Nous tenons à remercier Gundula Hertl pour son soutien.

Toutes les procédures dans le présent protocole ont été approuvés par les lignes directrices et de la Loi sur la protection animale de l’allemand. Pensez à utiliser des souris nus NMRI âgés de 10 à 12 semaines et souris C57Bl/6 (donateur : femme ; destinataire : mâle) au cours des expériences. Utilisez la souris Nudes NMRI pour l’isolement de l’îlot. Gardez les souris dans des conditions définies conformément à la réglementation locale d’animalerie.
1. l’induction du diabète par streptozotocine
<ol><li>Le jour -4, mesurer le poids corporel de 10 à 12 semaines NMRI souris nues et les souris C57Bl/6, à l’aide d’un appareil de pesage.</li>
	<li>Selon le poids du corps mesurée, préparation d’une dose de 180 mg/kg de streptozotocine dans 0,1 mL d’une solution saline par souris. Remarque : Streptozotocine doit être fraîchement préparée avant utilisation et recouvert de papier d’aluminium, car il est sensible à la lumière.</li>
	<li>Injecter les souris syngéniques et allogéniques chacun avec une dose unique de 0,1 mL de streptozotocine (180 mg/kg) par voie intrapéritonéale en utilisant une aiguille 26-G.</li>
	<li>Jour -3, -2 et -1 collectent 2-4 µL de sang par ponction des veines de queue de souris non à jeun.</li>
	<li>2-4 µL de l’échantillon de sang par la bandelette de test permet de mesurer la glycémie dans des souris nus NMRI et souris C57Bl/6 Remarque : À ce stade, 80 % des souris devrait devenir diabétique (20 mmol/L).<ol>
<li>Utilisez la souris pour la transplantation d’îlots lorsque leurs niveaux de glucose de sang atteindre 20 mmol/L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolement des îlots pancréatiques de souris
<ol><li>Anesthésier les souris avec la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale avec une aiguille 26-G. Remarque : Les volumes de kétamine et de xylazine aient été déterminés selon le poids corporel des animaux (0,10 mL/10 g).</li>
	<li>Gardez les souris en décubitus dorsal et désinfecter avec une solution de povidone-iode. Confirmer une euthanasie correcte en vérifiant le réflexe de pédale. Remarque : En cas de C57Bl/6 raser la région abdominale.</li>
	<li>Tendez la peau avec une pince fine et faire une incision médiane avec des ciseaux pour exposer la cavité abdominale. Placez le situs intestin à gauche et à l’extérieur de la cavité abdominale sur une compresse de gaze stérile.</li>
	<li>Ajuster l’estomac dans une autre direction pour localiser le pancréas et autres associés les tissus.</li>
	<li>Atteindre l’aorte et faire une petite coupure pour drainer le sang. Utiliser une gaze stérile pour l’absorption de sang.</li>
	<li>Retirer délicatement l’intestin. Séparer le pancréas de l’estomac et la rate.</li>
	<li>Excise le pancréas et le placer dans une nouvelle boîte de Pétri. Enlever toutes les matières indésirables, tels que gras, avec une pincette.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 5 mL avec 4 mL de collagénase et injecter dans le pancréas avec une aiguille 26-G (solution mère : 30 mg de collagénase dans 12 mL de solution de Hank).</li>
	<li>Émincer le pancréas avec des ciseaux pour augmenter la surface pour une amélioration de la digestion et le transfert dans un tube à bouchon rouge 12 mL. NOTE : Hank équilibré de solution saline : HBSS 10 x (100 mL), (10 mL) de pénicilline-streptomycine, gentamicine (1 mL), ciprofloxacine (10 mL), HEPES (35 mL), eau distillée H2O (900 mL)</li>
	<li>Effectuer une digestion pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d’eau secouer. Vortex l’échantillon trois fois à intervalle régulier pendant 15 s.</li>
	<li>Mélanger le pancréas digéré vigoureusement à la main pendant 3 min et placez-le sur la glace pendant 10 s.</li>
	<li>Ajouter 6 mL de solution de Hank froide pour arrêter la réaction de la digestion et centrifuger à 560 x g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le surnageant et dissoudre le culot dans 10 mL de milieu de sérum (P/FCS) veau Parker/foetale à température ambiante. NOTE : Support P/FCS : TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), la pénicilline-streptomycine (10 mL), HEPES (20 mL), eau distillée H2O (900 mL)</li>
	<li>Identifier les îlots basés sur leur morphologie (sphéroïde, couleur brun doré) sous un microscope optique. Évitez les îlots avec des centres de sombres. Vérifier la pureté et leur viabilité en effectuant dithizone coloration sous un microscope optique. Remarque : Dithizone lie l’ion zinc et fournit des tache de couleur rouge aux îlots.</li>
	<li>Utiliser une pipette de 1 mL à compter et îlots sous un microscope photonique cueillir à la main et de les transférer à une boîte de Pétri fraîche (60 mm x 15 mm) contenant 4 mL de milieu de P/FCS. Remarque : Le volume de P /moyen de FCS dans la boîte de Pétri ne doit pas dépasser 4 mL afin d’assurer la disponibilité de l’oxygène.</li>
	<li>Garder les îlots isolés dans 4 mL de milieu de P/FCS pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur.</li>
</ol>3. préparation des animaux destinés à la Transplantation d’îlots pancréatiques
