저자는 미국 육군 연구 실험실 (ARL) 박사 화목 프로그램, 박사 저스틴 P. Jahnke의 약속을 통해, ARL와 오크 릿지 연관 된 대학 계약을 통해 관리의 지원을 인정 하 고 싶습니다. 자금 남은 센서와 전자 장치 스파이 ARL에 의해 제공 되었다. 저자 또한 감사 Daugherty 실험실 UCSB에서 세균성 디스플레이 라이브러리와 YPet 모나 시 약, 닥터 브린 아담스 지원에 ARL, 그의 초기 작품에 대 한 박사 조슈아 Kogot에서 YPet 모나 시 복제에 대 한 복제에 대 한 정보를 공유 하 고 싶습니다, 엣지 우드 화학 고 표현 하 고 abrax를 정화 하는 데 사용 하는 플라스 미드를 공유 하기 위한 생물학 센터의 Alena 진정 세균 디스플레이 라이브러리 및 rivax 단백질의 biopanning PA 바인딩 펩 티 드, Qin Guo의 격리에 대 한 기술 지원에 대 한 브랜디 Dorsey에 훈련 abrax 바인딩 펩 티 드의 격리에 대 한 예비 실험과 박사 제시카 테 럴이이 원고에 관한 유용한 토론에 대 한 기술 지원에 대 한.

저자 공개할 게 없다

펩 티 드 인식에 대 한 항 체에 대 한 유용한 대안을 제공 하는 특정 조건이 극한 환경에서 안정성 필요할 때 그리고 Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 선호도 시 약의 고립에 성공적인 접근 되었습니다. 이러한 라이브러리의 Biopanning 간소화 되었습니다 여기에, 설명 하는 autoMCS 메서드를 사용 하 여 그리고 상용 autoMCS 플랫폼 훨씬 넓은 청중에 게이 기술을 확장. 전통적인 번갈아 MCS/FACS에 비해 박테리아에 대 한 정렬 방법 라이브러리 표시, 정렬 및 바인딩된 셀을 분리 수 있는 더 비싼 FACS 악기를에서 투자 필요 하지 않습니다 때문에 autoMCS 방법 보다 적게 비싸다 여기에 사용 되는 교류 cytometer 유형의 보다 분석 14수만입니다. AutoMCS에 의해 성공적인 biopanning에 대 한 중요 한 단계는 분리 프로그램 선택, 부정적인 FACS를 사용 하 여 biopanning, 중지 시기를 결정 하는 라이브러리 농축 모니터링 가양성을 줄이기 위해 잠재적 크로스-반응에 대 한 정렬 및 후보자의 수백의 성가신 검열을 피하기 위해 후보 풀의 스마트 분석.
여기에 설명 된 예제 비록 약간 다른 분석 전략의 각 풀에 대 한 펩 티 드 순서에 차이 두 개의 별도 대상, PA 및 abrax, 선택한 세균성 디스플레이 라이브러리의 성공적인 biopanning 설명 biopanning의 4 라운드 후 후보자입니다. PA 순서 분석 펩 티 드 순서 144 식민지에서 한 번 이상 반복에서 분명 트렌드를 보여주는 더 똑 바른 예 이었다. 이 혼자 합의 포함 하는 충분 한 PA 대상에 대 한 합의 순서를 결정 하 고 그 식민지 또는 유사한 시퀀스 streptavidin 부정적인 컨트롤에 바인딩 대 PA에 바인딩의 비율 면에서 최고의 후보자를 했다. 그러나,이 항상 되지 않습니다 경우. Abrax 대상에 대 한 시퀀싱 100 식민지 5 반복 시퀀스 아니라 이러한 시퀀스에서 동향은 향기로운 아미노산 잔류물 및 aspartic 산 또는 아스파라긴을 포함 하는 경향이 다른 불분명. 반복 시퀀스에서 예측된 "합의"만 수 생산 되었고 abrax, 선호도 대 한 검사를 하지만 그 정확한 일치 시퀀스를 포함 하는 아무 부모 시퀀스, 이후 우리 시퀀스 된 식민지의 목록에 반환 관찰 다른 후보가 서로 공통점이 더 많은 동향 했다. 