이 연구는 반 안델 연구소 (Van Andel Research Institute)와 국립 보건원 (CA181343)에서 SBR

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생물 의학 연구 분야의 항체 신뢰도가 가장 중요합니다 46 , 47 . 이것은 히스톤 PTM의 풍부성과 분포를 특성화하기 위해 개발 된 대부분의 기술에 대한 핵심 도구로서 항체의 위치를 ​​고려할 때 염색질 생화학에서 특히 그렇습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성을 분석하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 최적화 된 파이프 라인을 상세히 설명합니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 히스톤 PTM 항체의 큰 숫자를 선별하는 데 사용되었으며,이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 히스톤 항체 특이성 데이터베이스 (www.histoneantibodies.com) (17)를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 우리와 다른 사람들의 연구에서 명백한 것은 histat PTM 항체 행동의 빈번한 사례로서 해석을 복잡하게 할 수 있습니다이들 시약들 ( 12 , 15 , 17)로 생성 된 데이터의 양 따라서 항체 회사의보다 엄격하고 포괄적 인 품질 관리 조치가 필요합니다. Experimentalists 및 epigenome 컨소시엄 리더 ( 예 : ENCODE, BLUEPRINT)는 연구를 위해 시약을 선택할 때 히스톤 PTM 항체에 대한 자체 평가를 엄격하게 제시해야합니다. 또한 배치 간 변동성을 최소화하고 epigenome 매핑 플랫폼에서 검증 된 친 화성 시약의 사용을 표준화하고 대체 친 화성 도구를 개발하는 노력은이 연구 문제를 해결할 수있는 실용적인 항목입니다. 마이크로 어레이는 히스톤 PTM 항체 특이성을 특성화하는데 특히 유용하게 만드는 마이크로 플레이트 기반 분석법 ( 예 : ELISA)에 비해 많은 이점을 가지고 있습니다. Microarrays는 수천 개의 개별 peptide-최소 물질 소비로 항체 상호 작용. 여기에 설명 된 프로토콜에서 각 펩타이드 기능 700 피코 몰로 100 microarray 슬라이드를 생산하는 데 충분합니다. 또한 항체 분석은 1 μg 미만의 항체를 사용하여 완료 할 수 있으며 사용자 정의 배열 형식을 사용하면 여러 항체 및 다양한 항체 희석을 동시에 선별 할 수 있습니다. 마이크로 어레이에서 맞춤형 피쳐 레이아웃을 설계하는 것은 힘든 작업이 될 수 있습니다. 또한, 각각의 새로운 마이크로 어레이 디자인은 새로운 분석 템플릿을 빌드 아웃해야합니다. 우리는 이것이 마이크로 어레이 기술의 완전한 유용성을 실현하는 데 엄청난 어려움이 있음을 발견했습니다. 이 ArrayNinja, 완벽하게 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 측면을 통합하는 대화 형, 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램의 우리의 개발 동기를 부여. ArrayNinja의 디자인 모듈을 사용하면 사용자가 실험에 필요한 레이아웃에 맞게 슬라이드를 대화식으로 디자인 할 수 있습니다. ArrayNinja virt프린터의 로보 모션을 매핑하여이를 주어진 슬라이드 디자인의 소스 플레이트 레이아웃으로 변환합니다 ( 그림 2 ). 사용자 정의 배열 형식을 만드는 것이 이제는 빠르고 일상적인 방법입니다. ArrayNinja의 또 다른 핵심 기능은 마이크로 어레이 작업의 설계 및 분석 단계 간의 연결입니다. 디자인 모듈의 사용자 정의 설정을 통해 ArrayNinja는 스캔 한 마이크로 어레이 이미지에 대화식 그리드를 오버레이하여 사용자가 임의의 기능 위에 마우스를 올려 자신의 신원을 밝히거나 원하는 기능을 검색 할 수있게합니다 ( 그림 4 ). 이 파이프 라인의 몇 가지 중요한 단계는 주목할 가치가 있습니다. 첫째, 인쇄 레이아웃을 설계하는 동안 데이터 수집에서 의미를 얻기 위해 충분한 복제 지점을 포함하는 것을 고려해야합니다. 또한 핀 대 핀 변동성을 고려하여 각 기능은 적어도 두 개의 서로 다른 핀으로 배치되어야합니다. 마지막으로, 아마도 가장 중요한 단계는 물리적 생성이온 소스 플레이트. 