Diese Arbeit wurde zum Teil vom Van Andel Research Institute und einem Forschungsstipendium der National Institutes of Health (CA181343) an SBR unterstützt

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Zuverlässigkeit der Antikörper in biomedizinischen Forschungsanwendungen liegt im Mittelpunkt 46 , 47 . Dies trifft besonders für die Chromatin-Biochemie zu, da die Position von Antikörpern als Schlüsselinstrumente für die Mehrheit der Techniken zur Charakterisierung der Häufigkeit und Verteilung von Histon-PTMs entwickelt wurde. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine optimierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell erhältlichen und weit verbreiteten Histon-PTM-Antikörpern zu screenen, und Daten, die aus diesen Experimenten erzeugt wurden, sind frei verfügbar durch eine Online- und expandierende Histone-Antikörper-Spezifitätsdatenbank (www.histoneantibodies.com) 17 . Scheinbar aus unserer und anderen Arbeit sind häufige Fälle von ungünstigen Histon-PTM-Antikörper-Verhalten, die die interpretat komplizieren könnenIonen von Daten, die mit diesen Reagenzien 12 , 15 , 17 erzeugt wurden . Strengere und umfassendere Qualitätskontrollmaßnahmen von Antikörperfirmen sind daher gerechtfertigt. Experimente und epigenome Konsortialführer ( zB ENCODE, BLUEPRINT) müssen auch bei der Auswahl eines Reagenzes für ihre Studie Strenge in ihrer eigenen Auswertung von Histon-PTM-Antikörpern zeigen. Darüber hinaus vereinheitlichen die Bemühungen, die Charge-to-Batch-Variabilität zu minimieren, die Verwendung von hoch validierten Affinitätsreagenzien über epigenome Mapping-Plattformen zu standardisieren und alternative Affinitäts-Tools zu entwickeln, sind alle umsetzbaren Elemente, um dieses Forschungsproblem zu lösen. Mikroarrays haben eine Reihe von Vorteilen gegenüber Mikroplatten-basierten Assays ( zB ELISA), die sie besonders zur Charakterisierung der Histon-PTM-Antikörperspezifität veranlassen. Microarrays ermöglichen eine parallele und konkurrierende Analyse von Tausenden von einzelnen Peptid-Antikörper-Wechselwirkungen mit minimalem Materialverbrauch. In dem hier beschriebenen Protokoll sind 700 Picomolen jedes Peptidmerkmals ausreichend, um 100 Mikroarray-Objektträger zu erzeugen. Zusätzlich kann die Antikörperanalyse unter Verwendung von weniger als 1 &amp; mgr; g des Antikörpers abgeschlossen werden, und es können benutzerdefinierte Arrayformate mehrere Antikörper und verschiedene Antikörperverdünnungen parallel untersuchen. Das Entwerfen von benutzerdefinierten Layouts auf Microarrays kann eine aufwändige Aufgabe sein. Darüber hinaus erfordert jedes neue Microarray-Design den Aufbau einer neuen Analysevorlage. Wir haben festgestellt, dass dies für die Realisierung der vollen Nützlichkeit der Microarray-Technologie unerschwinglich ist. Das motiviert unsere Entwicklung ArrayNinja, eine interaktive, Open-Source - Software - Anwendung, die die Design- und Analyseaspekte von Microarray - Experimenten 28 nahtlos integriert. Das Designmodul von ArrayNinja ermöglicht es dem Benutzer, eine Folie interaktiv zu gestalten, um das für ein Experiment erforderliche Layout anzupassen. ArrayNinja virtOrdnet die Roboterbewegung des Druckers ordnungsgemäß ab und übersetzt diese auf das Quellplattenlayout für eine gegebene Gleitgestaltung ( Abbildung 2 ). Das Erstellen von benutzerdefinierten Array-Formaten ist jetzt eine schnelle und routinemäßige Praxis. Ein weiteres wichtiges Merkmal von ArrayNinja ist die Verbindung zwischen den Design- und Analyseschritten der