05 mL y reemplazar la aguja 23 G azul con una aguja 26-G marrón. En la misma jeringa, agregar 0,15 mL de Ficoll (medio de gradiente de densidad) en la parte superior para llegar a un volumen final de 0.2 mL en la jeringa. Evitar las burbujas de aire.</li>
	<li>Mantener la jeringa en posición vertical y gire ligeramente para evitar la aglutinación de islotes. Los islotes se asentarán en el cono de la jeringa dentro de 2-3 minutos.</li>
	<li>Medir el cuerpo peso y sangre glucosa niveles de los ratones receptores; los niveles de glucosa en sangre deben ser alrededor de 20 mmol/L.</li>
	<li>Anestesiar los ratones con ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (20 mg/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal con aguja 26-G.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina en una placa térmica caliente (37 ° C). Verificar la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie.</li>
	<li>Limpiar la región abdominal con solución de povidona yodada (desinfectante de la piel). Para evitar que los ojos de secado, mantenerlos húmedos con ungüento oftálmico. Nota: En caso de C57Bl/6 afeite la región abdominal.</li>
</ol>4. islote trasplante vía Intraportal
<ol><li>En el día 0, empezar con una laparotomía por sostener la piel con pinzas y hacer un 2-3 cm-incisión de línea media larga con una tijera. Coloque una gasa húmeda estéril comprimir alrededor de los bordes de la herida para mantenerlo húmedo.</li>
	<li>Coloque el situs del intestino a la izquierda y fuera de la cavidad abdominal sobre la compresa de gasa estéril. Nota: Mantenga el intestino húmedo durante todo el procedimiento con solución de NaCl al 0.9% precalentada o gasa estéril humedecido en solución salina normal.</li>
	<li>Mueva el duodeno y localizar el páncreas. Localizar la vena portal situada en el sitio ventral empujando hacia arriba el páncreas. Utilizar un dedo y el pulgar para exponer la vena porta y, una vez expuesto, la puntura cerca del hígado.</li>
	<li>Dentro de 1 minuto, lenta y constantemente inyectar los islotes (0.2 mL del paso 3.4) en la vena porta bajo la inspección de la lupa para evitar cualquier fuga de islotes. Nota: Después de la inyección, compruebe siempre para islotes restantes en la jeringa. Tomar 1 mL de media P/FCS en una jeringa, al ras en un fresco plato de Petri y conteo al microscopio.</li>
	<li>Coloque un calibrador de estéril en el sitio de punción y aplicar presión con el dedo índice (profundidad de la penetración: 0.5-1 cm) durante 6 minutos detener el sangrado. Nota: El volumen inyectado no debe exceder 0,2 mL. Presión y un volumen excesivo pueden dañar los islotes debido a tensión de esquileo.</li>
	<li>Con cuidado coloque el situs del intestino, peritoneo, capa muscular abdominal y faja en su lugar.</li>
	<li>Con unas pinzas, levantar la piel, cerca de la incisión del músculo con sutura absorbible de seda y capa superior de la piel con pinzas de 2-3.</li>
	<li>Limpie la superficie con desinfectante de la piel, aplicar un curador de la herida y colocar los ratones en jaulas individuales. Sanador de la herida proporciona una capa de acrilato resistente al agua y proteger de la maceración y la infección secundaria. Nota: Observar los ratones hasta que ha recuperado la conciencia suficiente, proporcionar tramadol (0,2 mg por ratón) junto con líquidos. En este protocolo, ratones rápidamente se recuperaron de la anestesia y la administración de tramadol redujo el dolor. Después de 7 días, la herida debe sanar.</li>
	<li>Alimentar los ratones con agua y comida regular. Aumentará la excreción alimentos y agua de consumo y de la orina después de la inyección del streptozotocin.</li>
	<li>Medir los niveles de glucosa en sangre todos los días durante la primera semana y luego una vez a la semana en ratones syngeneic. En los ratones alogénicos, medir los niveles de glucosa en sangre tres veces a la semana durante un máximo de 15 días.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+as+an+alternative+site+for+islet+transplantation.">Bone marrow as an alternative site for islet transplantation.</a> Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).</li><li>Echeverri, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+gastric+submucosal+transplantation+of+islets+(ENDO-STI):+technique+and+initial+results+in+diabetic+pigs.">Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs.</a> American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).</li><li>Korsgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+islet+engraftment+is+critical+for+successful+clinical+islet+transplantation.">Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation.</a> Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).</li><li>Lingwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+gelatinase+B+(matrix+metalloprotease-9)+activity+reduces+cellular+inflammation+and+restores+function+of+transplanted+pancreatic+islets.">Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets.</a> Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intraportal+islet+transplantation+outcome+by+systemic+IKK-beta+inhibition:+NF-kappaB+activity+in+pancreatic+islets+depends+on+oxygen+availability.">Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability.</a> American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).</li><li>Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+aspects+are+critical+for+carrying+out+intraportal+islet+transplants+successfully+in+a+diabetes+mouse+model.">Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Rother, K. I., Harlan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+islet+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes+mellitus.">Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+islets+are+essential+for+successful+intraportal+transplantation+in+a+diabetes+mouse+model.">Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).</li><li>Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+of+Type+1+Diabetes+Mellitus:+From+Pancreatic+Islet+Transplantation+to+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 22 (2016).</li></ol>

