이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+isolation+of+liver+progenitor+cells+by+aldehyde+dehydrogenase+activity+in+naive+mice.">Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice.</a> Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).</li><li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+liver+progenitor+cells:+a+practical+point+of+view.">The quest for liver progenitor cells: a practical point of view.</a> J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+for+the+murine+oval+cell+response.">Surface markers for the murine oval cell response.</a> Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).</li><li>Gouw, A. 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T., Nagy, L. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+antigen-1+is+necessary+for+cell-cycle+withdrawal+and+myoblast+differentiation+in+C2C12+cells.">Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).</li><li>Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+immortalisation+of+hepatic+oval+cells+from+adult+mice+fed+a+choline-deficient,+ethionine-supplemented+diet.">Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).</li><li>Rountree, C. 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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다. 간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상 12시 염증 관련 유전자들의 고유 한 집합을 표현할 수 CD133 및 gp38의 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 간 선조 부분 집합의 재평가. 여기에 기재된 방법은 희귀 세포 계측법 분석 직접 유동 각종 간 손상 모델에서의 직접적인 비교를 허용한다. 각종 부상 여러 전구 (S)의 활성화를 트리거로 이는 특히 관련ductular 반응 3, 4, 11, 12에서 관찰되는 세포 이질성 반사 형일 수 ubsets. 특히, 쥐 간 조직 (0.2 g)의 작은 부분은 상술 한 방법을 사용하는 전구 세포의 유세포 분석을위한 충분한 세포를 분리하기에 충분하다. 계측법 서브 세트의 고순도 집단을 제공 정렬 흐름은 고유 한 유전자 발현 프로파일을 조사 할 필요가있다. 이전보고 한 바와 유동 세포 계측법 계 전구 세포 분리 (15, 16). 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 세포의 높은 순도와 생존을 보장하는 최적의 방법을 제공한다. 특히, 전술 한 시험 관내 배양 및 확장 기법 좋게 여기 15 제시된 프로토콜에 결합 될 수있다 <s16&gt;까지. 종류로 유동 세포 계측법 많은 종류의 다양한 기관에서 사용할 수 있으며, 그들의 특정한 측정 장치는 다소 차이가있을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 분류에 대한 일반 원칙은 설명 프로토콜에 제시되어있다. 일반적으로, 낮은 압력과 더 큰 노즐 크기는 시스템 유형 및 사양 독립적 절대적으로 필요하다. 