Vorremmo riconoscere Gundula Hertl per il suo sostegno.

Tutte le procedure in questo protocollo sono state approvate da linee guida e normativa sul benessere degli animali di tedesco. Considerare l'utilizzo di topi nudi di 10 a 12-week-old NMRI e topi C57Bl/6 (donatore: vecchia femmina; destinatario: maschio) durante gli esperimenti. Utilizzare topi nudi NMRI per isolamento dell'isolotto. Tenere i topi in condizioni definite secondo le normative di struttura animale locale.
1. induzione di diabete da Streptozotocin
<ol><li>Il giorno -4, misurare il peso corporeo di 10 a 12 settimana-vecchio NMRI nudi topi e topi C57Bl/6 utilizzando una macchina di pesatura.</li>
	<li>Secondo il peso corporeo misurato, preparare una dose di 180 mg/kg dello streptozotocin in 0,1 mL di soluzione fisiologica per topo. Nota: Streptozotocin dovrebbe essere appena preparata prima dell'uso e coperto con carta stagnola, in quanto è sensibile alla luce.</li>
	<li>Iniettare i topi syngeneic e allogenici ciascuno con una singola dose di 0,1 mL dello streptozotocin (180 mg/kg) per via intraperitoneale utilizzando un ago 26-G.</li>
	<li>Il giorno -3, -2 e -1 raccogliere 2-4 µ l di sangue da puntura le vene di coda dei topi non a digiuno.</li>
	<li>Utilizzare 2-4 µ l di campione di sangue a striscia reattiva per misurare il glucosio nel sangue in topi nudi NMRI e topi C57Bl/6 Nota: A questo punto, l'80% dei topi dovrebbe diventare diabetico (20 mmol/L).<ol>
<li>Utilizzare topi per trapianto dell'isolotto quando loro livelli di glucosio nel sangue raggiungono 20 mmol/L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento degli isolotti pancreatici dai topi
<ol><li>Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (20 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale con un ago 26-G. Nota: I volumi di ketamina e xilazina sono stati determinati secondo il peso corporeo degli animali (0,10 mL/10 g).</li>
	<li>Tenere i topi in posizione supina e disinfettare con soluzione povidone-iodio. Confermare l'eutanasia corretto controllando il riflesso di pedale. Nota: In caso di C57Bl/6 radere la regione addominale.</li>
	<li>Tenete la pelle con una pinzetta e fare un'incisione del midline con le forbici per esporre la cavità addominale. Posto il situs dell'intestino a sinistra e di fuori della cavità addominale su un impacco di garza sterile.</li>
	<li>Regolare lo stomaco in un'altra direzione per individuare il pancreas e gli altri associati tessuti.</li>
	<li>Raggiungere l'aorta e fare un piccolo taglio per drenare il sangue. Utilizzare garza sterile per assorbimento di sangue.</li>
	<li>Rimuovere con cura l'intestino. Separare il pancreas dallo stomaco e milza.</li>
	<li>Asportare il pancreas e metterlo in una capsula Petri fresco. Rimuovere tutti i materiali indesiderati, quali grassi, usando il forcipe.</li>
	<li>Riempire una siringa da 5 mL con 4 mL di collagenasi e iniettare nel pancreas con un ago da 26 G (soluzione: 30 mg di collagenasi in 12 mL di soluzione di Hank).</li>
	<li>Tritare il pancreas con le forbici per aumentare la superficie per una migliore digestione e trasferirlo in una provetta tappo rosso 12 mL. Nota: Soluzione salina equilibrata di Hank: HBSS 10 x (100 mL), penicillina-streptomicina (10ml), gentamicina (1 mL), ciprofloxacina (10ml), HEPES (35 mL), distillato di H2O (900 mL)</li>
	<li>Eseguire una digestione per 10 min a 37 ° C in un bagnomaria con agitazione. Vortexare il campione tre volte a intervalli regolari per 15 s.</li>
	<li>Mescolare energicamente il pancreas digerito a mano per 3 min e posizionarlo sul ghiaccio per 10 s.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di soluzione di Hank fredda per fermare la reazione di digestione e centrifugare a 560 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e sciogliere la pastiglia in 10 mL di terreno di siero (P/FCS) vitello Parker/fetale a temperatura ambiente. Nota: Medio P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicillina-streptomicina (10ml), HEPES (20 mL), distillato di H2O (900 mL)</li>
	<li>Identificare gli isolotti sulla base della loro morfologia (sferoide, colore bruno-dorato) sotto un microscopio chiaro. Evitare di isolotti con centri di scuri. Verifica per purezza e vitalità eseguendo Ditizone macchiatura sotto un microscopio chiaro. Nota: Ditizone si lega allo ione zinco e fornisce la macchia di colore rosso agli isolotti.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta 1 mL per contare e accuratamente isolotti sotto un microscopio chiaro e trasferirli su una piastra Petri fresca (60 x 15 mm) contenente 4 mL di terreno di P/FCS. Nota: Il volume di P /medie FCS di Petri non devono superare i 4 mL al fine di garantire la disponibilità di ossigeno.</li>
