NAPPA는 단백질 활성 및 비편견 높은 처리량 방식으로 기능에 대한 연구에 사용할 수있는 강력한 단백질 마이크로 어레이 플랫폼입니다. NAPPA에 전시된 단백질은 자연적인 접이식 및 활동의 가능성을 향상시키기 위하여 인간 유래 리보솜및 보호자를 사용하여 인간 적인 발현 시스템에서 생성됩니다. 키나아제 억제제의 선별을 위한 NAPPA 어레이의 사용은 신약 및 임상적으로 관련된 키나아제 돌연변이의 시험을 위한 새로운 플랫폼을 제공합니다.
NAPPA 방법론에 의해 생성된 단백질 마이크로어레이는 바이오마커 발견, 단백질 단백질 상호 작용, 기판 식별 및 약물 스크리닝을 포함한 많은 뚜렷한 응용 분야에 사용될 수 있다. 길을 따라 품질 관리 단계를 수행합니다. DNA 제제의 품질, DNA 마이크로어레이 및 단백질 마이크로어레이를 테스트합니다.
어떤 단계에서 품질이 좋지 않다면 다시 시작하십시오. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 리사 밀러 (Lisa Miller)가 될 것입니다. 집에서 높은 처리량 미니 준비에 대한 세균 성장을 준비하기 위해, 먼저 96 잘 형식으로 오거 플레이트에 박테리아를 접종하고, 16 시간 동안 성장하자.
다음 날, 깊은 우물 판의 각 우물을 1.5 밀리리터의 훌륭한 국물 배지로 채우고 항체 암피실린으로 보충합니다. 항체는 플라스미드의 선택 마커에 의존한다. 그런 다음 80 %에탄올과 화염으로 96 핀 장치를 살균하십시오.
멸균 96핀 장치를 사용하여 하룻밤 동안 배양된 한천판에서 식민지를 선택하고 깊은 우물판의 우물에 잠기면 문화를 접종하십시오. 가스 투과성 씰로 블록을 덮고 셰이커에 22~24시간 동안 섭씨 37도, 300~800rpm으로 커큐베이트합니다. 그 후, 펠릿 문화와 원고에 따라 문화를 다시 중단.
리세 박테리아는 각각 2개의 용액2를 첨가하고, 알루미늄 씰로 플레이트를 밀봉하고, 5회 반전합니다. 정확히 5 분 동안 세포를 배양. 용액을 중화하려면 200 마이크로리터의 용액 3개를 추가하고 알루미늄 씰로 플레이트를 밀봉하고 5번 반전합니다.
그런 다음 3800 G에서 플레이트를 회전하여 섭씨 4도, 30분 동안 용액 상판을 치웁울 수 있습니다. 먼저 애니온 교환 수지 플레이트를 준비하려면 먼저, 애니온 교환 슬러리를 섞고 슬러리를 유리 통에 붓습니다. 필터 플레이트를 깊은 우물 판 위에 쌓아 폐기물 수거 용기역할을 합니다.
그런 다음, 와이드 보드 P1000 팁을 사용하여 슬러리를 혼합하고 슬러리의 450 마이크로리터를 필터 플레이트의 각 웰로 옮킨다. 원심 분리기와 흐름을 폐기합니다. 이제, 수지 플레이트와 깊은 우물 블록의 스택에 lysate 슈퍼 네티츠를 전송합니다.
누적 된 플레이트를 30 배 G에서 30 배의 속도로 회전시키고 흐름을 폐기하십시오. 컬럼을 세척하려면 400 마이크로리터의 용액 N3 워시 버퍼를 각 웰에 추가합니다. 수지 판을 진공 매니폴드로 옮기면 세척 버퍼를 제거합니다.
세척 단계를 세 번 반복한 다음 DNA를 30 G.To번의 짧은 5분 스핀으로 남은 세탁기 버퍼를 제거하고 수지 플레이트를 깨끗한 800 마이크로리터 수집 플레이트에 놓습니다. 각 웰에 300 마이크로리터의 용액 N5를 추가하고 10 분 동안 실온에 앉을 수 있습니다. 그런 다음, 1 분 동안 233 회 G로 느린 램프로 20 배 G에서 5 분 동안 쌓아 놓인 플레이트를 회전시킵니다.