<ol><li>Retirez les îlots isolés de l’incubateur à 37 ° C et les placer sous un banc de flux. Centrez les îlots avec un mouvement circulaire de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 mL (aiguille bleue de 23 G) 0,1 ml de milieu de P/FCS. Puis, ajoutez 350 îlots dans 0,3 mL de solution de Hank. Tenir la seringue en position verticale pour permettre les îlots de s’installer.</li>
	<li>Diminuer le volume à 0,05 mL et remplacer l’aiguille 23-G bleue avec une aiguille de 26-G brune. À la même seringue, ajouter 0,15 mL de Ficoll (milieu de gradient de densité) vers le haut pour atteindre un volume final de 0,2 mL dans la seringue. Éviter les bulles d’air.</li>
	<li>Tenir la seringue en position verticale et tourner légèrement pour éviter l’agglutination des îlots. Les îlots seront déposent dans le cône de la seringue dans les 2-3 min.</li>
	<li>Mesurer les taux de glucose corps poids et le sang des souris bénéficiaires ; le taux de glycémie devrait être autour de 20 mmol/L.</li>
	<li>Anesthésier les souris avec la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale avec aiguille 26-G.</li>
	<li>Placez les souris en décubitus dorsal sur une assiette chaude thermique (37 ° C). Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil.</li>
	<li>Nettoyez la région abdominale avec solution de povidone-iode (désinfectant de la peau). Pour que les yeux ne se dessèchent, garder humides avec pommade ophtalmique. Remarque : En cas de C57Bl/6 raser la région abdominale.</li>
</ol>4. Transplantation d’îlots pancréatiques par voie intraporte
<ol><li>Jour 0, commencer par une laparotomie en tenant la peau avec une pince et en faisant un 2-3 cm-incision longue ligne médiane avec un ciseau. Place une gaze stérile humide compresser sur les bords de la plaie pour le garder humide.</li>
	<li>Placez le situs intestin à gauche et à l’extérieur de la cavité abdominale sur la compresse de gaze stérile. Remarque : Gardez l’intestin humide tout au long de la procédure avec préchauffé solution de NaCl 0,9 % ou de la gaze stérile trempée dans une solution saline normale.</li>
	<li>Déplacer le duodénum et localisez le pancréas. Repérer la veine située sur le site ventral en appuyant vers le haut sur le pancréas. Utilisez un doigt et le pouce pour exposer la veine porte et, une fois exposé, le perforer près du foie.</li>
	<li>Moins de 1 min, lentement et régulièrement injecter les îlots (0,2 mL de l’étape 3.4) dans la veine sous l’inspection de loupe pour éviter toute fuite d’îlots. Remarque : Après l’injection, toujours vérifier pour les autres îlots dans la seringue. Prélever 1 mL de médias P/FCS dans une seringue, encastrée dans une nouvelle boîte de Pétri et comte sous un microscope.</li>
	<li>Placez une jauge stérile sur le site de ponction et appliquer une pression avec le doigt d’index (profondeur de pénétration : 0,5-1 cm) pendant 6 min arrêter le saignement. Remarque : Le volume injecté ne doit pas dépasser 0,2 mL. Pression et un volume trop élevé peuvent endommager les îlots en raison de la contrainte de cisaillement.</li>
	<li>Placez soigneusement le situs intestin, péritoine, couche musculaire abdominal et carénage arrière en position.</li>
	<li>À l’aide de pince, soulever la peau et, fermer l’incision du muscle avec suture résorbable de soie et la couche supérieure de peau avec 2-3 clips.</li>
	<li>Nettoyer la surface avec un désinfectant de la peau, appliquer un guérisseur de la plaie et placez les souris dans des cages individuelles. Plaie guérisseur fournit une couche d’acrylique résistant à l’eau et protéger de macération et infection secondaire. Remarque : Observer les souris jusqu'à ce qu’ils ont repris conscience suffisante, fournir tramadol (0,2 mg / souris), ainsi que des fluides. Dans ce protocole, souris récupéré de l’anesthésie rapidement et l’administration de tramadol réduit la douleur. Après 7 jours, la plaie doit guérir.</li>
	<li>Nourrir les souris avec l’eau et de nourriture. Excrétion nourriture et l’eau de consommation et de l’urine va augmenter après l’injection de streptozotocine.</li>
	<li>Mesurer la glycémie chaque jour, pendant la première semaine et puis une fois par semaine chez les souris syngéniques. Chez les souris allogéniques, mesurer le taux de glucose sanguin trois fois par semaine pendant 15 jours.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+as+an+alternative+site+for+islet+transplantation.">Bone marrow as an alternative site for islet transplantation.</a> Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).</li><li>Echeverri, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+gastric+submucosal+transplantation+of+islets+(ENDO-STI):+technique+and+initial+results+in+diabetic+pigs.">Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs.</a> American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).</li><li>Korsgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+islet+engraftment+is+critical+for+successful+clinical+islet+transplantation.">Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation.</a> Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).</li><li>Lingwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+gelatinase+B+(matrix+metalloprotease-9)+activity+reduces+cellular+inflammation+and+restores+function+of+transplanted+pancreatic+islets.">Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets.</a> Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+intraportal+islet+transplantation+outcome+by+systemic+IKK-beta+inhibition:+NF-kappaB+activity+in+pancreatic+islets+depends+on+oxygen+availability.">Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability.</a> American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).</li><li>Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+aspects+are+critical+for+carrying+out+intraportal+islet+transplants+successfully+in+a+diabetes+mouse+model.">Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Rother, K. I., Harlan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+islet+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes+mellitus.">Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+islets+are+essential+for+successful+intraportal+transplantation+in+a+diabetes+mouse+model.">Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).</li><li>Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+of+Type+1+Diabetes+Mellitus:+From+Pancreatic+Islet+Transplantation+to+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 22 (2016).</li></ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Dans cette étude, la route intraporte de la transplantation d’îlots pancréatiques est explorée. Ce protocole est très efficace pour soulager le stress diabétique et approfondie permet d’explorer études de transplantation d’îlots pancréatiques. Ce protocole confirme qu’environ 350 îlots murins sont capables d’inverser l’État hyperglycémique. Par ailleurs, aucune des souris sont morts au cours de la procédure, et contrôle de la glycémie ont été accompli dans tous les destinataires. Taux de glucose sanguin et de poids corps ont été régulièrement enregistrés afin de tenir compte de la compétence, norme et fonctionnalité des îlots transplantés en inversant l’hyperglycémie. Chez les souris syngeneically transplantés, la glycémie ont été mesurée chaque jour pendant la première semaine et une fois par semaine par la suite. Après transplantation d’îlots, condition hypoxique et d’autres facteurs déclenchent les cellules endothéliales pour sécréter des facteurs pro-angiogéniques tels que VEGF après 14 jours et ainsi augmenter la prise de greffe vasculaire dans le foie, comme illustré à la Figure 3. Chez les souris allogéniques, niveaux de glucose de sang ont été mesurés trois fois par semaine pendant 15 jours. Après 15 jours, les îlots transplantés ont été rejetées dans le modèle allogénique en raison d’une attaque immunitaire, à moins que les immunosuppresseurs sont administrés
Il existe plusieurs protocoles d’isolement îlot publiés dans littérature10,11. Le plus simple est de choisir des îlots manuellement sur la base de leur taille et leur morphologie après digestion de collagénase. C’est une des étapes plus cruciales pour sélectionner uniquement les îlots et pour éviter les cellules exocrines, débris, etc. certains îlots devrait être maintenue à 37 ° C durant la nuit dans un incubateur pour leur permettre de récupérer à partir de contraintes mécaniques rencontrés au cours de la digestion mode opératoire. Le choix de la dose de streptozotocine et la transplantation d’îlots pancréatiques intraporte sont également essentiels au présent protocole. La température du corps devrait être réglementée et maintenu à l’aide d’une plaque thermique tout au long de l’intervention chirurgicale. Gaze stérile doit être appliquée avec une pression minimale de 6 min sur le site de ponction pour éviter les saignements. Souris doivent être gardés sous observation jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante.
Certaines étapes dans le présent protocole peuvent être modifiés. Par exemple, l’optimisation de la durée de la digestion et le volume de collagénase peuvent augmenter le rendement des îlots dans les souches de souris différentes. Au lieu de l’induction rapide du diabète (180 mg/kg de streptozotocine), augmentant lentement l’hyperglycémie peut être induite à l’aide d’une dose plus faible sur une longue période de temps (par exemple, 40 mg/kg/streptozotocine jour pendant 5 jours consécutifs). Cela pourrait fournir la meilleure greffe des îlots transplantés. Autres sites, tels que la moelle osseuse, pochette épiploïques, région intramusculaire, surface de la muqueuse gastrique, rate et le rein peuvent être explorées comme solution de rechange à la veine intraporte.
Mauvaise prise de greffe d’îlots transplantés est toujours une préoccupation majeure dans les essais cliniques. D’autres incluent une pénurie de donneurs, incohérences dans le maintien de taux de glucose sanguin après une transplantation et immunosuppression induite par le sang des réactions12,13. Manque de méthodes pour évaluer la bonne prise de greffe est un autre obstacle. Suivi des îlots transplantés par résonance magnétique ou l’imagerie de la bioluminescence pourrait éventuellement remplacer les méthodes classiques telles que le test de tolérance au glucose ou la c-peptide. À l’avenir, les cellules souches transplantées avec îlots pourraient fournir nutritionnelle et immunomodulateurs soutenir14.