Microarray-Arbeit. Mit benutzerdefinierten Einstellungen aus dem Design-Modul überlagert ArrayNinja ein interaktives Raster auf einem gescannten Mikroarray-Bild, so dass der Benutzer über eine beliebige Funktion hinausschauen kann, um seine Identität zu identifizieren oder nach interessanten Merkmalen zu suchen ( Abbildung 4 ). Mehrere kritische Schritte dieser Pipeline sind bemerkenswert. Zuerst sollte bei der Gestaltung des Drucklayouts berücksichtigt werden, dass genügend replizierte Punkte enthalten sind, um bei der Datenerfassung eine Signifikanz zu erlangen. Zusätzlich zur Berücksichtigung der Pin-to-Pin-Variabilität sollte jedes Merkmal durch mindestens zwei verschiedene Pins abgelegt werden. Schließlich ist vielleicht der kritischste Schritt der physische GeneratIon der Quellplatte. Die erfolgreiche Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen hochdichten Mikroarrays beruht auf der Fähigkeit, die Identität jedes Merkmals an ihren physischen Standort auf der letzten Folie abzubilden. Diese Mapping-Aufgabe ist nicht trivial, aber ArrayNinja erleichtert diesen Schritt durch die Bereitstellung einer Plattenkarte. Abweichungen zu dieser Karte bei der Erstellung der Quellplatten führen zu falschen Schlussfolgerungen während der Analyse. Es ist wichtig, die Einschränkungen der Verwendung von Mikroarrays für die Analyse der Antikörperspezifität zu berücksichtigen. Während auf der Array-Off-Ziel-Histon-PTM-Antikörper-Eigenschaften gezeigt wurden, dass sie mit ähnlichen Hybridisierungsbedingungen ( z. B. Immunoblot) 17 , 18 in experimentelle Ansätze umgesetzt werden, ist das Ausmaß, in dem die Array-basierte Profilierung der Antikörperspezifität auf ChIP-Protokolle übersetzt wird, suggestiv 14 , 17 aber waRrants mehr kritische auswertung Variationen zu dieser Pipeline wurden bisher für die Analyse von Histon-Lesern, Schriftstellern und Radierern 23 , 24 beschrieben . Das Ändern dieser Plattform für den Nutzen über die Epigenetikforschung hinaus könnte leicht für jede bedruckbare Bibliothek von Interesse angepasst werden. Es ist auch möglich, dass Material komplexer als Peptide verwendet werden kann, um Mikroarrays für die chromatinbiochemische Forschung zu konstruieren. Zum Beispiel werden rekombinante Nukleosomen, die verschiedene PTMs zeigen, nun routinemäßig in der Laborumgebung 48 erzeugt und die Spezifität der Histon-PTM-Antikörper im Rahmen dieser physiologisch relevanten Chromatin-Untereinheit wird ein spannender Bereich der zukünftigen Studie sein. Ein weit verbreiteter alternativer Ansatz für das hier beschriebene Protokoll nutzt die SPOT-Array-Technologie, bei der Hunderte von Peptiden direkt auf einer Cellu synthetisiert werdenDen Membranträger 49 verlieren. Die Membran selbst kann dann für Mikroarrayanwendungen 50 verwendet werden . Die SPOT-Technologie ist vom Standpunkt der Bibliothekskomplexität und der Synthesekosten aus vorteilhaft. Es wurde jedoch berichtet, dass die Reinheit der nach dem SPOT-Verfahren synthetisierten Peptide variiert und die Qualitätskontroll- und Reinigungsmaßnahmen, die der Festphasen-Peptidsynthese gemeinsam sind ( z. B. HPLC und Massenspektrometrie), werden nicht routinemäßig durchgeführt 50 , 51 . Zusätzlich ist die Peptidpräsentation auf Nitrocellulose nicht gleichmäßig und kann Epitope abschirmen. Bemerkenswerterweise sind beide Arten von Histon-Peptid-Array-Plattformen kommerziell für Benutzer verfügbar, die keinen Zugriff auf die spezialisierte Ausrüstung haben, die zur Synthese von Peptiden und Herstellung von Arrays benötigt wird.