사용하기 전에 음수 섭씨 20도에 접시를 보관하십시오. 먼저, 슬라이드를 랙에 놓고 아세톤에 2%아미노시란 시약의 코팅 용액을 포함하는 유리 저장소에 슬라이드를 담급니다. 슬라이드를 15분 동안 흔들어 보시십시오.
그런 다음 슬라이드를 아세톤으로 헹구고 물 속의 마지막 헹구는 것입니다. 다음으로, 압력 공기를 사용하여 슬라이드를 건조. 모든 물방울이 제거 될 때까지 약 3 분 동안 모든 각도에서 그들을 불고.
단단히 밀봉 된 상자 안에 금속 랙에 실온에서 코팅 된 슬라이드를 저장합니다. 지금, 원고에 설명된 대로 DNA를 침전하기 위하여 진행합니다. 그런 다음, 초순수 의 20 마이크로 리터에서 DNA 펠릿을 다시 중단하고 2 시간 동안 1000 rpm에서 흔들어.
어레이 샘플을 준비하려면 각 DNA 샘플에 항체, 크로스링커 및 폴리리신을 포함하는 갓 준비된 인쇄 믹스 10마이크로리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 밀봉하고 1000 rpm에서 90 분 동안 실온에서 흔들어. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오.
인쇄 당일, 잠시 소용돌이와 접시를 회전. 각 샘플의 28마이크로리터를 384웰 플레이트로 옮기다. 아미노탈 코팅 슬라이드와 384 웰 플레이트를 어레이 데크에 놓고 마이크로 어레이 인쇄 프로그램을 시작합니다.
인쇄가 완료되면 마이크로어레이에 레이블을 지정합니다. 마이크로 어레이는 추가 사용까지 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. DNA 수준을 측정하려면 슬라이드를 파이펫 상자에 배치하고 50 밀리리터의 블로킹 버퍼로 차단합니다.
실온에서 흔들리는 셰이커에 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 버리고 블로킹 버퍼 20 밀리리터와 형광 DNA 교제 염료 33 마이크로리터를 추가합니다. 교반으로 15분 동안 배양하세요.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 매우 순수한 물로 빠르게 헹구고 압력공기로 건조시다. 마이크로 어레이를 스캔할 준비가 되었습니다. 마이크로 어레이를 표현하려면 슬라이드를 앞에서 보여 준 대로 차단한 다음 초순수물로 헹구고 여과 된 압축 공기로 건조시다.
각 슬라이드에 밀봉 개스킷을 부착합니다. 130 밀리리터의 시험관 내 전사및 번역 믹스를 슬라이드에 넣고 밀봉 개스킷을 부드럽게 마사지하여 체외 전사 및 번역 믹스가 펼쳐지고 거품없이 배열의 전체 영역을 덮습니다. 두 포트에 작은 둥근 포트 씰을 적용합니다.
단백질 발현을 위해 섭씨 30도에서 90분 동안 배양하고, 쿼리 단백질의 고정을 위해 섭씨 15도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 개스킷을 제거하고, 우유로 15 밀리리터 TBST에서 각각 5분 동안 슬라이드를 세 번 세척하고, 1시간 동안 동일한 용액을 차단합니다. 어레이에서 단백질의 검출을 위해, 우유로 TBST를 제거하고, 그리드 플레이트에 슬라이드를 배치하고, 1 차 항체, 마우스 안티 플래그의 600 마이크로 리터를 적용, 마우스 안티 플래그, 희석 1 ~ 200, 및 5 %의 우유로 보충 1x TBST.
실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 1x TBST 50밀리리터와 흔들 셰이커에 5%우유로 3회 3회 세척합니다. 이차 항체에 대한 절차를 반복한다.
1시간 의 배양이 끝나면 슬라이드를 흔들 셰이커에 1x TBST로 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 매우 순수한 물로 슬라이드를 빠르게 헹구고 압력 공기를 사용하여 건조시합니다. 슬라이드를 스캔할 준비가 되었습니다.
인산염 및 DNase 처리를 수행하기 위해 원고에 설명된 대로 TBST로 표현된 슬라이드를 3%BSA로 세척하고 차단한다. 그런 다음 슬라이드를 그리드 플레이트에 놓고 200 마이크로리터의 포스파타제 DNase 용액을 적용합니다. 증발을 피하기 위해 마이크로 어레이 커버 슬립을 위에 놓습니다.