사실, 두 식민지 반복 혼자, (FWAWF 대신 FWDTWF), 트립토판, 페닐알라닌, aspartic 산 성 잔류물의 하지만 다른 간격으로 동일한 추세를 했다에서 "일치"에 유사한 시퀀스 포함. 이러한 펩 티이 드 중 하나는 반복 시퀀스, 하나 아니었다. 유사한 변종 포함 된 세 번째 시퀀스와 함께 이러한 두 시퀀스 상위 5 바인더 abrax에 대 한 선호도 측면에서 테스트 중 이었다. 전반적인 최고 바인더 도끼-A05도 비슷한 추세를 표시 됩니다. Abrax에 대 한 결과 여러 번 시퀀스 분석 및 친 화력과 특이성 분석 사이의 교체는 접근 때로는 선택한 대상에 따라 필요한 것을 보여 줍니다. Abrax 대상에 대 한 결과 또한 매우 비슷한 단백질 (rivax 1,15)를 통해 얻을 수 있는 특이성의 수준을 보여 줍니다.
우리의 연구에 대 한 선정 autoMCS 프로그램 Posselds 및 Posseld, 낮은 주파수, 초기 인구의 5% 미만으로 레이블이 대상 셀의 긍정적인 선택에 대 한 둘 다 있었다. 두 경우 모두, 세포는 두 개의 자석 열 통과. 그러나 Posselds 프로그램의 경우, 셀 통과 더 느리게 증가 노출 시간 41을 첫 번째 열. 상업적인 autoMCS 장치의 제조 업체에 의해 주어진 프로그램 설명 뿐만 아니라 (참조 자료 테이블) 41이 프로그램은 여러 잠재적인 프로그램의 초기 비교 후 선정 됐다. 각 프로그램의 능력 꺼내 부정적인 제어 셀, 균질 문화에서 가양성 방지 하 고 성공적으로 부정적인 통제 세포는 감소와 함께 아군을 포함 하는 혼합된 문화에서 관심의 대상으로 알려진된 바인더를 분리 알려진된 바인더의 비율 비교 되었다. 여기에 설명 된 응용 프로그램에서 크게 벗어난, 비슷한 비교 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로그램 선택에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 PA는 biopanning의 모든 4 라운드에 대 한 이러한 프로그램 중 하나를 사용 하 여 절연과 비슷한 펩 티 드의 지도 보여에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약의 분리 (Posseld 및 Posselds)이 두 프로그램을 비교 하는 결과 게시 선호도 및 PA에 대 한 특이성 WXCFTC 합의의 결정. 주요 차이점은 그 Posseld, 그것의 빠른 흐름 속도, 보다 신속 하 게 정렬 및 바인딩 대상에 대 한 선호도 높았다 따라서 biopanning, 두 라운드 동안 biopanning 의 4 라운드 후 더 많은 독특한 시퀀스를 led Posselds를 사용 하 여 14.이 학습 전략 약간 변경 되었습니다 때 모두 혜택을 통합 abrax 바인딩 펩 티 드에 대 한 biopanning: 1 라운드 어디 다양성은 높은, 하지만 다음이 중요 한 단계 더 많은 노출 시간을 허용 하도록 사용 되었다 Posselds는 프로그램 Posseld 라운드 2-4 1,15중 가장 높은 선호도 바인더의 빠른 격리에 대 한 전환 했다. 이 때문에 특히 nMFI 및 백분율 바인딩 둘다 abrax 라운드 4 프로그램 중 하나를 정렬 하는 PA에 비해 4 라운드를 정렬에 대 한 더 높은 abrax, 이상적 될 것으로 보인다 (그림 2 및 그림 3 과 Sarkes 그 외 여러분 2015 14), 하지만 같은 목표와 함께 다른에 대 한 전략을 사용 하 여 직접 비교는 더 결정적인 비교에 필요한 것입니다. 어떤 프로그램은 특정 응용 프로그램에 대 한 최고의 개별 대상, 사용, 정렬 라이브러리 및 여기에 설명 된 조건에 어떤 변화를 달성 하는 펩 티 드 식의 수준에 달려 있습니다.