Transplantation d’îlots pancréatiques est une approche prometteuse pour traiter 1 diabète sucré de type1. La première tentative de transfert d’un fragment du pancréas de moutons dans un patient diabétique a été interprétée par Watson Williams en 1893. Cependant, une percée majeure dans la transplantation d’îlots clinique a été réalisée avec le protocole d’Edmonton, et par la suite, une série de programmes nationaux ont été développés2. Dans le passé, plusieurs sites, comme la moelle osseuse, pochette épiploïques, région intramusculaire, surface de la muqueuse gastrique, rate et capsule rénale, ont été explorés dans les modèles précliniques, mais le système veineux portal est considéré comme un des sites adaptés et efficaces pour les programmes cliniques3,4,5,6.
L’administration d’insuline exogène peut être remplacée par perfusion d’îlot dans la veine porte. Ceci est considéré comme un site privilégié parce que l’alimentation en oxygène est comparable à celle du pancréas natif en raison de la situation en aval du confluent du portail artère et veine. De plus, il y a une grande surface, afin de préserver la structure tridimensionnelle des îlots peut-être être et vascularisation pourrait être facilitée5. Dans une souris diabétique bénéficiaire, 2 000 équivalents humains ou porcins îlot ou souris 350 îlots sont adéquates pour renverser l’État hyperglycémique7,8. Euglycémique niveaux ont été rapportés pendant 15 jours chez la souris destinataire des îlots xénogéniques et dans le modèle de souris allogénique et plus de 120 jours à la transplantation à-souris syngénique.
Facteurs pertinents à l’efficacité de la transplantation d’îlots via la veine porte sont appropriée anesthésie, méthode de ponction et hémostase9. L’anesthésie peut être induite par l’inhalation (5 % isoflurane) ou injection (kétamine, xylazine ou pentobarbital), et les substances sont souvent combinés. Pour le contrôle de la profondeur et le temps de l’anesthésie, convient à l’état de la souris, telles que la couleur de la muqueuse, paupière, réflexe cornéen, la fréquence respiratoire et la température corporelle. Il est important de s’assurer que l’animal n’est pas mal et qu’il survit à l’opération. La température peut être maintenue par des appareils de chauffage différents, tels que les coussins chauffants, ampoules d’éclairage rouge, etc. A chaud plaque thermique a été utilisé pour maintenir une température de 25-30 ° C entre la souris et la table d’opération, qui empêche l’apparition de hypothermie. Les dosages des anesthésiques sont importants, car chacun d’eux sont métabolisés par le foie et la fonction hépatique peut être transitoirement désordonnée par l’infusion de la suspension de l’îlot. Le point idéal de ponction de la veine porte est la position entre la première et la deuxième veine affluent.
Le nombre d’îlots et le volume d’injection prévu également influence le résultat de la transplantation, comme un volume trop élevé peut augmenter la contrainte de cisaillement. Un volume de 0,2 mL est jugé approprié pour la transplantation d’îlots dans la veine porte. La blessure de perforation (aiguille de calibre 26) induit des saignements de la veine porte, qui doit être arrêté de façon rapide et efficace. Gaze stérile ou un doigt peut être appliqué avec une pression minimale sur le site de la piqûre pendant environ 6 minutes arrêter le saignement. Prises îlot ensemble, portail injection est efficace et fournit le règlement sur le taux de glucose sanguin chez les modèles murins diabétique induite chimiquement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td>C57Bl/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>NMRI nude mice</td>
			<td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>(10-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Bela-pharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe, 23G and 26G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Gauze</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking Water bath</td>
			<td>Kotterman</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose Meter&#160;</td>
			<td>One Touch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm Thermal Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Braunol (povidone-iodide solution)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG</td>
			<td>3864154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)</td>
			<td colspan="2">Dr. G Mann Chem.-Pharm.&#160; GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Flow Bench</td>
			<td>Herdus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-0 Silk Suture Vicryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>(7.5 *1.75mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Michel Clamps (clips)</td>
			<td>Aesculap&#160;</td>
			<td>BN507R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P/FCS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21180-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCM-199 (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21180-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1 M)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 1613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamycin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ciprofloxacin</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#39;s Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11213865001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptozotocin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>572204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OPSITE-spray (wound healer)</td>
			<td>Smith and nephew</td>
			<td>66004978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Reugular food</td>
			<td>Altromin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Head light LED 16042 (magnifying glass)</td>
			<td>Eschenbach</td>
			<td>16042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody</td>
			<td>Millipore, Chemicon</td>
			<td>CBL1337</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-rat secondary antibody</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712095153</td>
			<td>Dilution (1:400)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-guinea pig secondary antibody</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-259-148</td>
			<td>Dilution (1:400)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model