Todos los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

En este estudio se explora la vía intraportal de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo es muy eficaz en el alivio de estrés diabético y ofrece una profunda oportunidad de explorar estudios de trasplante de islotes pancreáticos. Este protocolo confirma que cerca de 350 islotes murinos son capaces de revertir el estado hiperglucémico. Por otra parte, ninguno de los ratones murió durante el procedimiento y control de la glucemia fue alcanzado en todos los destinatarios. Niveles de glucosa en sangre y el peso corporal se registraron regularmente para reflejar la competencia, estándar y funcionalidad de los islotes trasplantados en la reversión de la hiperglucemia. En ratones trasplantados syngeneically, niveles de glucosa en sangre se midieron diariamente durante la primera semana y una vez por semana después de eso. Después de trasplante de islotes, condición hipóxica y otros factores activan las células endoteliales secretan factores pro-angiogénicos como VEGF después de 14 días y así aumentar el injerto vascular en el hígado, como se muestra en la figura 3. En los ratones alogénicos, niveles de glucosa en sangre se midieron tres veces a la semana durante un máximo de 15 días. Después de 15 días, islotes trasplantados fueron rechazados en el modelo de trasplante allogeneic debido a un ataque inmune, a menos que se administran fármacos inmunosupresores
Hay varios protocolos de aislamiento de islotes publicados en la literatura10,11. La más sencilla es escoger islotes manualmente sobre la base de su morfología y tamaño después de la digestión de la colagenasa. Este es uno de los pasos más importantes para seleccionar sólo islotes y debe mantenerse evitar que las células exocrinas, escombros, etc. seleccionadas islotes a 37 ° C durante la noche en una incubadora para que puedan recuperarse de los esfuerzos mecánicos durante la digestión procedimiento. La selección de la dosis del streptozotocin y el trasplante de islote intraportal son también clave en el presente Protocolo. La temperatura corporal debe ser regulada y mantenido usando una placa térmica durante todo el procedimiento quirúrgico. Gasa estéril se debe aplicar con presión mínima de 6 minutos en el sitio de punción para evitar sangrado. Ratones se deben mantenerse bajo observación hasta que recupere la conciencia suficiente.
Ciertos pasos en el presente Protocolo pueden ser modificados. Por ejemplo, la optimización del tiempo de digestión y el volumen de la colagenasa pueden aumentar el rendimiento de islotes en cepas de ratones diferentes. En vez de la rápida inducción de la diabetes (streptozotocin de 180 mg/kg), poco a poco aumentar la hiperglucemia puede ser inducida con una dosis más baja durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, 40 mg/kg/streptozotocin día por 5 días consecutivos). Esto podría proporcionar mejor engraftment de islotes trasplantados. Otros sitios, como la médula ósea, bolsa omental, intramuscular región, superficie de la mucosa gástrica, bazo y riñón pueden explorarse como alternativas a la vena intraportal.
Pobre engraftment de islotes trasplantados sigue siendo una preocupación importante en los ensayos clínicos. Otros incluyen una escasez de donantes, la incoherencias en el mantenimiento de niveles de glucosa en sangre después de trasplante, la inmunosupresión y la reacciones mediadas por la sangre12,13. Falta de métodos para evaluar el engraftment adecuado es otro obstáculo. Seguimiento de trasplantados islotes por resonancia magnética o la proyección de imagen de bioluminiscencia posiblemente podría reemplazar métodos clásicos como la prueba de tolerancia a la glucosa o el c-peptide. En el futuro, las células madre trasplantadas junto con islotes podría proporcionar nutricional e inmunomodulador apoyo14.