Genomische DNA ist elegant im eukaryotischen Zellkern mit Histonproteinen verpackt, um Chromatin zu bilden. Die sich wiederholende Untereinheit von Chromatin ist das Nukleosom, das aus 147 Basenpaaren von DNA besteht, die um einen oktameren Kern von Histonproteinen - H2A, H2B, H3 und H4 1 gewickelt sind. Chromatin ist weitgehend in lose gepackten Euchromatin und fest verpackten Heterochromatin-Domänen organisiert. Der Grad der Chromatin-Verdichtung regelt das Ausmaß, in dem Protein-Maschineries auf die zugrunde liegende DNA zugreifen können, um fundamentale DNA-templated Prozesse wie Replikation, Transkription und Reparatur durchzuführen. Schlüsselregulatoren der Genomzugänglichkeit im Rahmen von Chromatin sind PTMs auf dem unstrukturierten Schwanz und Kerndomänen der Histonproteine 2 , 3 . Histone-PTMs funktionieren direkt durch die Beeinflussung der Struktur von Chromatin 4 und indirekt durchH die Rekrutierung von Leserproteinen und deren assoziierten makromolekularen Komplexen, die Chromatin-Remodeling-, Enzym- und Gerüstaktivitäten haben 5 . Studien der Histon-PTM-Funktion in den vergangenen zwei Jahrzehnten überwiegend vorschlagen, dass diese Markierungen spielen Schlüsselrollen bei der Regulierung der Zelle Schicksal, organismen Entwicklung und Krankheit Einleitung / Progression. Angetrieben durch Fortschritte in der Massenspektrometrie-basierten Proteomtechnologie wurden mehr als 20 einzigartige Histon-PTMs auf mehr als 80 verschiedenen Histonresten entdeckt 6 . Bemerkenswert ist, dass diese Modifikationen häufig in Kombinationen auftreten und im Einklang mit der &quot;Histon-Code&quot; -Hypothese sind, zeigen zahlreiche Studien, dass Leserproteine ​​auf diskrete Bereiche des Chromatins durch Erkennung spezifischer Kombinationen von Histon-PTMs 7 , 8 , 9 gerichtet sind . Eine zentrale Herausforderung, die vorwärts geht, wird es sein, dem grEine Liste von Histon-PTMs und zu bestimmen, wie spezifische Kombinationen von Histon-PTMs die mit Chromatin verbundenen dynamischen Funktionen orchestrieren. Antikörper sind die Lynchpin-Reagenzien für den Nachweis von Histon-PTMs. Als solche wurden mehr als 1.000 Histon-PTM-spezifische Antikörper kommerziell für den Einsatz in der Chromatin-Biochemie-Forschung entwickelt. Mit der rasanten Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie mit hohem Durchsatz werden diese Reagenzien ausgiebig von einzelnen Forschern und großflächigen epigenomischen &quot;Roadmap&quot; -Initiativen ( zB ENCODE und BLUEPRINT) in ChIP-seq (Chromatin-Immunpräzipitation gepaart mit Sequenzierung der nächsten Generation) eingesetzt ) Pipelines zur Erzeugung hochauflösender räumlicher Karten der Histon-PTM-Verteilung genomweit 10 , 11 . Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass die Spezifität von Histon-PTM-Antikörpern sehr variabel sein kann und dass diese Reagenzien unf<html> Austretende Eigenschaften wie z. B. Off-Target-Epitop-Erkennung, starker positiver und negativer Einfluss durch benachbarte PTMs und Schwierigkeiten, die Modifikationsreihenfolge an einem bestimmten Rest ( z. B. Mono-, Di- oder Tri-Methyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 zu unterscheiden , 16 , 17 , 18 Daher ist eine rigorose Qualitätskontrolle von Histon-PTM-spezifischen Antikörperreagenzien notwendig, um die mit diesen wertvollen Reagenzien erzeugten Daten genau zu interpretieren. Die Microarray-Technologie ermöglicht die gleichzeitige Abfrage von Tausenden von makromolekularen Wechselwirkungen in einem hochdurchsatz-, reproduzierbaren und