La transplantation d’îlots pancréatiques pour réduire l’hyperglycémie est très réussie chez les rongeurs souffrant de diabète chimiquement induite. Le site de transplantation plus courant dans la transplantation d’îlots expérimentale est la capsule rénale. Toutefois, comme on connaît moins l’interaction des îlots pancréatiques avec les constituants du sang, il est également judicieux d’utiliser l’approche de la veine porte dans la transplantation d’îlots expérimentale.
Ce protocole montre une technique de transplantation îlot intraporte chez la souris nude NMRI. Streptozotocine (180 mg/kg) est injecté par voie intrapéritonéale pour provoquer l’hyperglycémie chez les bénéficiaires. Ils sont considérés comme diabétique à un non-jeûne glycémie supérieures à 20 mmol/L. Un jour avant la greffe, les îlots pancréatiques de souris sont isolés par le pancréas du donneur par digestion de collagénase ; un minimum de 350 îlots sont utilisés par le destinataire diabétique. Selon le rendement d’isolation îlot, souris de donateurs de deux ou plusieurs sont utilisés par le destinataire. Après une culture à 37 ° C, les îlots sont administrés dans le destinataire foie via la veine porte. Après la chirurgie, les souris sont protégées dans des maisons de Makrolon rouges et observées jusqu'à sont éveillés. Ce protocole maintienne un équilibre glycémique pour 120 jours chez les souris syngéniques et 15 jours chez les souris allogéniques.