	<li>Mantenere gli isolotti isolati in 4 mL di terreno di P/FCS durante la notte a 37 ° C in un incubatore.</li>
</ol>3. preparazione degli animali per trapianto di insule pancreatiche
<ol><li>Rimuovere gli isolotti isolati da incubatore 37 ° C e metterli sotto una panchina di flusso. Centro gli isolotti con un movimento oscillante circolare del piatto Petri.</li>
	<li>Riempire una siringa 1 mL (ago 23-G blu) con 0,1 mL di terreno di P/FCS. Quindi, aggiungere 350 isolotti in 0,3 mL di soluzione di Hank. Tenere la siringa in posizione verticale per consentire gli isolotti di stabilirsi.</li>
	<li>Diminuire il volume a 0,05 mL e sostituire l'ago 23-G blu con un ago 26G marrone. La stessa siringa, aggiungere 0,15 mL di Ficoll (medio gradiente di densità) verso l'alto per raggiungere un volume finale di 0,2 mL in siringa. Evitare le bolle d'aria.</li>
	<li>Tenere la siringa in posizione verticale e ruotare leggermente per evitare l'agglutinamento di isolotti. Le isolette si depositerà presso il cono della siringa entro 2-3 min.</li>
	<li>Misurare i livelli di glucosio nel corpo peso e sangue dei topi destinatari; i livelli di glucosio nel sangue dovrebbero essere circa 20 mmol/L.</li>
	<li>Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (20 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale con ago 26-G.</li>
	<li>Posizionare i mouse in posizione supina su una piastra termica calda (37 ° C). Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la punta.</li>
	<li>Pulire la regione addominale con soluzione povidone-iodio (disinfettante della pelle). Per evitare che gli occhi secchi, tenerli umidi con unguento oculare. Nota: In caso di C57Bl/6 radere la regione addominale.</li>
</ol>4. islet trapianto Intraportal per via
<ol><li>Il giorno 0, iniziare con una laparotomia tenendo la pelle con il forcipe e fare un 2-3 cm-incisione del midline lungo con una forbice. Posto una garza sterile bagnata comprimere intorno ai bordi della ferita per mantenerla umida.</li>
	<li>Posto il situs dell'intestino a sinistra e di fuori della cavità addominale sull'impacco di garza sterile. Nota: Mantenere umido durante tutta la procedura con soluzione di NaCl 0,9% pre-riscaldata o garza sterile imbevuto in una soluzione salina normale dell'intestino.</li>
	<li>Spostare il duodeno e individuare il pancreas. Individuare la vena portale situata presso il sito ventrale spingendo verso l'alto il pancreas. Utilizzare un dito e il pollice per esporre la vena portale e, una volta esposto, perforarla vicino al fegato.</li>
	<li>Entro 1 min, lentamente e costantemente iniettare gli isolotti (0,2 mL dal punto 3.4) nella vena portale sotto l'ispezione di lente di ingrandimento per evitare eventuali perdite di isolotti. Nota: Dopo l'iniezione, controllare sempre per isolotti rimanenti nella siringa. Prendere 1 mL di media P/FCS in una siringa, a filo in un fresco di Petri e conteggio al microscopio.</li>
	<li>Posizionare un misuratore sterile sul sito di puntura e applicare una pressione con il dito indice (profondità di penetrazione: 0,5-1 cm) per 6 min fermare l'emorragia. Nota: Il volume iniettato non deve superare 0,2 mL. Pressione e volume eccessivo può danneggiare le isolette a causa della sollecitazione di taglio.</li>
	<li>Posizionare con attenzione il situs dell'intestino, peritoneo, strato del muscolo addominale e fascia posteriore in posizione.</li>
	<li>Usando il forcipe, sollevare la pelle, chiudere l'incisione del muscolo con il suturare assorbibile di seta e strato superiore della pelle con 2-3 clip.</li>
	<li>Pulire la superficie con un disinfettante della pelle, applicare un guaritore ferita e posizionare i topi in gabbie individuali. Guaritore ferita fornisce un strato di acrilico resistente all'acqua e proteggere da macerazione e infezione secondaria. Nota: Osservare i topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente, fornire tramadol (0,2 mg per topo) insieme a fluidi. In questo protocollo, topi recupero dall'anestesia rapidamente e tramadol amministrazione ha ridotto il dolore. Dopo 7 giorni, dovrebbe guarire la ferita.</li>
	<li>Nutrire i topi con acqua e cibo normale. L'escrezione dell'urina e del consumo di cibo e acqua aumenterà dopo l'iniezione di streptozotocin.</li>
	<li>Misurare i livelli di glucosio nel sangue ogni giorno per la prima settimana e poi una volta a settimana in topi syngeneic. In topi allogenici, misurare i livelli di glucosio nel sangue tre volte a settimana per fino a 15 giorni.</li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