miniaturisierten Format. Aus diesem Grund wurde eine Vielzahl von Microarray-Plattformen geschaffen, um die Protein-DNA 19 zu analysieren ,„&gt; 20, Protein-Protein - 21 und Protein-Peptid - Wechselwirkungen 22. In der Tat, Histon - Peptidchips haben als informative Plattform zur Entdeckung für Chromatin - Biochemie Forschung entstanden, Hochdurchsatz - Profilierung der Autoren, Radiergummis ermöglicht, und die Leser von Histon PTM 15 , 23 , 24 und auch für die Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität 17 , 25. Über ihre Anwendung in der Chromatin- und Epigenetikforschung hinaus haben Histon-Peptid-Arrays potentielle Nutzen als diagnostischer / prognostischer Test für systemischen Lupus erythematodes und andere Autoimmunkrankheiten, bei denen Anti- Chromatin-Autoantikörper werden erzeugt 26 , 27 . Hier beschreiben wir eine integrierte Pipeline, die wir für die Konstruktion, Fertigung und Ausführung entwickelt habenRindende Histon-Peptid-Mikroarrays zur Erzeugung von Spezifitätsprofilen für Antikörper, die Histone und ihre PTMs erkennen. Die Pipeline wird von ArrayNinja erleichtert, ein Open-Source, interaktive Software - Anwendung , die wir vor kurzem entwickelt, die die Design- und Analysestufen Microarray - Experimente 28 integriert. ArrayNinja funktioniert am besten in Google Chrome. Kurz gesagt wird ein Roboter-Kontakt-Mikroarray-Drucker verwendet, um eine Bibliothek von Biotin-konjugierten Histon-Peptiden an definierten Positionen auf Streptavidin-beschichteten Glasmikroskop-Objektträgern abzuscheiden. Arrays können dann in einem kompetitiven und parallelen Assayformat verwendet werden, um Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen abzufragen ( Abbildung 1 ). Die Peptidbibliothek besteht aus Hunderten von einzigartigen synthetischen Peptiden, die PTMs (Lysinacetylierung, Lysin / Arginin-Methylierung und Serin / Threonin-Phosphorylierung) allein und in relevanten Kombinationen, die weitgehend von Proteomik-Datensätzen abgeleitet sind, beherbergen. Methoden zur Peptidsynthese und Validierung<html> Sind an anderer Stelle bekannt 23 . Daten, die aus unseren laufenden Histon-PTM-Antikörper-Screening-Bemühungen unter Verwendung dieser Array-Plattform generiert werden, werden auf einer öffentlichen Webressource, der Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) archiviert. Bemerkenswerterweise wurden auch Histon-Peptid-Mikroarrays, die mit Variationen dieses Protokolls hergestellt wurden, ausgiebig verwendet, um die Aktivität der Histon-PTM-Leserdomänen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 zu charakterisieren und in jüngerer Zeit Histon zu profilieren PTM-Schriftsteller und Radiergummi-Aktivitäten 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Karikatur Darstellung der schrittweisen Vorgehensweise zur Antikörper-Screening auf einem Histon-Peptid-Mikroarray. Biotinylierte Histon-Peptide, die definierte posttranslationale Modifikationen (rote und blaue Kreise) beherbergen, werden mit Biotin-Fluorescein auf Streptavidin-beschichtetem Glas co-gedruckt. Positive Wechselwirkungen werden als rote Fluoreszenz visualisiert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) auf Histonproteinen sind weitgehend untersucht für ihre Rollen bei der Regulierung der Chromatinstruktur und der Genexpression. Die Massenproduktion und -verteilung von Antikörpern, die spezifisch für Histon-PTMs sind, hat die Forschung auf diesen Markierungen stark erleichtert. Als Histon-PTM-Antikörper sind Schlüsselreagenzien für viele Chromatin-Biochemie-Anwendungen, eine rigorose Analyse der Antikörperspezifität ist notwendig für eine genaue Dateninterpretation und fortgesetzte Fortschritte auf dem Gebiet. Dieses Protokoll beschreibt eine integrierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern. Die Design- und Analyseaspekte dieses Verfahrens werden durch ArrayNinja, ein Open-Source- und interaktives Softwarepaket, das wir vor kurzem entwickelt haben, um die Anpassung von Microarray-Druckformaten zu optimieren, erleichtert. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell verfügbaren und weit verbreiteten Histon-PTM-Antibiotika zu screenenS und Daten aus diesen Experimenten sind frei verfügbar durch eine Online-und erweiterte Histone Antibody Specificity Database. Jenseits von Histonen kann die hier beschriebene allgemeine Methodik weitgehend auf die Analyse von PTM-spezifischen Antikörpern angewendet werden.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Peptid-Mikroarray-Plattform für die Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität zu entwerfen und herzustellen. Das Array fragt eine Bibliothek von mehr als 300 einzigartigen Peptidmerkmalen (20 - 40 Reste in der Länge) ab, die viele der bekannten Kombinationen von PTMs darstellen, die auf Kern- und Variantenhistonproteinen gefunden wurden 38 . Diese Pipeline war ein Arbeitspferd für das Screening von vielen weit verbreiteten und kommerziell erhältlichen Histon-PTM-Antikörpern, und vollständige Datensätze sind auf der Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) verfügbar. 17 Das Rückgrat unserer Pipeline ist ArrayNinja, eine Open-Source - Software - Anwendung , die wir vor kurzem entwickelt, die die Planung und Analyse Phasen der Microarray - Arbeit 28 integriert. Das ArrayNinja-Analysemodul ermöglicht es Benutzern, in informa zu interagierenMit ihrer rohen Array-Bilddatei. Die gedruckten Merkmalsidentitäten werden automatisch mit dem Bild integriert, und diese Identitäten können durch das Hover des Mauszeigers über einen Punkt aufgedeckt werden. Diese Integration ermöglicht auch eine schnelle Suche nach interessanten Merkmalen nach Namen und Ausschluss von Merkmalen aus der Downstream-Analyse. ArrayNinja bietet auch Optionen für lokale und nichtlokale Hintergrundgeräuschkorrektur sowie ein Korrekturschema, das sich an die Morphologie anpasst. Vollständige Details von ArrayNinja und seine Fähigkeiten können an anderer Stelle gefunden werden 28 . ArrayNinja berechnet Signalintensitäten für jedes Peptidmerkmal und aggregiert diese Intensitäten in Mittelwerte mit Fehler basierend auf Merkmalsidentität. Raw- und normalisierte Signaldurchschnitte werden zurückgegeben, wobei die Normalisierungskonstante durch den hellsten Merkmalsmittelwert bestimmt wird. Die Signalintensitäten für jedes Peptid können verwendet werden, um die relative Affinität zu vergleichen<html> Des Antikörpers unter den Merkmalen des Mikroarrays. Hier zeigen wir repräsentative Datensätze für zwei mit dieser Pipeline profilierte Antikörper, die die Epitop-Erkennungseigenschaften hervorheben, die bei der Interpretation der mit diesen Reagenzien erzielten Ergebnisse berücksichtigt werden sollten ( Abbildung 5 ). Off-Target-Erkennung ist ein Anliegen für alle Antikörper und Gemeinsamkeiten in Epitopen um modifizierbare Histonreste machen dies eine besondere Herausforderung für Histon-PTM-Antikörper. Tatsächlich bindet ein Antikörper, der zur Erkennung von tri-methyliertem Lysin 9 auf Histon H3 (H3K9me3) angehoben wird, bei H3K18, H3K27 und Lysin 20 an Histon H4 (H4K20me3) oder