이 프로토콜에 설명 된 고밀도 마이크로 어레이의 성공적인 사용은 각 기능의 신원을 최종 슬라이드의 실제 위치에 매핑하는 기능에 달려 있습니다. 이 매핑 작업은 간단하지 않지만 ArrayNinja는 플레이트 맵을 제공하여이 단계를 크게 용이하게합니다. 소스 플레이트를 작성하는 동안이 맵에 편차가 있으면 분석 중에 잘못된 결론이 도출됩니다. 항체 특이성의 분석을 위해 마이크로 어레이를 사용하는 한계를 고려하는 것이 중요합니다. 어레이 캡처 오프 타겟 히스톤 PTM 항체의 성질과 유사한 혼성화 조건과 실험적인 방법으로 해석하는 것으로 입증되었지만 (예, 면역) 17, 18 정도는 항체 특이성 어레이 기반 프로파일 칩 프로토콜 변환되는 암시 14 , 17 하지만더 비판적 평가가 필요하다. 이 파이프 라인의 변형은 이전에 히스톤 독자, 작성자 및 지우개의 분석을 위해 설명되었습니다 23 , 24 . 후성 유전학 연구를 뛰어 넘는이 플랫폼을 수정하면 관심있는 인쇄 가능한 모든 라이브러리에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 펩타이드보다 더 복잡한 물질이 염색질 생화학 연구를위한 마이크로 어레이를 구성하는 데 사용될 수도 있습니다. 예를 들어, 다양한 PTMS를 표시하는 재조합 뉴 클레오는 이제 일상적 48 설정 및 미래 연구의 흥미로운 지역이 될 것입니다이 생리 학적으로 관련 염색질 서브 유닛의 맥락에서 히스톤 PTM 항체의 특이성을 프로파일 링 실험실에서 생성되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜에 대한 널리 사용되는 대체 방법은 SPOT 어레이 기술을 사용하여 수백 개의 펩타이드가 직접 cellu에서 합성됩니다멤브레인 지지력을 잃습니다 49 . 그런 다음 멤브레인 자체를 마이크로 어레이 어플리케이션에 사용할 수 있습니다 50 . SPOT 기술은 라이브러리 복잡성 및 합성 비용의 관점에서 유리합니다. 그러나 SPOT 방법을 사용하여 합성 된 펩타이드의 순도는 달라지며 고상 펩타이드 합성 ( 예 : HPLC 및 질량 분광법)에 공통된 품질 관리 및 정제 방법은 일상적으로 수행되지 않습니다 50 , 51 . 또한, 니트로 셀룰로즈상의 펩타이드 제시는 균일하지 않고 항원 결정기를 차폐 할 수있다. 특히 히스톤 펩티드 어레이 플랫폼의 두 가지 유형은 펩타이드를 합성하고 어레이를 제조하는 데 필요한 특수 장비에 대한 액세스 권한이없는 사용자를 위해 상업적으로 이용 가능하다.

게놈 DNA는 히스톤 단백질이있는 진핵 세포 핵 내부에 우아하게 포장되어 염색질을 형성합니다. 염색질의 반복적 인 아 단위는 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4 1) 의 8 량체 핵 주위에 감싸 진 147 염기쌍의 DNA로 구성된 뉴 소솜 (nucleosome)이다. 크로마 틴은 느슨하게 패킹 된 진균 염색체와 단단히 채워진 헤테로 크로마 틴 도메인으로 광범위하게 구성됩니다. 염색질 압축 정도는 단백질 기계가 복제, 전사 및 수리와 같은 기본적인 DNA 템플릿 공정을 수행하기 위해 기본 DNA에 접근 할 수있는 정도를 조절합니다. 염색체의 맥락에서 게놈 접근성의 주요 조절 인자는 히스톤 단백질 2 , 3 의 구조화되지 않은 꼬리와 핵심 부위의 PTM입니다. 히스톤 PTM은 염색질 4 의 구조에 직접적으로 영향을 미치고 간접적으로 기능합니다.염색질 개질, 효소 및 스캐 폴딩 활동을하는 독자 단백질 및 관련 거대 분자 복합체의 모집 5 . 지난 20 년간 히스톤 PTM 기능에 대한 연구는 세포의 운명, 유기체 발달 및 질병의 시작 / 진행을 조절하는 데 중요한 역할을한다는 것을 압도적으로 제안합니다. 질량 분석 기반 단백체 기술의 발전에 힘 입어, 80 명 이상의 서로 다른 히스톤 잔류 물에 20 개 이상의 고유 한 히스톤 PTMS는 6 발견되었다. 주목할 만하게,이 수정은 수시로 조합에서 생기고, &quot;히스톤 부호&quot;가설과 일치하여, 수많은 학문은 독자 단백질이 히스톤 PTMs의 특정한 조합의 승인을 통해 염색질의 불연속 지역에 표적으로 한 ㄴ다는 것을 건의한다 7 , 8 , 9 . 앞으로 나아갈 핵심 과제는 gr에 함수를 할당하는 것입니다.히스톤 PTM의 목록을 작성하고 히스톤 PTM의 특정 조합이 염색질과 관련된 동적 기능을 조율하는 방법을 결정할 수 있습니다. 