Scipion은 생물학적 시편의 고해상도 재구성을 달성하기 위해 cryo-EM에서 단일 입자 분석을 위한 통합 방식으로 전체 처리 워크플로우를 생성하는 도구를 제공합니다. 이 프레임워크를 사용하면 상호 운용성, 추적성, 재현성 및 보다 정확한 출력을 생성하기 위해 서로 다른 방법으로 전달되는 정보의 조합을 선호하는 여러 이미지 처리 패키지를 사용하여 처리 워크플로우를 만들 수 있습니다. Scipion은 새로운 방법과 패키지를 포함하여 끊임없이 성장하고 있습니다.
또한 극저온 전자 단층 촬영 및 원자 모델링으로 확장되어 이러한 데이터를 처리하는 워크플로우를 만들 수 있습니다. Scipion에서 프로젝트를 만들려면 프로젝트 만들기를 클릭하여 프로젝트를 만듭니다. 현미경 동영상을 가져오려면 가져오기 영화를 선택합니다.
새 창이 나타납니다. 이 창에서, 데이터에 대한 경로를 입력하고 현미경 전압을 300 킬로볼트로 설정하고, 구형 수차는 2밀리미터로, 진폭 대비는 0.1, 배율50, 000으로, 샘플링 속도 모드에서 이미지까지, 픽셀 크기는 1.34 angstroms로 설정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 실행을 클릭합니다.
메서드가 완료되면 요약 탭을 열어 결과 분석을 클릭합니다. 메서드에서 생성된 출력 목록과 함께 새 창이 나타납니다. 영화 정렬을 위한 광학 유동 방법을 실행하려면 xmipp3 광학 정렬 방법을 열고 가져온 영화를 입력 영화로 선택하고 프레임범위를 2에서 13사이로 정렬하도록 설정합니다.
추가 매개 변수에서 이전 영화 정렬을 SUM 프레임 옵션으로 설정하여 기본 값으로 설정된 다른 모든 옵션을 그대로 두고 프로그램을 실행합니다. 결과를 분석하여 얻은 현미경 그래프와 예상 교대의 궤적을 확인합니다. 모든 현미경촬영에 대해, 카르테시안및 극성 좌표 모두에서 영화를 정렬하기 위해 얻은 전력 스펙트럼 밀도, 궤적, 및 얻어진 현미경의 파일 이름을 확인할 수 있다.
표본의 입자가 영화의 단일 프레임에 비해 현미경 그래프에서 훨씬 더 많이 표시됩니다. 파티클 따기의 경우 xmipp3 수동 피킹 방법을 열고 이전에 얻은 현미경 그래프를 입력 현미경으로 선택합니다. 실행을 클릭합니다.
새 대화형 창이 나타납니다. 이 창에서는 픽셀 크기를 150으로 변경합니다. 선택한 현미경이 더 큰 창에 나타납니다.
한 영역 내에서 표시되는 모든 파티클을 선택합니다. 모든 파티클을 수동으로 선택한 경우 학습 활성화를 클릭하여 학습을 시작합니다. 현미경 그래프의 나머지 영역은 자동으로 선택됩니다.
선택한 파티클을 확인합니다. 추가 파티클을 포함하려면 관심 있는 파티클을 클릭합니다. 잘못된 파티클을 제거하려면 시프트를 길게 유지하고 필요에 따라 파티클을 클릭합니다.
모든 파티클을 자동으로 선택하면 다음 네 개의 현미경 그래프를 한 번에 하나씩 선택하여 대표 교육 세트를 만듭니다. 선택한 각 현미경 그래프의 파티클은 자동으로 선택되어 각 현미경 그래프를 확인하여 필요에 따라 입자를 포함하거나 제거합니다. 학습 집합을 획득하면 좌표를 클릭하여 선택한 모든 파티클의 좌표를 저장합니다.
교육 세트를 획득한 후 xmipp3 자동 피킹을 열어 Xmipp 입자 따기 실행에서 이전 수동 피킹을 나타내고 마이크로그래프를 감독과 동일하게 선택하도록 설정합니다. 실행을 클릭하여 약 100, 000 좌표 세트를 생성합니다. 합의 접근법을 적용하려면 스포리 크라이올로 따기를 열고 미리 처리된 현미경 그래프를 선택 모델의 입력 현미경으로 기본값으로 설정합니다.