설명 하지 여기 abiotic 재료로 biopanning에서 잠재적인 결과입니다 하지만 우리는 또한 대량 알루미늄 2에 대 한 biopanning에 대 한 동일한 세균 디스플레이 라이브러리를 사용. 이 연구는 autoMCS를 사용 하 여 수행 되지 않은 하지만 비슷한 연구 자료에서 사용할 수 또는 수에 코팅 또는에, 마그네틱 비드 활용 된 경우 autoMCS를 사용 하 여 달성 될 수 있었다. 대량 알루미늄 연구에서 개별 아미노산 분석 및 이차 구조 모델링 아무 합의 순서 결정된 2이후 어떤 고립 된 펩 티 드의 바인딩 선호도 운전에 유용 했다. 생물 학적 목표와도이 개별 잔류물 주파수 분석 탭을 포함 하는 스프레드시트 "eCPX_Sequencing" 매크로에서 생성 하는 이유는 일부 대상에 대 한 바인딩 선호도 운전 하는 무슨을 이해 하는 데 필요한 수 있습니다. 그러나 없는 반복 시퀀스는 합의의 부족 뿐만 아니라 볼 수 있습니다 잔류물 주파수 패턴을 표시 하는 경우에,, 다른 유형의 분석 해야 합니다. 또한, 추가 라운드를 정렬 원하는 대상에 충분 한 선호도 다운 선택에 대 한 후보자의 훨씬 더 큰 수를 차단 하지 않도록 필요할 수 있습니다.
다음 세대 시퀀싱의 증가 가용성, 선호도 테스트 하기 전에 가장 유망한 후보자를 결정 하 고 biopanning의 각 라운드 후 농축의 정도 결정 하는 더 철저 한 연구를 수행 수 있습니다. 그러나, 쉽게 수십 또는 수백 개의 식민지의 일상적인 식민지 시퀀싱을 충분히 높은 주파수의 없는 경우 복제를 통해 다시 만들어야 시퀀스 바인딩 분석 단계로 이동 할 수 있습니다. 이 기술 발전, 저렴 하 고 더 일상적인 되 고 특히 식민지 격리에 대 한 옵션, 그것은 것입니다 가능성이 있을 biopanning 데이터를 분석 하는 가장 좋은 방법은. 그것은, 진화 방법 개별 시퀀스 및 전체 라이브러리의 이어질 수 있습니다. 또한, 정렬 라이브러리에서 박테리아 빠른 성장 속도와 게놈 단백질에 대 한 디스플레이 비 펩 티 드 식 없이 자료를 바인딩할 수 overexpress 박테리아 세포 쪽으로 정렬 바이어스 수 시간이 지남에 변경할 수 있습니다. 인스턴스입니다. 그 이유로, 유망한 후보자 등장, 일단 그것은 플라스 미드 DNA를 분리, 신선한 대장균, retransforming FACS 통해 펩 티 드 바인딩을 확인 합니다. 셀 무료 형태로 펩 티 드를 사용 하 여 계획 하는 경우 선호도 무료 펩 티 드에 대 한 평가 또한 한다. 예를 들어 대상 셉에 대 한 세균 디스플레이 통해 발견 된 펩 티 드 선호도 시 약 종합적 제작-셀 및 효소 연결 된 immunosorbant 분석 결과 (ELISA), 및 (FACS)를 통해 셀에 셀 오프 같은 더 전통적인 방법으로 분석 된 (ELISA)을 통해 선호도 두 방법 7에 의해 결정 하는 Kds를 사용 하 여 비교 했다.