La compétence des îlots transplantés a été étudiée chez des souris diabétiques induites chimiquement. Les îlots ont été transplantés via le système veineux portal dans le modèle de souris diabétiques. Le ratio entre donateurs et bénéficiaires était de 2:1. Dans le modèle souris syngénique, deux souris de bailleurs de fonds ont été utilisés pour obtenir 350 îlots. Les îlots ont été ensuite transplantées chez des souris diabétiques. Une réduction des taux de glycémie a été observée le jour 1 après la transplantation, suggérant un rôle d’îlots pancréatiques transplantés dans la réduction de la glycémie. Streptozotocine a augmenté le niveau de glucose de sang jusqu'à environ 22 mmol/L. Une baisse de la glycémie à 4,6 mmol/L (jour 1) a été observée après transplantation d’îlots pancréatiques (Figure 1 a). Normoglycémie a été maintenue jusqu'à 121 jours, comme le montre la Figure 1 a. Le niveau de glucose de sang et poids corps suivi à peu près le même schéma. Après l’injection de streptozotocine et de chirurgie, le poids corporel a diminué. Partir du jour 2, il tend à augmenter vers la normale, de 25,3 g (J4) à 29,7 g (jour 121), comme illustré à la Figure 1 b.
Dans le cas de majeur d’histocompatibilité (CMH) souris dépareillées, 350 îlots de deux souris C57Bl/6 (H2d) ont été transplantées dans des souris BALB/c (H2b) diabétiques. Après injection de streptozotocine, le taux de glycémie a augmenté jusqu'à 26,6 mmol/L. Après transplantation d’îlots pancréatiques, le taux de glycémie a chuté à 4,4 mmol/L (jour 1 ; Figure 2 a). Normoglycémie (4,44 à 7,2 mmol/L) a été observée pendant 10 jours, mais pas après 15 jours (20,1 mmol/L). Le poids corporel des souris diabétiques est passé de 26 g (journée -3), 23 g (jour 0) et à la suite 21,5 g (jour 1). Après la transplantation, le poids du corps une reprise progressive de 23 g (jour 2) à 25 g (10 jours). En raison de l’incompatibilité de MHC, le taux de glycémie a augmenté et le poids corporel a diminué de 10 jours après la transplantation d’îlots pancréatiques (Figure 2 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig1.jpg"> Figure 1 : Effet de la transplantation d’îlots syngénique. (A) le niveau de glucose sanguin a été mesurée à différents moments chez des souris diabétiques streptozotocine (n = 3). Une dose unique de streptozotocine (180 mg/kg) a été injectée avant la transplantation de 350 îlots à chaque destinataire (jour 0). Le niveau de glucose de sang (mmol/L) a été mesuré jusqu'à 121 jours (journée -3 : 17 ± 2,3 ; jour 0 : 22,6 ± 1 ; jour 1 : 4,6 ± 0,3 ; jour 5 : 7,5 ± 0,4 ; et jour 121 : 5,3 ± 0,09). (B) augmentation du poids corporel après transplantation d’îlots pancréatiques. Les données ci-dessus représentent la moyenne ± l’écart-type. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig2.jpg"> Figure 2 : Effet de la transplantation d’îlots pancréatiques allogéniques. (A) le niveau de glucose sanguin a été mesurée à différents moments chez des souris diabétiques streptozotocine (n = 2). Une dose unique de streptozotocine (180 mg/kg) a été injectée avant la transplantation d’îlots pancréatiques 350 (jour 0). Le niveau de glucose de sang (mmol/L) a été mesuré jusqu'à 15 jours (jour -1 : 25.5 ± 5,3 ; jour 0 : 26,6 ± 1,4 ; jour 2:8 ± 0,9 ; jour 10 : 6,2 ± 0,08 ; et jour 15 : 20,1 ± 1,6). État normoglycémique a été maintenue pendant 10 jours et par la suite, les concentrations de glucose sanguin augmentent. (B) suivi de poids avant et après la transplantation d’îlots. Les données représentent la moyenne ± l’écart-type. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig3.jpg"> Figure 3 : Photo représentant immunostaining des îlots pancréatiques transplantés dans le foie: laver la partie du foie (5 µm) avec du PBS, bloc avec sérum âne 10 % suivie d’une nuit d’incubation à 4 ° C avec l’anticorps primaire de l’insuline (1/500) et de plaquettes cellules endothéliales adhésion molécule PECAM-1 anticorps primaire (au 1/100). Lendemain, tache avec des anticorps secondaires pendant 1 h, laver avec du PBS, tache de compteur avec Hoechst et capturer les images avec Leica microscope à fluorescence. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