신뢰도 임계값을 0.3로 설정하고 상자 크기를 150으로 설정한 다음 실행을 클릭합니다. 이 메서드는 또한 약 100, 000 좌표를 생성해야 합니다. 다음으로, xmipp3 딥 컨센서스 피킹을 열고 입력 좌표를 설정하여 스파이어 크라이올로 및 xmipp3 자동 피킹, 미리 학습된 선택 모델 유형, 미리 학습된 모델과 함께 직접 건너뛰기 훈련 및 점수를 예로 클릭한 다음 실행을 클릭합니다.
실행이 끝나면 결과 분석분석을 클릭합니다. 새 창에서 눈 아이콘을 클릭합니다. 두 번째 새 창은 모든 파티클 목록과 함께 열립니다.
열의 Z 점수 값은 낮은 값이 품질이 좋지 함을 나타내기 때문에 각 파티클의 품질에 대한 통찰력을 제공합니다. 가장 높은 Z 점수에서 가장 낮은 Z 점수까지 의 입자를 주문하려면 Xmipp Z 점수 딥 러닝을 클릭하고 0.75보다 높은 Z 점수로 입자를 선택합니다. 그런 다음 좌표를 클릭하여 약 50, 000 좌표로 새 하위 집합을 만듭니다.
로컬에서 해상도를 계산하려면 xmipp3 로컬 MonoRe를 열고 입력 볼륨을 마지막 구체화 단계의 출력으로 설정하려면 절반 볼륨을 예로 사용하고 해상도 범위를 1에서 10 angstroms로 설정합니다. 매개 변수가 설정된 경우 실행 실행을 클릭합니다. 해상도가 계산되면 결과 분석을 클릭하고 해상도 표시 히스토그램을 선택하고 컬러 슬라이스 표시를 선택합니다.
볼륨의 다른 부분의 해상도가 표시됩니다. 구조물의 중앙 부분의 복셀 대부분은 세 개의 협전성 주위에 해상도를 나타내야 하며, 최악의 해상도는 구조물의 외부 영역에서 관찰될 것이다. 3개의 협질의 주위에 또는 아래 피크와 복셀 당 해상도의 히스토그램도 표시됩니다.
선명하게 하는 xmipp3 로컬데블러를 열고 마지막 구체화 단계의 출력을 입력 맵으로 선택하고 해상도 맵을 획득 모노리스 맵으로 설정합니다. 명령이 실행된 후 요약 탭에서 출력으로 생성된 볼륨 집합을 두 번 클릭합니다. 각 반복에서 생성된 볼륨을 확인할 수 있습니다.
또한 UCSF Chimera와 같은 다른 도구로 볼륨을 열어 볼륨의 기능을 3D로 더 잘 관찰하는 것이 좋습니다. 이 그림에서는 나이퀴스트 한계에 매우 가까운 세 개의 협스트롬의 포리에 쉘 상관 관계를 관찰할 수 있습니다. 그림과 같이, 재구성된 3D 볼륨 슬라이스는 높은 수준의 디테일과 잘 정의된 구조를 나타낸다.
로컬 분석 후 대부분의 중앙 복셀은 세 개의 협질 아래 해상도를 달성합니다. 그러나 로컬 해상도 슬라이스의 외부 영역은 낮은 해상도를 보여 주며, 이는 해당 영역 내에서 관찰된 흐림과 일치합니다. 후처리 후 3D 맵 볼륨의 주파수가 높을수록 더 자세한 내용을 공개하고 표현을 개선할 수 있습니다.
달성된 분해능이 충분히 높을 때, 구조의 일부 생화학적 부분도 관찰할 수 있다. 얻어진 구조가 낮은 해상도를 가지며, 더 나은 것으로 진화할 수 없는 경우, 푸리에 쉘 상관관계, 해상도 곡선 및 국소 추정의 히스토그램이 낮은 흐린 부피를 관찰할 수 있다. 따기 후, 2D 분류를 검사하여 입자 품질을 평가할 수 있습니다.
예를 들어 이 분류에서 파티클은 시들하거나 중심이 없거나 결합되어 따기가 잘못되었음을 나타냅니다. 초기 볼륨 추정 중에 다른 검사점이 수행될 수 있습니다. 이 예제에서는 메서드에 대한 잘못된 설정을 사용하여 잘못된 추정이 만들어졌습니다.
충분한 해상도가 있는 3D 맵이 생성되면 다음 단계는 맵에 대한 원자 모델을 제안하는 것입니다. 모델링 플러그인을 사용하여 Scipion 내에서 수행할 수 있습니다. 이 기술은 성공적으로 약물 설계를위한 기초로 자신의 분자 상호 작용 및 생물학적 앙상블 기능의 평가를 위한 생물학적 거대 분자를 재구성하는 데 사용할 수 있습니다.