Biotin streptavidin 상호 작용의 강도 단백질 대상과 바운드 펩 티 드의 캡처에 대 한 이상적인 전략은, 비록 다른 캡처 전략에 대 한이 절차를 수정할 수 있습니다. 에폭시 및 carboxylic 산 구슬 같은 자석 구슬, 단백질의 직접 결합 성공 했다 하 고 바인딩 단계를 제거 합니다. 그러나, 직접 첨부 파일 첨부 파일 전략에 따라 특정 또는 일반적인 방식으로, 잠재적인 바인딩 사이트를 방해 수 있습니다. 추가 streptavidin 비즈를 사용 하 여 장점은 안정적인 단백질 덜 대상 갓 30 분에 biotinylated 일 수 있다 또는 저장 동안 스스로 구슬 cross-linking에 대 한 단백질으로 더 이상 화를 요구 하는 경향이 있으며, 필요한 경우, 냉동 일반적으로 2-8 ° c.에 저장 Biotinylated 단백질의 제안된 시작 농도 대상 여기, 600 nM, 여러 대상에 대 한 성공 했다 하지만이 농도 감소 하는 경우 증가 선호도와 펩 티 드 캡처 시 약을 수 있습니다. 또한,이 메서드를 확장 하 고 다른 세균성 디스플레이 라이브러리와 다른 유기 체에 대 한 수정 될 수 있습니다. 예를 들어 사용할 anaerobes, 산소의 부재에서 또는 독특한 특성을 가진 펩 티 드를 분리 하는 extremophiles와 함께 사용 하기 위해 다른 환경에서 이러한 단계를 수행할 수 있습니다. 펩 티 드 또는 합의 결정에 대 한 관심의 특정 대상 수 있습니다 잠재적으로 사용 셀에 셀에서 생활 소재, 또는 합성으로 생산. 종합적으로 생산된 펩 티 드를 더 성숙 하 더 높은 선호도 및 센서에서 사용 하기 위해 또는 항 체 바인딩을 사용할 수 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 더 강력한 단백질 촉매 캡처 (PCC) 에이전트의 개발에 대 한 수 또는 인식 38,55. 분자 모델링 그림 5C 1에 나열 된 abrax 바인딩 펩 티 드 및 합의 대 한 최근 수행 되었다 목표와 펩 티 드의 위치 바인딩 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 전반적으로, 펩 티 드 선호도 시 약에 대 한 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 인식에 대 한 항 체의 생산, 단백질 목표의 탐지 및이 반자동된 biopanning, 간단, 신속 하 고 강력한 대안 접근 까지 도달 하는 응용 프로그램을 신뢰할 수 있는 결과 생산 하고있다.

Biopanning은 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술, 박테리아와 펩 티 드 선호도 시 약 1,2,3,,45에 대 한 편리한 소스 라이브러리 표시 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24. 마찬가지로 페이지 표시 25,26 효 모 표시 27,28는 펩 티 드 셀 표면에 노출 되는 biotic 및 abiotic 목표, 이러한 상호 작용을 바인딩할 수 있습니다. 펩 티 드 등뼈와 아미노산 사이드 체인 29의 독특한 특성에 의해 구동. 파지 디스플레이, 달리 박테리아 스스로 자기 복제 되며 바인딩된 페이지의 차입 및 세포의 감염 없이 디스플레이에 필요한 모든 유전 물질을 포함. 효 모 디스플레이, 달리 세균 디스플레이 급속 한 (약 20 분 30) 대장균의 시간을 두 배로 때문에 빠릅니다. 결과 펩 티 드 선호도 시 약을 생산 수 있습니다 감지 플랫폼 16,,1726 의 다양 한에서 사용 하기 위한 셀 오프 있고 사용을 위한 잠재력으로 생활 재료 표시에 셀 2 , 31 , 32. 특정 대상의 인식에 대 한 단일 클론 항 체에 비해 펩 티 드 훨씬 작고 더 유연 하 고, 그리고 펩 티 드 디스플레이 라이브러리 시스테인 33 등 특정 아미노산을 피하려고 DNA 수준에서 쉽게 조작할 수 있습니다 . 펩 티 드 치료제 34,,3536 및 항 체 발견, 재현할 수 합성 (오프-셀의 그들의 용이성으로 인해 활용 될 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 악용 하는 점점 더 )의 생산 그리고 우수한 정비 기능 시 약을 제공 하는 높은 온도 또는 냉각 37,38없이 장기 저장에 노출 후에 극한 환경에서 성능. 극한 환경에서 작동 해야 하는 국방부, 예를 들어, 특정 관심의 시 약의 저장을 위해 콜드 체인을 극복 하는 능력이입니다. 열 안정성은 그러므로 선호도 시 약이이 원고에 예제로 주어진 선택한 대상 인식에 대 한 바람직한 기능.