항체는 히스톤 PTM의 검출을위한 lynchpin 시약입니다. 이와 같이, 염색질 생화학 연구에 사용하기 위해 1,000 개 이상의 히스톤 PTM 특이 적 항체가 상업적으로 개발되었습니다. 고효율 DNA 시퀀싱 기술의 급속한 발전으로이 시약은 ChIP-seq (염색질 면역 침전 및 차세대 시퀀싱)에서 개별 조사자와 대규모 후성 유전체학 &quot;로드맵&quot;이니셔티브 ( 예 : ENCODE 및 BLUEPRINT)에 광범위하게 사용되고 있습니다 ) 파이프 라인은 히스톤 PTM 분포 게놈 전체의 고해상도 공간 맵을 생성합니다 10 , 11 . 그러나 최근의 연구에 따르면 히스톤 PTM 항체의 특이성은 매우 다양 할 수 있으며 이러한 시약은 unfones<html> 오프 - 타겟 에피토프 인식, 이웃 PTM에 의한 강한 긍정 및 부정적인 영향, 특정 잔기 ( 예 : 모노 -, 디 - 또는 트리 - 메틸 리신)의 변형 순서 식별 어려움과 같은 유용한 특성 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 히스톤 PTM 특이 적 항체 시약의 엄격한 품질 관리가 이러한 유용한 시약으로 생성 된 데이터를 정확하게 해석하는 데 필요합니다. Microarray 기술은 높은 처리량, 재현성 및 소형화 된 포맷으로 수천 개의 거대 분자 상호 작용을 동시에 조사 할 수있게합니다. 이러한 이유로, 단백질 -DNA 19 을 분석하기 위해 다양한 마이크로 어레이 플랫폼이 만들어졌으며 ,&quot;&gt; (20), 단백질 - 단백질 21 단백질 펩타이드의 상호 작용 (22). 실제로, 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 작가, 지우개의 높은 처리량 프로파일 링을 가능하게 염색질 생화학 연구에 대한 정보를 검색 플랫폼으로 등장, 그리고 히스톤의 독자 PTMS 15있다 , 23, 24, 또한 히스톤 항체 특이성의 분석을 위해 17, 25. 염색질과 후성 유전학 연구에 자신의 응용 프로그램을 넘어, 히스톤 펩타이드 배열은 전신성 홍 반성 루푸스 등의자가 면역 질환에 대한 진단 / 예후 테스트 잠재적 인 유틸리티가 어디 방지 염색질자가 항체가 생성됩니다 26 , 27 . 여기서는 설계, 제작 및 큐를 위해 개발 한 통합 파이프 라인을 설명합니다.히스톤 및 그 PTM을 인식하는 항체에 대한 특이성 프로파일을 생성하기 위해 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이를 제조한다. 파이프 라인은 ArrayNinja, 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 단계를 통합하는 오픈 소스, 우리는 최근에 개발 된 대화 형 소프트웨어 응용 프로그램에 의해 촉진된다. ArrayNinja는 Google 크롬에서 가장 잘 작동합니다. 간단히 말하면, 로봇 접촉 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리 현미경 슬라이드상의 한정된 위치에 비오틴 - 컨쥬 게이트 된 히스톤 펩타이드의 라이브러리를 침착시킨다. 그런 다음 항체 - 항원 결정기 상호 작용을 조사하기 위해 경쟁적이고 평행 한 분석 형식으로 배열을 사용할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 펩타이드 라이브러리는 PTM (라이신 아세틸 화, 라이신 / 아르기닌 메틸화, 및 세린 / 트레오닌 인산화)이있는 수백 가지의 독특한 합성 펩타이드와 프로테오믹스 데이터 세트에서 주로 유래 된 적절한 조합으로 구성됩니다. 펩타이드 합성 및 검증 방법<html> 다른 곳에서 (23)에 자세히 설명되어 있습니다. 이 어레이 플랫폼을 사용하는 진행중인 히스톤 PTM 항체 스크리닝 작업에서 생성 된 데이터는 공개 웹 리소스 인 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에 보관됩니다. 특히,이 프로토콜의 변형으로 제작 된 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 히스톤 PTM 판독기 도메인 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 의 활성을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. PTM 작성자 및 지우개 활동 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이에서 항체 스크리닝을위한 Stepwise 절차의 카툰 묘사. 정의 된 번역 후 변형 (적색 및 청색 원)을 갖는 비 오티 닐화 히스톤 펩타이드는 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리상에 바이오틴 - 플루오 레세 인과 함께 인쇄된다. 양성 상호 작용은 적색 형광으로 시각화됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