또한, 적절한 정렬 매체의 이용 가능성은 크게, 특히 유전자 발현 연구를위한 중요한 요소이다 정렬 세포의 RNA의 질을 높일 수있다. 선조 세포의 선별은, 그러나, 큰 세포 생존율을 감소시키고, 정렬 후 세포의 수율 (4-5 건강 간 풀링 할 필요 7-10,000 이벤트 / 모집단의 고순도의 정렬을위한) 비교적 낮다. 이 분석 체외에서 추가에 대한 제한 요인이 될 수 있습니다. 우리에 대한 자기 마이크로 비드 기반 격리을 제안시험 관내 분석법으로 인해 더 높은 수율과 세포 생존 및 유동 이상의 지정된 서브 세트 분석 아이솔레이션이 필요할 때, 특히 유전자 발현 분석을 위해 선별 계측법. 세포의 생존율은 크게 분류 유세포 후 감소한다는 사실에 기초하여, 선조 세포의 자동화 된 자성 마이크로 비드 기반 격리 개발되고 여기에 제공되었다. 이 고순도 (복수 간 결합)을 가진 전구 세포의 큰 수의 격리를 허용한다. 또한, 세포의 생존율은 분리 공정에 필요한 시간이 크게 감소되기 때문에, 유지된다. 선조 세포의 낮은 숫자 관내 1, 2, 15, 16로 확장 될 수 있지만, 이러한 시험 관내 조작 줄기 / progen의 세포 기능을 변경할 수있는 방법을 고려하는 것이 권장로 모니터 셀들은 다른 중간 엽 및 간질 세포 집단 (17) (18)에 대해 설명했다. 제시된 자기 마이크로 비드 기반 격리의 주요 제한은 CD133 +와 gp38 + 세포 인구 이종 세포를 나타내는 것입니다. 추가 표면 마커는 작은 세포 집단을 식별하는 데 필요한 수 있습니다. 간 줄기 세포 및 전구 세포가 서로 어떻게 관련되는지에 대한 이해는 롤라 리드 등 1, 8, 19 우수 연구에도 불구하고, 지금까지 전체에서이다. 따라서, 이러한 현재 제안 된 것과 같은 높은 수율과 생존에 생성 기법의 신중한 검토 전구 서브 세트의 분석 및 그들의 상호 관계에 대한 이해를 도울 수 연장. 전반적으로, 우리가 설명했다 t그는 고립과 최근 (12)를 구별하고 간 전구 부분 집합의 분석을 자세히 설명합니다. 또한, 신규 한 효소 조합을 이용하여, 희귀 선조가 직접 유동 세포 계측법 측정에 의해 분석 될 수있다. 또한, 프로토콜은 세포 분류 또는 자동화 된 마이크로 비드 기반 기술을 사용하여, 고순도 전구 세포를 농축하는 방법을 설명한다. 문제 해결: 세포 파편 비율 죽어가는 세포는 높다 소화 (단계 2) 동안 간 샘플 피펫이 너무 열악한 경우, 단일 세포 현탁액의 증가 세포 사망의 비율. 간이 제안 된 것보다 더 큰 조각으로 절단되는 경우, 소화가 덜 효율적이고, 제조시보다 세포 사멸을 초래한다. 단계 5의 절차를 완료 한 후, 샘플의 순도가 충분하지 percen 경우단계 2에서 제조 된 단일 세포 현탁액 중의 세포 파편 TAGES 죽어가는 세포는 마이크로 비드는 비특이적으로 결합하고, 따라서, 단열의 순도가 크게 감소하고, 너무 높다. 마이크로 비드 기반 정제 후 낮은 세포 수 기술 된 프로토콜의 성공을 위해,이 프로토콜에 제시된 바와 같이 마이크로 비드에 세포의 비율을 최적화하는 것이 중요하다. 이상의 마이크로 비드를 이용하여 순도를 감소시키고, 분리 된 세포의 수율 가능성을 감소시킨다. 프로토콜에서 제시된 것 이외의 표면 마커는 전구 서브셋 분리를 위해 사용되는 경우, 마이크로 비드에 세포의 최적 비율을 결정해야한다. gp38 + CD133의 자기 마이크로 비드 기반 격리 - 인구 추가로 10 μL 안티 CD133 + 마이크로 비드를 추가 단계 5.3에서 섹션 5에서 단계를 수행 한 후 다음 단계 5, 6.2 및 설명과 같은 6.3디. 절대 세포 수를 계산 간 중량은 특정 서브 세트의 많은 세포 g의 간 조직에 따라 존재하는 방법을 계산하는 데 사용된다. (살아있는 세포의 아 집단의 % () 유동 세포 계측법에 기초하여 / 100) 간 편 = Z로부터 단리 총 생존 세포 수를 X (간 조각의 1 / 무게) Z = 세포 수 / g의 간 조직을 X 이 방법으로 분리 할 수있는 다른 세포 집단 (등 또는 조혈 세포의 아 집단, 예를 들어, 쿠퍼 세포, 수지상 세포, T 세포, NK 세포) CD45 + 세포 LSECs에는 다음과 같은 간이 소화 프로토콜을 이용하여 세포를 분리 할 수있다. 소화 프로토콜은 간세포 또는 간 성상 세포의 분리에 적합하지 않습니다. 이 세포는 상대적으로 낮은 세포 수에 존재하고 그들은 인접 해에 비해 감소 가능성을 보여가능한 방법을 r에.