최근, 훨씬 더 간단 하 고 반자동된 마그네틱 활성화 셀 맥 (MCS) 방법 9,,1439정렬 사용 하 여 신뢰할 수 있는 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 되고있다. 이러한 방법 자기 활성화 셀 (autoMACS 또는 autoMCS) 악기 분류 자동 정렬 다른 점으로, 상업적으로 사용할 수를 포함 하 여 플랫폼 여러 유사한를 사용 하 여 생물 학적 대상에 대 한 입증 되어 있다 (표 참조 재료) 1,,1415 와는 일회용 카트리지 7,9 또는 칩 39, 귀중 한 사양에 대 한 샘플을 포함 하는 보다 전문적인된 장치 사용 유기 체 또는 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 또는 더 높은7독 소. 이러한 반 자동화 방법 경우는 자료 자석 또는 코팅 자성 구슬에 고 (와 같은 혐 기성 박테리아) 다른 유기 체와 함께 사용할 경우 능력 abiotic 재료에 바인딩할 수 펩 티 드에 대 한 정렬 확장 될 수 있는 정렬 그리고 성장 조건이 변경 될 수 있습니다. 세균성 디스플레이 라이브러리 정렬, 뿐만 아니라 여기 사용 상업 autoMCS 악기도 사용 하 고 일부 효 모, 더 절연 뒤의 화면에 표시 된 인간 단일 체인 항 체 파편의 발견의 초기 단계에 대 한 사용 하는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 40. 반 자동화에 주요 이점은 정렬 시간 및 노력, 그리고 더 강력 하 고 재현할 수 제거 자석 구슬에서 언바운드 셀의 세척 단계, 감소 가양성을 선도, 더 적은 필요한 정렬 라운드, 갈수록 감소 복잡 한 다운 스트림 분석 9,14. 상업적인 autoMCS 악기의 경우는 여러 사전 로드 된 프로그램을 다른 응용 프로그램, 음수 전 (고갈), 정렬 등 순수성을 우선 순위, 최종 샘플 볼륨을 최소화 하 고 증가 적합 있을 수 있습니다 또는 드문 셀 41의 격리에 대 한 감도 감소.