히스톤 단백질에 대한 번역 후 변형 (PTMs)은 염색질 구조 및 유전자 발현 조절에서의 역할에 대해 널리 연구되고있다. 히스톤 PTM에 특이적인 항체의 대량 생산 및 분포는 이러한 표지에 대한 연구를 크게 촉진시켰다. 히스톤 PTM 항체는 많은 염색질 생화학 분야의 주요 시약이기 때문에 항체 특이성의 엄격한 분석이 정확한 데이터 해석과 현장에서의 지속적인 진보에 필요합니다. 이 프로토콜은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일 링하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 통합 파이프 라인을 설명합니다. 이 절차의 설계 및 분석 측면은 Microarray 인쇄 형식의 사용자 정의를 간소화하기 위해 최근 개발 한 오픈 소스 및 대화 형 소프트웨어 패키지 인 ArrayNinja를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용되고 널리 사용되고있는 히스톤 PTM 항체이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 Histone Antibody Specificity Database를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 히스톤을 넘어, 여기에 기술 된 일반적인 방법론은 PTM 특이 적 항체의 분석에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성의 분석을위한 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 설계하고 제조하는데 사용되었습니다. 이 어레이는 핵심 및 변형 히스톤 단백질에서 발견되는 PTM의 많은 조합을 나타내는 300 개 이상의 고유 한 펩타이드 기능 (20-40 잔기 길이) 라이브러리를 조회합니다 38 . 이 파이프 라인은 널리 사용되고 상업적으로 이용 가능한 많은 히스톤 PTM 항체의 스크리닝을위한 작업 원이었으며, 전체 데이터 세트는 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에서 이용할 수 있습니다. 17 세 우리의 파이프 라인의 백본 ArrayNinja, 마이크로 어레이 작업 (28)의 기획 및 분석 단계를 통합 우리가 최근에 개발 된 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램입니다. ArrayNinja 분석 모듈을 통해 사용자는 정보에서 상호 작용할 수 있습니다.raw 배열 이미지 파일을 사용하여 작업을 수행 할 수 있습니다. 인쇄 된 지형지 물 ID는 이미지와 자동으로 통합되며이 정체성은 마우스 커서를 한 지점 위로 가져 가면 나타납니다. 이 통합은 또한 이름순으로 관심 대상 기능을 신속하게 검색하고 다운 스트림 분석에서 기능을 제외 할 수 있습니다. ArrayNinja는 또한 로컬 및 비 로컬 배경 노이즈 보정 옵션뿐만 아니라 스폿 형태에 맞게 조정되는 구성표를 제공합니다. ArrayNinja와 그 기능에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다 28 . ArrayNinja는 각 펩티드 피처의 신호 강도를 계산하고 해당 쉐도우를 피처 아이덴티티를 기반으로 오류가있는 평균으로 집계합니다. 원시 및 정규화 된 신호 평균이 반환되며 정규화 상수는 가장 밝은 피쳐 평균으로 결정됩니다. 각 펩티드에 대한 신호 강도는 상대 친화도를 비교하는데 사용될 수있다<html> microarray에 특징 사이 항체의. 여기, 우리는이 시약으로 얻은 결과를 해석 할 때 고려해야하는 에피토프 인식 특성을 강조하면서이 파이프 라인으로 프로파일 링 된 두 개의 항체에 대한 대표적인 데이터 세트를 보여줍니다 ( 그림 5 ). 