Trasplante de islotes pancreáticos es un enfoque prometedor para tratar tipo 1 diabetes mellitus1. El primer intento de transferencia de un fragmento de páncreas de oveja en un paciente diabético fue realizado por Watson Williams en 1893. Sin embargo, se logró un importante avance en el trasplante clínico de islotes pancreáticos con el protocolo de Edmonton, y después de eso, una serie de programas nacionales fueron desarrollados2. En el pasado, varios sitios, como la médula ósea, bolsa omental, intramuscular región, superficie de la mucosa gástrica, bazo y la cápsula renal, fueron explorados en modelos preclínicos, pero el sistema venoso portal se considera como uno de los sitio conveniente y eficaz para los programas clínicos3,4,5,6.
La administración exógena de insulina puede ser sustituida por infusión de islotes en la vena porta. Esto se considera un sitio preferido porque el suministro de oxígeno es comparable a la del páncreas nativo debido a la ubicación aguas abajo de la confluencia de la arteria porta y la vena. Además, hay una gran superficie, por lo que la estructura tridimensional de los islotes puede ser preservada y vascularización puede ser facilitado5. En un ratón diabético destinatario, 2.000 equivalentes del islote humano o porcino o ratón 350 islotes son suficientes para revertir el estado hiperglucémico7,8. Hiperinsulinémico niveles registraron durante 15 días en el modelo de receptor de ratón de islotes xenogeneicos y en el modelo de ratón a ratón alogénico y para más de 120 días del trasplante syngeneic de ratón a ratón.
Factores pertinentes a la eficacia del trasplante de islotes pancreáticos a través de la vena porta son anestesia adecuada, método de puntura y hemostasia9. La anestesia puede ser inducida por inhalación (5% isoflurano) o inyección (ketamina xilacina y pentobarbital), y a menudo se combinan las sustancias. Para el control de la profundidad y tiempo de anestesia, debe prestarse atención al estado del ratón, como el color de la mucosa, párpado, reflejo corneal, la frecuencia respiratoria y temperatura corporal. Es importante asegurarse de que el animal no está luchando y que sobrevive a la operación. La temperatura se puede mantener por aparatos de calefacción diferentes, tales como cojines de calefacción, focos de luz roja, etc. A la placa termal caliente se ha utilizado para mantener una temperatura de 25-30 ° C entre el ratón y la tabla de la operación, que previene la aparición de hipotermia. Las dosis de los anestésicos son importantes, ya que todos ellos son metabolizados por el hígado, y función hepática puede ser transitoriamente desordenada por la infusión de la suspensión del islote. El punto ideal de punción de la vena porta es la posición entre la primera y la segunda vena tributaria.
El número de islotes y el volumen de inyección previsto también influir en el resultado del trasplante, como un volumen excesivo puede aumentar la tensión de esquileo. Un volumen de 0.2 mL se considera apropiado para el trasplante de islotes en la vena porta. La herida pinchar (aguja de calibre 26) induce sangrado de la vena porta, que necesita ser detenido de manera oportuna y eficaz. Gasa estéril o un dedo se puede aplicar con una mínima presión en el sitio de la punción durante unos 6 min a detener el sangrado. Tomado junto, portal islote inyección es eficaz y ofrece regulación de niveles de glucosa en sangre en modelos de ratón diabético químicamente inducida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td>C57Bl/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>NMRI nude mice</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Bela-pharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe, 23G and 26G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Gauze</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking Water bath</td>
			<td>Kotterman</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose Meter&#160;</td>
			<td>One Touch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm Thermal Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Braunol (povidone-iodide solution)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)</td>
			<td colspan="2">Dr. G Mann Chem.-Pharm.&#160; GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flow Bench</td>
			<td>Herdus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-0 Silk Suture Vicryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>(7.5 *1.75mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Michel Clamps (clips)</td>
			<td>Aesculap&#160;</td>
			<td>BN507R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P/FCS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21180-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCM-199 (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21180-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1 M)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 1613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamycin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ciprofloxacin</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#39;s Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213865001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptozotocin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>572204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OPSITE-spray (wound healer)</td>
			<td>Smith and nephew</td>
			<td>66004978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Reugular food</td>
			<td>Altromin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Head light LED 16042 (magnifying glass)</td>
			<td>Eschenbach</td>
			<td>16042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody</td>
			<td>Millipore, Chemicon</td>
			<td>CBL1337</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-rat secondary antibody</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712095153</td>
			<td>Dilution (1:400)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-guinea pig secondary antibody</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-259-148</td>
			<td>Dilution (1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model