간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10. 선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법 (1) (11)를 사용하여 단일 표면 마커를 발현하는 전구 세포를 격리 유전자 발현의 연구에 의해 제안되고있다. 실제로, 최근 새로운 표면 마커 조합하여 gp38 (podoplanin)는 명백하게 다양한 서브 세트들 (12) 선조 세포의 이전 단일 마커 링크. 중요한 것은, 이러한 서브 세트는 그들의 표면 마커의 발현에 차이가없는 아니라 부상 12시 기능적 변화를 나타냈다. 여러 동물 모델은 전구 세포의 활성화, 간 재생을 조사하기 위해 사용되어왔다. 다양한 부상 유형은 전구 세포 (12)의 하위 집합을 서로 다른의 활성화를 촉진 것으로 보인다. 이는 pH를 설명 할 수있을인간 4에서 관찰 ductular 반응 enotypic 발산. 따라서, 전구 세포의 표현형 복잡한 기능적 분석은 부상 역할 및 간 질환의 ductular 반응의 참된 의미를 이해하는 피봇된다. 표면 마커 조합 외에, 세포 격리 프로토콜의 중요한 차이는 또한 이전의 연구 (2)에 기초하여 결론을 복잡. 연구의 상당한 양을 크게들이 분리 프로토콜 상이한 전구 세포 (예, 간 분리 (효소 결합 프로세스의 기간), 밀도, 매질 및 원심 분리 속도)의 역할이 해결. 최적화 된 분리 기술, 희귀 세포 집단에 대한 더 나은 가능성을 제공하고 일부 조성물의 반사가 개발하고 최근 12 게시되었습니다. 이 문서의 목적은 더 DET을 제공하는 것입니다이 간세포 분리 절차 및 일부 분석 ailed 프로토콜 기술의 적절한 재생을 허용한다. 또한, 프로토콜은 새로운 프로토콜과 비교하여 차이를 설명하기 이전의 분리 방법과의 비교를 포함한다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>phenol red free DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Prepare 1% stock solution</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>add 0.5% (v/v) BSA and store on ice</td></tr><tr><td>Phenol-red free DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>counting Beads Count Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Purified</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 Purified</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells</td></tr><tr><td>CD31 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>102504</td><td>Dilution: 1:200, marks endothelial cells</td></tr><tr><td>ASGPR1 Purified</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>Dilution: 1:100, marks hepatocytes</td></tr><tr><td>Podoplanin APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>Dilution: 1:1,400, marks progenior cells</td></tr><tr><td>Podoplanin Biotin</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>Dilution: 1:1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>use 3 &amp;micro;L, marks progenitor cells</td></tr><tr><td>CD133 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotin</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>Dilution: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>Dilution: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>use 10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b, &amp;kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, &amp;kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a, &amp;kappa; Biotin</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a, &amp;kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Syrian Hamster IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Syrian Hamster IgG Biotin</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat IgG Control Purified</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Dilution: 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Dilution: 1:400</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m Filter mesh</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Round bottom tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT lysis buffer is included</td></tr></tbody></table>