표적 밖의 인식은 모든 항체에 대한 관심사이며, 수정 가능한 히스톤 잔기를 둘러싼 에피토프의 공통점은 히스톤 PTM 항체에 대한 이러한 특별한 도전이된다. 실제로, 히스톤 H3 (H3K9me3)에있는 tri-methylated lysine 9를 인식하기 위해 제기 된 항체는 H3K18, H3K27 및 리신 20에서 히스톤 H4 (H4K20me3) 또는 H3K9me3 ( 그림 5A )보다 우수한 펩티드에 결합합니다. H3K9 (ARKS)를 둘러싼 서열은 H3K27과 보존되어 있으며, 히스톤 PTM 항체와 이들 부위를 결합하고 변형시키는 염색질 조절 인자의 교차 반응성은 다른 곳에서 주목을 받았다ss = &quot;xref&quot;&gt; 15 , 39 , 40 , 41 . 메틸 리신 항체에 공통적으로 관찰되는 또 다른 off-target 인식 특성은 메틸 순서를 구별 할 수 없다는 것이다. 이것은 H3K4me2 및 H3K4me1 펩타이드와 교차 반응하는 H3K4me3 항체로 얻은 결과로 예시됩니다 ( 그림 5B ). 연구 결과 H3K4me3, H3K4me2 및 H3K4me1이 게놈을 통해 다르게 분포되어 있고 다른 방식으로 기능 할 가능성이 있다는 것을 보여 주므로 메틸의 순서를 구별하는 것이 중요합니다 42 , 43 . 예를 들어, H3K4me3은 가장 활발히 전사 된 유전자의 전사 시작 부위에 위치하지만 활성 증강 인자는 일반적으로 H3K4me1 44 로 표시됩니다. 목표 이탈 인식 외에도 긍정적 및 부정적 영향e는 인접한 PTM에 의해 히스톤 항체의 일반적으로 관찰되는 특성이다. 도 5A에 나타낸 H3K9me3 항체는 인접한 라이신 잔기상의 아세틸기에 의해 양의 영향을 받는다. 실제로, 최근 질량 분석 분석은 아세틸 그룹, 특히 H3K14ac가 자주 H3K9me3 (38)와 함께 공동 발생하는 것을 알 수있다. 도 5B에 도시 된 H3K4me3 항체는 트레오닌 6 (H3T6p)에서 인접 인산화에 의해 부정적으로 영향을 받는다. H3T6p 리더 단백질에 의해 인식 H3K4me3 긍정적 및 부정적 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이는 특정 염색질 모집 45, 15 계수 조절에 대한 동적 메커니즘으로서 작용할 수있다. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55912/55912fig5.jpg" /> 도표 5 : 펩티드 Microarrays에 항체의 분석. 펩티드 마이크로 어레이에 대한 (A) H3K9me3 (항체 # 1) 및 (B) H3K4me3 (항체 # 2) 항체의 분석. 녹색 라인 / 막대는 의도 된 표적 PTM만을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 회색 선 / 막대는 모든 펩타이드의 평균 상대 강도를 표적 펩타이드와 비교하는 일원 분산 분석을 사용하여 계산 된 녹색 선 / 막대와 신호 강도가 현저히 다르지 않은 펩타이드를 나타낸다 (p&gt; 0.05). 빨간색 및 파란색 선 / 막대는 녹색 선 / 막대에서 크게 감소하거나 증가하는 신호를 나타냅니다 (p &lt;0.05). 주황색 선 / 막대는 표적 외의 펩타이드를 나타냅니다. 데이터는 H3 및 H4 꼬리의 N- 말단 영역에 걸쳐있는 펩타이드에 대한 PTM 복잡성의 시각적 인 일러스트레이션 (왼쪽)으로 표시되며, 각 라인의 너비는 해당 펩타이드 피처에 대해 측정 된 상대 강도와 일치하고, (오른쪽) 막대 그래프 6 개별 스폿 측정에서 상대적인 신호 강도 평균 ± SEM을 표시microarrays에 ments. 이 분석에 포함 된 모든 펩타이드는 히스톤 H3 아미노산 1 - 20 또는 15 - 34에 해당하는 20 아미노산 길이 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55912/55912fig5large.jpg" target="_blank">입니다.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

39.8K 조회수.  Van Andel Research Institute.  이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다. 

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

연구

생화학

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...