오븐에서 섭씨 30도에서 1시간 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 1x TBST와 0.2 어금니 나트륨 염화나트륨을 흔들 쉐이커에 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 약물 치료 및 키나아제 반응을 수행하기 위해 슬라이드를 그리드 플레이트에 놓고 200 마이크로리터의 약물 키나아제 용액을 적용합니다.
증발을 피하기 위해 커버 슬립을 위에 놓습니다. 오븐에서 섭씨 30도에서 1시간 동안 배양합니다. 재현 가능한 데이터의 핵심은 슬라이드 에서 일관된 인큐베이션 시간입니다.
이것은 키나아제 반응 도중 특히 중요합니다. 각 슬라이드를 처리하는 데 필요한 시간을 고려해야 합니다. 그 후, 1x TBST와 0.2 어금니 나트륨 염화 나트륨을 흔들 쉐이커에 각각 5 분 동안 세 번 세척하십시오.
TBST에서 1-100까지 희석된 1차 항체 인포티로신 항체로 단백질 검출을 반복하여 3%의 소 세럼 알부민으로 보충한다. 1x TBST 및 3%소 세럼 알부민을 사용하여 1차 항체로 배양 후 세척을 하고, 이차 항체를 사용한 배양 후 세척을 위한 TBST를 사용하십시오. 이전과 같이 씻고 건조하십시오.
이미지 수집을 위해 마이크로어레이를 슬라이드 홀더 잡지에 로드합니다. 잡지를 마이크로어레이 스캐너에 로드합니다. 최적화된 설정으로 모든 마이크로어레이를 스캔하고 실험 전반에 걸쳐 이미지를 비교할 때 자동 게인을 해제해야 합니다.
이미지를 정량화 소프트웨어로 전송하고, 그리드를 스팟과 정렬하고, 마이크로어레이의 각 피쳐의 신호 강도를 정량화합니다. 통계 분석을 진행합니다. 이 연구에서, 마이크로어레이는 보완 DNA를 함유한 반점의 대다수가 성공적으로 단백질의 검출 가능한 수준을 표시했다는 것을 보여주었습니다.
NAPPA 키나아제 마이크로어레이는 0.88보다 높은 뚜렷한 인쇄 배치 중 단백질 디스플레이 수준의 상관관계와 함께 슬라이드 중 좋은 재현성을 보였다. NAPPA 키나아제 어레이에서 키나아제 활성의 대표적인 결과는 발현 후 단백질 인산화의 높은 수준을 나타냈다. 인산화 농도가 인산염 치료 직후에 측정된 마이크로어레이와 60분간의 자가포식 반응 후, 어레이에 활성 단백질 키나아제의 존재를 시사한다.
NAPPA 키나아제 어레이에서 imatinib는 ABL1 및 BCR-ABL1 활동이 현저한 감소를 보였지만 다른 키나아제는 대부분 영향을 받지 않았습니다. 키나제 활성은 탈포량 배열에 대해 정규화되고 양성 대조군 마이크로어레이의 백분율로 나타내며 ABL1 및 BCR-ABL1을 향한 이마티닙의 선택적 억제를 나타냈다. ibrutinib 스크리닝을 위해 얻은 전형적인 결과는 ABL1비관련 키나아제의 키나아제 활성이 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
BTK 정식 목표 및 ERBB4 잠재적인 새로운 대상은 ibrutinib의 존재에서 활동을 감소것으로 나타났습니다. 데이터는 ERBB4가 복용량 특정 방식으로 ibrutinib에 의해 억제될 수 있다는 것을 건의합니다. 단백질 마이크로어레이 스크리닝의 성공은 마이크로어레이 자체의 품질에 크게 좌우됩니다.
적절한 데이터 분석을 허용하려면 몇 가지 양수 및 음수 제어 기능을 사용해야 합니다. NAPPA 키나제 분석은 스크리닝 플랫폼이며, 따라서 얻어진 데이터는 체외 키나제 분석서 또는 세포 기반 분석서를 포함할 수 있는 후속 분석에서 검증되어야 한다. 우리의 프로토콜은 cDNA로 시작하기 때문에, 어떤 키나아제 돌연변이 또는 변이는 마이크로 어레이에 쉽게 통합되고 높은 처리량에서 공부할 수 있습니다.
애니온 교환 수지 슬러리 및 플레이트를 제조하는 동안, 수지 입자의 흡입가능성을 방지하기 위해 마스크를 사용하는 것이 좋습니다.