Trasplante de islotes pancreáticos para reducir la hiperglucemia es exitoso en roedores con diabetes inducida químicamente. El sitio más común de trasplante en el trasplante de islote experimental es la cápsula del riñón. Sin embargo, como se sabe menos acerca de la interacción de islotes pancreáticos con los componentes de la sangre, también tiene sentido utilizar el enfoque de la vena porta en el trasplante de islote experimental.
Este protocolo muestra una técnica de trasplante intraportal islotes en ratones desnudos NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) se inyecta por vía intraperitoneal para inducir hiperglucemia en ratones receptores. Se consideran como diabético a un nivel de glucosa en sangre no ayuno mayores que 20 mmol/L. Un día antes del trasplante, islotes pancreáticos de ratón son aislados de páncreas de donante por digestión de colagenasa; un mínimo de 350 islotes son utilizados por beneficiario diabético. Según el rendimiento de aislamiento de islotes pancreáticos, ratones de donantes de dos o más son utilizados por destinatario. Después de la cultura durante la noche a 37 ° C, islotes son administrados en el destinatario hígado vía la vena porta. Después de la cirugía, los ratones son protegidos en casas de Makrolon rojo y observados hasta despierto. Este protocolo mantiene control de la glucemia durante 120 días en ratones syngeneic y 15 días en ratones alogénicos.