이 작품의 초점은 상용 autoMCS 악기를 사용 하 여 세균성 디스플레이 라이브러리 biopanning에 대 한 방법론을 설명 하 고 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명 다른 응용 프로그램에 대 한 확장을 용이 하 게 하는 순서입니다. 여기에 사용 하는 디스플레이 라이브러리 (재료의 표 참조) 12,13 포함 약 109-1011 독특한 15-메 르 펩 티 드 세균 외부 막 단백질 OmpX의 수정된 된 버전을 통해 전시에 종합적으로 생산 하는 경우 솔루션에서 무료 펩 티 드의 대표 될 것으로 예상 된다 세포 표면에 무제한 자연. 이 단백질 비 계에는 C-YPet 모나에 바인딩을 통해 식 모니터링에 대 한 긍정적인 제어 P2X 펩 티 드를 또한 포함 되어 있습니다. 그러나, 적당 한 다양성 및 원하는 특정 응용 프로그램에 필요한 다른 특성 구입 또는 새로운 라이브러리를 함께 작동 합니다 마찬가지로 biopanning 절차, 비록 몇 가지 사소한 변경 내용이 필요할 수 있습니다. 이 biopanning 프로토콜의 회로도 그림 1에서 그림입니다. 또한, 프로토콜에 적응 시킬 수 있는 다른 자동화 된 자기 정렬 플랫폼 및 다른 정렬 전략. 벤치탑 자석으로 수동 자기 정렬 성공적으로 입증 되었습니다, 더 복잡 하 고 시간이 걸리는 다운스트림 분석으로 인해 필요한 증가 가양성 14, 이기는 하지만 고 그럼에도 불구 하 고 다른 옵션을 제공 합니다 autoMCS 단계 없는 자동화 된 마그네틱 셀 장치를 정렬 하는 경우 이용하실 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 biotic 및 abiotic 목표의 인식에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술입니다. 펩 티 드 선호도 시 약 등 감지 치료제, 항 체와 비슷한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 하지만 더 강력 하 고 더 극단적인 환경에서 수행할 수 있습니다. 관심의 대상 단백질에 펩 티 드 캡처 에이전트의 특정 농축 바인딩 개선 단계를 세척 하 고 따라서 거짓 긍정적인 바인더의 발생을 감소 반자동된 정렬 방법을 사용 하 여 향상 된입니다. 반자동된 정렬 방법은 상용 자동된 활성화 자기 셀 임의의 15-메 르 펩 티 드를 표현 하는 라이브러리를 정렬 무제한 세균성 디스플레이 장치를 정렬 여기 사용에 대 한 설명 이다. 약간의 수정이 메서드는 다른 연장 자동 장치, 다른 정렬 라이브러리 및 다른 유기 체. 이 작품의 주요 목표는 포괄적인 방법론을 제공 하 여 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명입니다. 이 기술을 형광 활성화 된 세포 (FACS), 정렬를 사용 하 여 정렬 하는 동안 및 개별 후보자, 비교에 친 화력과 특이성을 평가 하는 셀에 바인딩 분석 등 펩 티 드의 분석 시퀀스 동향을 파악 하 고 이해 하 고 잠재적으로 선호도 관심의 대상에 대 한 특이성을 개선 합의 시퀀스.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

semi-automated-biopanning-bacterial-display-libraries-for-peptide

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K 조회수.  US Army Research Laboratory. Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins with high specificity but low affinity. Through phage display, ubiquitin variants (UbVs) can be engineered such that they exhibit improved affinity over wildtype ubiquitin and maintain binding specificity to target proteins. Phage display utilizes a phagemid library, whereby the pIII coat protein of a filamentous M13 bacteriophage (chosen because it is displayed externally on the phage surface) is fused with UbVs. Specific residues of human wildtype ubiquitin are soft and randomized (i.e., there is a bias towards to native wildtype sequence) to generate UbVs so that deleterious changes in protein conformation are avoided while introducing the diversity necessary for promoting novel interactions with the target protein. During the phage display process, these UbVs are expressed and displayed on phage coat proteins and panned against a protein of interest. UbVs that exhibit favorable binding interactions with the target protein are retained, whereas poor binders are washed away and removed from the library pool. The retained UbVs, which are attached to the phage particle containing the UbV's corresponding phagemid, are eluted, amplified, and concentrated so that they can be panned against the same target protein in another round of phage display. Typically, up to five rounds of phage display are performed, during which a strong selection pressure is imposed against UbVs that bind weakly and/or promiscuously so that those with higher affinities are concentrated and enriched. Ultimately, UbVs that demonstrate higher specificity and/or affinity for the target protein than their wildtype counterparts are isolated and can be characterized through further experiments.

Ubiquitination is a critical protein post-translational modification, dysregulation of which has been implicated in numerous human diseases. This protocol details how phage display can be utilized to isolate novel ubiquitin variants that can bind and modulate the activity of E3 ligases that control the specificity, efficiency, and patterns of ubiquitination.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...