isolation and enrichment of liver progenitor subsets identified by a novel surface marker combination

만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.

실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 마이너스 된 세포 게이팅된다. 이것은 인구 간 전구 세포를 포함하고 자신의 gp38 및 CD133의 발현 (도 2a)에 기초하여 그룹화 될 수있다. gp38 + CD133 +와 gp38 - 건강한 성인 마우스 리브 셀 - CD31 - - ASGPR1 CD133 + 세포가 가장 풍부한 세포 CD45 중 인구를 나타냅니다ER (도 2a, b). 이러한 서브 세트들은 이전 예는 EpCAM, 무서-1 및 CD34 (도 2C)과 같은 전구 세포와 관련된 추가적인 표면 마커의 발현에 차이가있다. 전구 세포는 그러한 간세포 간 정현파 내피 세포 (LSECs) (도 1 및 3) 및 전구 세포는 자기 마이크로 비드 기반 격리하여 더 정제 할 수있다 (도 3a, b) 또는와 같은 조혈 및 실질 세포에서 소모 될 수있다 정렬 고순도 (도 1 및 4). 90 % 이상의 순도 CD133 + 또는 gp38 + 세포 결과의 자성 마이크로 비드 기반 격리 (도 3a, b) 어떠한 오염 CD45, CD31 또는 ASGPR1 + 세포에 대하여, 상기 세포는 고도로 생존 유지 (도 3a, b). 능력이 상이 할 수있다. 이 조직 분리에 이용 효소 혼합물의 선택에 특히 적합하다. 여기서, 콜라게나 제 P 대신 콜라게나 D 간은 1, 2, 8을 사용 하였다. 중요한 것은, 선조 세포 CD133의 발현 수준 및 절연 세포 집단의 수율이 크게 콜라게나 D의 존재 하에서 저하되었다 (도 5a, b). 이 외에도, 우리의 혼합물을 부드러운 세분화 및 각종 유형의 세포의 계대 배양 (13)에 매우 적합하다, 디스 파제 함유 하였다. 디스 파제가 나타내는 함께 콜라게나 제 P전구 세포 분석 간 세포 해리 이상적인 조합. 이 조합은 트립신 우월하거나 간 프로 나제 ​​계 소화 (데이터는 보이지 않음). 조상이 프로토콜에 제시된 분석을 위해이 같은 퍼콜 기반 농축 2, 14 그 밀도 원심 분리를주의하는 것도 중요하다, 필요하지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig1.jpg" /> 그림 1 : 설명 프로토콜의 워크 플로우. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig2.jpg" /> 그림 2 : 간 전구 부분 집합의 소설 분류. 단일 셀서스펜션은 건강한 간에서 준비하고 이후 표면 마커의 패널로 염색했다 : CD45, CD31, CD133 및 gp38 (A). 죽은 세포 배제, 요오드화 프로피 듐 (PI)을 이용 하였다. 게이팅 전략 대표 도트 플롯이 도시되어있다. 세포 수의 결정 유동 세포 계측법에 사용되는 게이트도 표시됩니다. (B) 백분율 야생형 미처리 동물에서 CD45 음성 세포 중에서 각종 간질 세포의 서브 세트 간 조직의 g 당 본 셀의 절대 값이 도시되어있다. (C) 히스토그램 건강한 간 실질 세포 서브 세트의 구별 마커 특성을 표시. CD34는 B. 무서-1 B에 존재하는 하위 집단에 대한 특정 동안 높은 CD90.2의 표현과 CD157의 존재, A에 대한 특정, C, D와는 EpCAM 인구 C 및 D 평균 ± SEM에만 존재; 데이터 (AC)는 n은 2-3 독립적 인 실험 = 실험 당 3-4을 나타냅니다. 데이터 WER전자는 부대, 두 개의 꼬리 T 테스트 *의 P &lt;0.05, ** P &lt;0.005, *** &lt;0.0001 P를 사용하여 비교 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig3.jpg" /> 그림 3 : 자기 마이크로 비드 기반 농축 및 자동화 된 세포 정화. CD45의 (A) 자기 마이크로 비드 기반의 농축 - CD31 - 그리고 ASGPR1는 - 세포는 이전과 농축 한 후 그려져있다. 자동화 된 마이크로 비드 기반 세포 절연 부의 (B) 대표 도트 플롯은 왼쪽에, CD133 + 및 gp38 + 세포에 대한 묘사된다. 우측에서 전후 농축 후의 세포 집단의 생존 능력의 백분율로 나타낸다요오드화 프로피 듐 (PI) -negative 세포. ± SEM을 의미; 데이터 (AB)의 실험 당 N = 3 3 독립적 인 실험을 나타냅니다. 데이터는 부대, 양측 T 테스트의 * P &lt;0.05, ** P &lt;0.005, ** P &lt;0.0001를 사용하여 비교 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig4.jpg" /> 그림 4 : 고순도 전구 부분 집합의 종류 유동 세포 계측법. 도트 플롯 정렬 된 샘플 (정렬 후)의 세포 집단의 순도를 도시한다. 데이터는 세 독립적 인 실험을 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig5.jpg" /> 그림 5 : 소화 효소의 비교. 또는 콜라게나 D (2 단계에서 설명 된 바와 같이) 단일 세포 현탁액을 콜라게나 제 P를 사용하여 제조 하였다 (1 ㎎ / ㎖ +의 DNase-I 0.1 ㎎ / ㎖) 건강한 간로부터 연속적 표면 마커의 패널로 염색 하였다 : CD45을 CD31, CD133, gp38 및 (A). 야생형 미처리 동물에서 CD45 음성 세포 중에서 각종 간질 세포의 서브 세트 간 조직의 g 당 존재하는 세포의 비율을 나타낸다. (B) CD133의 중간 형광 세기는 CD133 + 세포 집단에 대해 도시된다. ± SEM을 의미; 데이터 (AB)의 실험 당 N = 3이 독립적 인 실험을 나타냅니다. 데이터는 부대, 양측 T 테스트의 * P &lt;0.05, ** P &lt;0.005, ** P &lt;0.0001를 사용하여 비교 하였다.대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K 조회수.  Saarland University Medical Center.  간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다. 

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Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

연구

발생학

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

생물학

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

면역학 및 감염병학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

생체공학

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

의학

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...