In questo studio, il percorso intraportal di trapianto dell'isolotto è esplorato. Questo protocollo è altamente efficace nell'alleviamento dello stress diabetico e fornisce un'opportunità di approfondimento per esplorare studi di trapianto dell'isolotto. Questo protocollo conferma che circa 350 isolotti murini sono in grado di invertire lo stato iperglicemico. Inoltre, nessuno dei topi morti durante la procedura e controllo glicemico è stato realizzato in tutti i destinatari. Livelli di glucosio nel sangue e peso del corpo sono stati regolarmente registrati per riflettere la competenza, standard e funzionalità delle insule trapiantate in retromarcia l'iperglicemia. In topi syngeneically trapiantati, i livelli della glicemia sono stati misurati ogni giorno per la prima settimana e una volta a settimana da allora in poi. Dopo il trapianto di isole, ipossia e altri fattori attivano le cellule endoteliali per secernere fattori pro-angiogenici quali VEGF dopo 14 giorni e quindi aumentare l'attecchimento vascolare nel fegato come mostrato nella Figura 3. In topi allogenici, livelli di glucosio nel sangue sono stati misurati tre volte a settimana per fino a 15 giorni. Dopo 15 giorni, isolotti trapiantati sono stati rifiutati nel modello allogenico a causa di un attacco immunitario, a meno che non vengono somministrati farmaci immunosoppressori
Esistono diversi protocolli di isolamento dell'isolotto pubblicati in letteratura10,11. Il più semplice è quello di scegliere gli isolotti manualmente in base alle loro dimensioni e morfologia dopo digestione della collagenosi. Questa è una delle fasi più cruciali per selezionare solo gli isolotti e per evitare le cellule esocrine, detriti, ecc. Selected isolotti dovrebbe essere mantenuta a 37 ° C durante la notte in un'incubatrice per consentire loro di recuperare dallo stress meccanico durante la digestione procedura. La selezione della dose streptozotocin e il trapianto dell'isolotto intraportal sono anche la chiave per questo protocollo. La temperatura corporea dovrebbe essere regolata e mantenuta utilizzando una lastra termica durante tutta la procedura chirurgica. Garza sterile deve essere applicata con una pressione minima per 6 min presso il sito di puntura per evitare sanguinamenti. Topi devono essere tenuti sotto osservazione fino a quando non riacquistano sufficiente coscienza.
Alcuni punti in questo protocollo possono essere modificati. Ad esempio, l'ottimizzazione del tempo di digestione e il volume della collagenasi può aumentare il rendimento degli isolotti in ceppi di topi diversi. Invece la rapida induzione del diabete (streptozotocin di 180 mg/kg), aumentando lentamente l'iperglicemia può essere indotta tramite una dose più bassa per un periodo prolungato di tempo (ad es., 40 mg/kg/streptozotocin giorno per 5 giorni consecutivi). Questo potrebbe fornire migliore attecchimento delle insule trapiantate. Altri siti, come il midollo osseo, borsa omentale, regione intramuscolare, superficie mucosa gastrica, milza e rene possono essere esplorati come alternative alla vena intraportal.
Scarso attecchimento delle insule trapiantate è ancora delle principali preoccupazioni negli studi clinici. Altri includono una carenza di donatori, incoerenze nel mantenimento di livelli di glucosio nel sangue dopo trapianto, immunosoppressione e reazioni mediate sangue12,13. Mancanza di metodi per valutare il corretto attecchimento è un altro ostacolo. Rilevamento delle isole trapiantate di bioluminescenza imaging o risonanza magnetica potrebbe eventualmente sostituire metodi classici come il test di tolleranza al glucosio o il c-peptide. In futuro, cellule staminali trapiantate insieme isolotti potrebbe fornire nutrizionale e immunomodulanti supporto14.