La competencia de los islotes trasplantados fue estudiada en ratones diabéticos inducidos químicamente. Los islotes fueron trasplantados a través del sistema venoso portal en modelo de ratones diabéticos. La relación de donantes y receptores fue 2:1. En el modelo de syngeneic de ratón, dos ratones donantes fueron utilizados para obtener 350 islotes. Las islas entonces fueron transplantadas en ratones diabéticos. Se observó una reducción en el nivel de glucosa en sangre el día 1 después del trasplante, sugiriendo un papel de islotes pancreáticos transplantados en reducir el nivel de glucosa en sangre. Streptozotocin aumentó el nivel de glucosa en sangre hasta cerca de 22 mmol/L. Una caída en el nivel de glucosa en sangre a 4,6 mmol/L (día 1) se observó después del trasplante de islotes pancreáticos (figura 1A). Normoglycemia se mantuvo durante 121 días, como se muestra en la figura 1A. El nivel de glucosa de sangre y el peso de cuerpo más o menos había seguido el mismo patrón. Después de la cirugía y la inyección streptozotocin, disminución de peso corporal. Desde el día 2 hacia adelante, tendió a elevarse hacia la normal, de 25,3 g (día 4) a 29,7 g (día 121), como se muestra en la figura 1B.
En el caso de histocompatibilidad (MHC) ratones no coincidentes, 350 islotes de ratones C57Bl/6 (H2d) dos fueron transplantadas en ratones BALB/c (H2b) diabéticos. Después de la inyección del streptozotocin, la glucosa en la sangre aumenta hasta 26,6 mmol/L. Después del trasplante de islotes pancreáticos, el nivel de glucosa en sangre disminuyó a 4.4 mmol/L (día 1; Figura 2A). Normoglycemia (4,44 a 7,2 mmol/L) se observó un máximo de 10 días, pero no después de 15 días (20,1 mmol/L). El peso corporal de ratones diabéticos se redujo de 26 g (día -3) 23 g (día 0) y a 21,5 g (día 1). Después del trasplante, el peso del cuerpo poco a poco se recuperó de 23 g (día 2) a 25 g (día 10). Debido a la incompatibilidad de MHC, el nivel de glucosa en sangre aumenta y el peso corporal disminuyó 10 días después del trasplante de islotes pancreáticos (figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig1.jpg"> Figura 1 : Efecto del trasplante de islotes pancreáticos syngeneic. (A) el nivel de glucosa en sangre se midió en diferentes puntos temporales en ratones diabéticos inducida (n = 3). Se inyectó una dosis única de streptozotocin (180 mg/kg) antes del trasplante de 350 islotes para cada destinatario (día 0). Se midió el nivel de glucosa en sangre (mmol/L) hasta 121 días (día -3: 17 ± 2.3; día 0: 22,6 ± 1, día 1: 4.6 ± 0.3; día 5: 7.5 ± 0.4; y día 121: 5.3 ± 0,09). (B) aumento de peso después del trasplante del islote. Los datos anteriores representan la media ± la desviación estándar. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig2.jpg"> Figura 2 : Efecto del trasplante alogénico de islotes pancreáticos. (A) el nivel de glucosa en sangre se midió en diferentes puntos temporales en ratones diabéticos inducida (n = 2). Se inyectó una dosis única de streptozotocin (180 mg/kg) antes del trasplante de islotes pancreáticos 350 (día 0). Se midió el nivel de glucosa en sangre (mmol/L) hasta 15 días (día -1: 25,5 ± 5.3; día 0: 26,6 ± 1.4; día 2:8 ± 0.9; día 10: 6.2 ± 0.08; y día 15: 20,1 ± 1.6). Normoglucémicos estado se mantuvo durante 10 días y posteriormente, aumentaron de las concentraciones de glucosa de la sangre. (B) seguimiento de peso corporal antes y después del trasplante del islote. Los datos representan la media ± la desviación estándar. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig3.jpg"> Figura 3 : Cuadro representante immunostaining de islotes pancreáticos transplantados en hígado: la sección de hígado (5 μm) de lavado con PBS, bloque con el suero de burro 10% seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario de insulina (1: 500) y de la plaqueta células endoteliales adherencia molécula PECAM-1 anticuerpo primario (1: 100). Al día siguiente, tinción con anticuerpos secundarios para 1 h, lavar con PBS, mancha de contador con Hoechst y capturar las imágenes con el microscopio de fluorescencia Leica. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

intraportal-transplantation-of-pancreatic-islets-in-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.4K vistas.  Clinical Research Lab. Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Video: Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Investigación

Medicina

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of lesions, and/or chronic pharmaceutical management of pain and infertility symptoms. The cost associated with endometriosis has been estimated at 22 billion dollars per year in the United States1. To further our understanding of mechanisms underlying this enigmatic disease, animal models have been employed. Primates spontaneously develop endometriosis and therefore primate models most closely resemble the disease in women. Rodent models, however, are more cost effective and readily available2. The model that we describe here involves an autologous transfer of uterine tissue to the intestinal mesentery (Figure 1) and was first developed in the rat3 and later transferred to the mouse4. The goal of the autologous rodent model of surgically-induced endometriosis is to mimic the disease in women. We and others have previously shown that the altered gene expression pattern observed in endometriotic lesions from mice or rats mirrors that observed in women with the disease5,6. One advantage of performing the surgery in the mouse is that the abundance of transgenic mouse strains available can aid researchers in determining the role of specific components important in the establishment and growth of endometriosis. An alternative model in which excised human endometrial fragments are introduced to the peritoneum of immunocompromised mice is also widely used but is limited by the lack of a normal immune system which is thought to be important in endometriosis2,7. Importantly, the mouse model of surgically induced endometriosis is a versatile model that has been used to study how the immune system8, hormones9,10 and environmental factors11,12 affect endometriosis as well as the effects of endometriosis on fertility13 and pain14.

A description of the surgical induction of endometriosis in mice and rats by auto-transplantation of uterine tissue to the arterial cascade of the intestinal mesentery.

Modelo de ratón de la endometriosis quirúrgicamente inducida por la Auto-trasplante de tejido uterino

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolos de tinción de islotes pancreáticos humanos

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedimientos Quirúrgicos para un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico parcial con reconstrucción arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

El trasplante de la válvula pulmonar Utilizando un modelo de ratón de heterotópico trasplante cardiaco

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.