besser als H3K9me3 ( Abbildung 5A ) trifulierte Peptide. Die Sequenz, die H3K9 (ARKS) umgibt, wird mit H3K27 konserviert, und die Kreuzreaktivität von Histon-PTM-Antikörpern und Chromatinreglern, die diese Stellen binden und modifizieren, wurde an anderer Stelle festgestelltSs = &quot;xref&quot;&gt; 15 , 39 , 40 , 41 . Eine andere beobachtete Off-Target-Erkennungseigenschaft, die Methyl-Lysin-Antikörpern gemeinsam ist, ist eine Unfähigkeit, die Methyl-Ordnung zu unterscheiden. Dies wird durch Ergebnisse mit einem H3K4me3-Antikörper veranschaulicht, der mit H3K4me2- und H3K4me1-Peptiden kreuzreagiert ( Abbildung 5B ). Die Unterscheidung zwischen der Methylreihenfolge ist wichtig, da Studien gezeigt haben, dass H3K4me3, H3K4me2 und H3K4me1 unterschiedlich über das Genom verteilt sind und wahrscheinlich auf unterschiedliche Weise funktionieren 42 , 43 . Zum Beispiel befindet sich H3K4me3 an den Transkriptionsstartstellen der aktivsten transkribierten Gene, während aktive Enhancer häufig durch H3K4me1 44 markiert sind. Zusätzlich zur Off-Target-Erkennung, positiv und negativ beeinflussenE durch benachbarte PTMs ist eine allgemein beobachtete Eigenschaft von Histon-Antikörpern. Der in Abbildung 5A dargestellte H3K9me3-Antikörper wird durch Acetylgruppen an benachbarten Lysinresten positiv beeinflusst. Tatsächlich zeigt die jüngste Massenspektrometrieanalyse, dass Acetylgruppen, insbesondere H3K14ac, häufig mit H3K9me3 38 auftreten . Der in 5B gezeigte H3K4me3-Antikörper wird durch die benachbarte Phosphorylierung bei Threonin 6 (H3T6p) negativ beeinflusst. Es ist bekannt, dass H3T6p sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die Erkennung von H3K4me3 durch Leserproteine ​​hat und dies als dynamischer Mechanismus zur Regulierung der Rekrutierung spezifischer Chromatinfaktoren 15 , 45 dienen kann . <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55912/55912fig5.jpg" /> Abbildung 5: Analyse von Antikörpern auf Peptid-Mikroarrays. Analyse von (A) H3K9me3 (Antikörper # 1) und (B) H3K4me3 (Antikörper # 2) Antikörpern auf Peptidmikroarrays. Grüne Linien / Balken zeigen das Peptid an, das nur das beabsichtigte Ziel-PTM beherbergt. Graue Linien / Balken zeigen Peptide an, deren Signalintensität nicht signifikant unterschiedlich ist (p&gt; 0,05) von der grünen Linie / bar, berechnet unter Verwendung einer Einweg-ANOVA, die die mittlere relative Intensität aller Peptide mit dem Zielpeptid vergleicht. Rote und blaue Linien / Balken zeigen das Signal an, das signifikant verringert oder erhöht ist (p &lt;0,05) von der grünen Linie / bar. Orange Linien / Balken zeigen Off-Ziel-Peptide an. Die Daten werden als (links) eine visuelle Darstellung der PTM-Komplexität auf Peptiden angezeigt, die N-terminale Bereiche der H3- und H4-Schwänze überspannen, wobei die Breite jeder Zeile der relativen Intensität entspricht, die für dieses Peptidmerkmal gemessen wird, und (rechte) Balkendiagramme Anzeige der relativen Signalintensitätsmittelwerte ± SEM von 6 EinzelpunktmaßAuf Mikroarrays. Alle in dieser Analyse enthaltenen Peptide sind 20 Aminosäuren in der Länge, die entweder Histon H3 Aminosäuren 1 - 20 oder 15 - 34 entsprechen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55912/55912fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

39.8K Aufrufe.  Van Andel Research Institute.  Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen. 

Serie: Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Forschung

Biochemie

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...