Trapianto dell'isolotto è un approccio promettente per il trattamento di tipo 1 diabete mellito1. Il primo tentativo di trasferire un frammento del pancreas di pecore in un paziente diabetico è stato effettuato da Watson Williams nel 1893. Tuttavia, un importante passo avanti nel trapianto di insule pancreatiche clinica è stato realizzato con il protocollo di Edmonton, e da allora in poi, una serie di programmi nazionali sono stati sviluppati2. In passato, diversi siti, quali il midollo osseo, borsa omentale, regione intramuscolare, superficie mucosa gastrica, milza e capsula del rene, sono stati esplorati in modelli preclinici, ma il sistema venoso portale è considerato come uno del sito adatto ed efficace per programmi clinici3,4,5,6.
Somministrazione esogena di insulina può essere sostituito dall'infusione dell'isolotto nella vena portale. Questo è considerato un sito preferito, perché l'apporto di ossigeno è paragonabile a quella del pancreas nativo a causa della posizione a valle della confluenza del portale dell'arteria e della vena. Inoltre, c'è una grande superficie, così che la struttura tridimensionale degli isolotti può essere conservata e vascolarizzazione potrebbe essere agevolato5. In un destinatario topo diabetico, 2.000 equivalenti di isolotto umana o suina o mouse 350 isolotti sono adeguati per invertire il stato iperglicemico7,8. Livelli di euglycemic sono stati segnalati per 15 giorni nel modello murino destinatario degli isolotti xenogeneic e nel modello di trapianto allogeneic del mouse-a-mouse e per più di 120 giorni nel trapianto syngeneic del mouse-a-mouse.
Fattori pertinenti per l'efficacia di trapianto dell'isolotto via vena portale sono appropriata anestesia, metodo di puntura e di emostasi9. L'anestesia può essere indotta da inalazione (5% isoflurano) o iniezione (ketamina, xilazina o pentobarbital), e le sostanze sono spesso combinate. Per il controllo della profondità e tempo di anestesia, si dovrebbe prestare attenzione allo stato del mouse, ad esempio il colore della membrana mucosa, palpebra, riflesso corneale, frequenza respiratoria e temperatura corporea. È importante garantire che l'animale non è in difficoltà e che sopravvive l'operazione. La temperatura può essere mantenuta dai dispositivi di riscaldamento differenti, quali termofori, rosso lampadine, ecc A caldo piastra termica è stato utilizzato per mantenere una temperatura di 25-30 ° C tra il mouse e la tabella di funzionamento, che impedisce il verificarsi di ipotermia. I dosaggi degli anestetici sono importanti in quanto tutti loro sono metabolizzati dal fegato, e funzione epatica può essere transitoriamente disordinati dall'infusione della sospensione dell'isolotto. Il punto di puntura ideale per vena portale è la posizione tra la prima e la seconda vena tributaria.
Il numero di isolotti e il volume di iniezione prevista anche influenza l'esito del trapianto, come un volume eccessivo può aumentare la sollecitazione di taglio. Un volume di 0,2 mL è considerato appropriato per trapianto dell'isolotto nella vena portale. La ferita di perforatura (ago 26-gauge) induce emorragia dalla vena portale, che deve essere fermato in modo tempestivo ed efficace. Garza sterile o un dito può essere applicato con una pressione minima presso il sito della puntura per circa 6 minuti per fermare l'emorragia. Presi insieme, portale isolotto iniezione è efficace e fornisce il regolamento sopra i livelli della glicemia in modelli di topo diabetico chimicamente indotta.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>NMRI nude mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Bela-pharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 23G and 26G needle</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze</td><td>Fuhrmann</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water bath</td><td>Kotterman</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Braun</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Meter&amp;nbsp;</td><td>One Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm Thermal Plate</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braunol (povidone-iodide solution)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)</td><td>Dr. G Mann Chem.-Pharm.&amp;nbsp; GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fa. Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Bench</td><td>Herdus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Suture Vicryl</td><td>Braun</td><td></td><td>(7.5 *1.75mm)</td></tr><tr><td>Michel Clamps (clips)</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>P/FCS Solution</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>TCM-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Biochrom</td><td>L 1613</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Calbiochem</td><td>572204</td><td></td></tr><tr><td>OPSITE-spray (wound healer)</td><td>Smith and nephew</td><td>66004978</td><td></td></tr><tr><td>Reugular food</td><td>Altromin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Head light LED 16042 (magnifying glass)</td><td>Eschenbach</td><td>16042</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody</td><td>Millipore, Chemicon</td><td>CBL1337</td><td>Dilution (1:100)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>712095153</td><td>Dilution (1:400)</td></tr><tr><td>Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Dilution (1:500)</td></tr><tr><td>Donkey anti-guinea pig secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>706-259-148</td><td>Dilution (1:400)</td></tr></tbody></table>

intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model

Trapianto di isole pancreatiche per ridurre l'iperglicemia è altamente-riuscito nei roditori con diabete indotto chimicamente. Il sito più comune di trapianto trapianto di insule sperimentale è la capsula del rene. Tuttavia, come di meno è conosciuto circa l'interazione degli isolotti pancreatici con costituenti del sangue, ha anche senso di utilizzare l'approccio della vena portale nel trapianto di insule pancreatiche sperimentale.
Questo protocollo dimostra una tecnica di trapianto dell'isolotto intraportal in topi nudi NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) è iniettato intraperitonealmente per indurre l'iperglicemia nei topi di destinatario. Sono considerati come diabetico a un livello di glucosio nel sangue non a digiuno superiore a 20 mmol/L. Un giorno prima del trapianto, isolotti pancreatici del topo sono isolati dal pancreas donatore di digestione della collagenosi; un minimo di 350 isolotti sono utilizzata per ogni destinatario diabetica. A seconda del rendimento di isolamento dell'isolotto, due o più topi donatore sono utilizzati per ogni destinatario. Dopo coltura durante la notte a 37 ° C, isolotti sono amministrati nel destinatario fegato tramite la vena portale. Dopo la chirurgia, i topi sono protetti in case rosse Makrolon e osservati fino a sono svegli. Questo protocollo gestisce controllo glycemic per 120 giorni in topi syngeneic e 15 giorni in topi allogenici.