La transplantation d’îlots pancréatiques est une façon d’atteindre la normoglycémie dans le diabète de type 1. Cet article se concentre sur la technique de transplantation la voie intraporte de maintenir une glycémie normale chez des souris diabétiques.

Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

intraportal-transplantation-of-pancreatic-islets-in-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.4K vues.  Clinical Research Lab. La transplantation d’îlots pancréatiques est une façon d’atteindre la normoglycémie dans le diabète de type 1. Cet article se concentre sur la technique de transplantation la voie intraporte de maintenir une glycémie normale chez des souris diabétiques.

Vidéo: Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modèle murin de In utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Recherche

Médecine

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of lesions, and/or chronic pharmaceutical management of pain and infertility symptoms. The cost associated with endometriosis has been estimated at 22 billion dollars per year in the United States1. To further our understanding of mechanisms underlying this enigmatic disease, animal models have been employed. Primates spontaneously develop endometriosis and therefore primate models most closely resemble the disease in women. Rodent models, however, are more cost effective and readily available2. The model that we describe here involves an autologous transfer of uterine tissue to the intestinal mesentery (Figure 1) and was first developed in the rat3 and later transferred to the mouse4. The goal of the autologous rodent model of surgically-induced endometriosis is to mimic the disease in women. We and others have previously shown that the altered gene expression pattern observed in endometriotic lesions from mice or rats mirrors that observed in women with the disease5,6. One advantage of performing the surgery in the mouse is that the abundance of transgenic mouse strains available can aid researchers in determining the role of specific components important in the establishment and growth of endometriosis. An alternative model in which excised human endometrial fragments are introduced to the peritoneum of immunocompromised mice is also widely used but is limited by the lack of a normal immune system which is thought to be important in endometriosis2,7. Importantly, the mouse model of surgically induced endometriosis is a versatile model that has been used to study how the immune system8, hormones9,10 and environmental factors11,12 affect endometriosis as well as the effects of endometriosis on fertility13 and pain14.

A description of the surgical induction of endometriosis in mice and rats by auto-transplantation of uterine tissue to the arterial cascade of the intestinal mesentery.

Modèle murin d&#39;endométriose chirurgicalement induite par Auto-transplantation de tissu utérin

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Interventions chirurgicales pour un modèle de rat de transplantation hépatique orthotopique partielle avec reconstruction artérielle hépatique

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

Transplantation de valve pulmonaire en utilisant un modèle de souris de transplantation cardiaque hétérotopique

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Orthotopique Hind Limb transplantation chez la souris

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilisant la Technique de la manche dans un modèle murin de la greffe aortique - une vidéo d’instruction

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.