La competenza delle insule trapiantate è stata studiata in topi diabetici chimicamente indotti. Gli isolotti sono stati trapiantati tramite il sistema venoso portale nel modello di topi diabetici. Il rapporto donatore-destinatario era 2:1. Nel modello syngeneic del topo, due topi di donatore sono stati utilizzati per ottenere 350 isolotti. Gli isolotti sono stati poi trapiantati in topi diabetici. Stata osservata una riduzione nel livello di glucosio nel sangue il giorno 1 dopo trapianto, suggerendo un ruolo di isole pancreatiche trapiantate nel ridurre il livello di glucosio nel sangue. Streptozotocin ha aumentato il livello di glucosio nel sangue fino a circa 22 mmol/L. Un calo del livello di glucosio sangue a 4,6 mmol/L (giorno 1) è stato osservato dopo trapianto di insule pancreatiche (Figura 1A). Normoglycemia è stata mantenuta per fino a 120 giorni, come mostrato in Figura 1A. Il livello di glucosio nel corpo peso e sangue seguito più o meno lo stesso schema. Dopo l'iniezione di streptozotocin e chirurgia, è diminuito il peso corporeo. Dal giorno 2, tendeva a salire verso il normale, da 25,3 g (giorno 4) a 29,7 g (giorno 121), come mostrato in Figura 1B.
In caso di istocompatibilità (MHC) topi non corrispondenti, 350 isolotti da due topi C57Bl/6 (H2d) sono stati trapiantati in topi BALB/c (H2b) diabetici. Dopo iniezione di streptozotocin, il glucosio nel sangue è aumentato fino a 26,6 mmol/L. Dopo trapianto di insule pancreatiche, il livello di glucosio nel sangue è sceso a 4,4 mmol/L (giorno 1; Figura 2A). Normoglycemia (4,44 a 7,2 mmol/L) è stata osservata per fino a 10 giorni, ma non dopo 15 giorni (20,1 mmol/L). Il peso corporeo dei topi diabetici è sceso da 26 g (giorno -3) 23 g (giorno 0) e in seguito 21,5 g (giorno 1). Dopo il trapianto, il peso corporeo ha recuperato gradualmente da 23 g (giorno 2) 25 g (giorno 10). A causa di mancata corrispondenza di MHC, ha aumentato il livello di glucosio nel sangue e il peso corporeo è diminuito di 10 giorni dopo il trapianto di insule pancreatiche (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig1.jpg"> Figura 1 : Effetto di trapianto dell'isolotto syngeneic. (A) il livello di glucosio nel sangue è stata misurata a intervalli di tempo differenti in topi diabetici streptozotocin-indotti (n = 3). Una singola dose dello streptozotocin (180 mg/kg) è stata iniettata prima del trapianto di 350 isolotti a ciascun destinatario (giorno 0). Il livello di glucosio nel sangue (mmol/L) è stato misurato fino a 121 giorni (giorno -3: 17 ± 2.3; giorno 0: 22,6 ± 1; giorno 1: 4.6 ± 0,3; giorno 5: 7,5 ± 0,4; e giorno 121: 5,3 ± 0,09). (B) aumento del peso corporeo dopo trapianto dell'isolotto. I dati qui sopra rappresentano la media ± deviazione standard. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig2.jpg"> Figura 2 : Effetto del trapianto di insule pancreatiche allogeniche. (A) il livello di glucosio nel sangue è stata misurata a intervalli di tempo differenti in topi diabetici streptozotocin-indotti (n = 2). Una singola dose dello streptozotocin (180 mg/kg) è stata iniettata prima del trapianto di isole pancreatiche 350 (giorno 0). Il livello di glucosio nel sangue (mmol/L) è stato misurato per fino a 15 giorni (giorno -1: 25,5 ± 5.3; giorno 0: 26,6 ± 1.4; giorno 2:8 ± 0,9; giorno 10: 6.2 ± 0,08; e giorno 15: 20,1 ± 1.6). Lo stato normoglicemici è stato mantenuto per fino a 10 giorni e, successivamente, ha aumentato le concentrazioni di glucosio nel sangue. (B) follow-up del peso corporeo prima e dopo trapianto dell'isolotto. I dati rappresentano la media ± deviazione standard. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig3.jpg"> Figura 3 : Foto di immunostaining rappresentante delle insule pancreatiche trapiantate nel fegato: lavare la sezione del fegato (5 µm) con PBS, blocco con siero di 10% asino seguito da incubazione overnight a 4 ° C con l'anticorpo primario dell'insulina (1: 500) e delle piastrine delle cellule endoteliali adesione molecola PECAM-1 anticorpo primario (1: 100). Giorno successivo, macchia con gli anticorpi secondari per 1 h, lavare con PBS, contatore macchia con Hoechst e catturare le immagini con microscopio a fluorescenza Leica. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.5K Views.  Clinical Research Lab. Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Ricerca

Medicina

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Biologia

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioingegneria

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modello di topo per il trapianto di Pancreas usando una tecnica modificata polsino

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

Innesto di isole pancreatiche: un metodo per impiantare le isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per l'imaging in vivo

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...