저자는 박사 짐 Lah와 앨런 Levey, 모리 부 신경과의 도움이 의견 및 제안에 대 한 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 투자 함으로써 의학 협력 가속 부여 (U01AG046161-02)에 모리 Alzheimer의 질병 연구 센터 (P50AG025688) 및 노후화에 국가 학회 부여 (R01AG053960-01) N.T.S.를 이 연구도 일부 모리 신경 과학 NINDS 핵심 시설 보조금, P30NS055077의 Neuropathology 코어에 의해 지원 되었다.

윤리 성명: 모든 뇌 조직에 모리 츠에서 가져온 &#39; s 질환 연구 센터 (ADRC) 두뇌 은행. 인간의 사후 조직 적절 한 제도적 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에서 인수 했다.
 1. 균질 및 분류 <ol><li>조직 선택 참고: 사후 담당 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 고정 광고 사례를 확인된은 모리에서 선정 되었다 ADRC 두뇌 은행 (n = 2). 녹말 체 패 배포의 사후 neuropathological 평가 츠에 대 한 레지스트리를 설정 하는 컨소시엄에 따르면 수행 했다 &#39; s 질병 반 정량적 기준 24, 비록 득점 neurofibrillary 얽힌 병리학 Braak 준비 시스템에 따라 평가 했다. 16 <ol><li>얻기 냉동 사후 뇌 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 확인 광고의 경우. 드라이 아이스, 집게 및 면도날의 컨테이너를 활용 하 여, 소비 세 ~ 250mg 부분 tared 일회용에 각 조직 샘플에서 회색 물질의 무게 배, 조직 해빙 하지 않도록 돌보는. 무 균 수를 각 작품의 무게를 기록.</li>
		<li>소비 세 ~ 250mg의 회색 문제를 사용 하 여 집게와 면도기 시각적으로 검사 하 여 외부 회색 물질과 내부 백색 질 사이의 인터페이스를 찾습니다. 백색 질 및 더 중요 한 것은, 어떤 큰 혈관 또는 살 벌 한 지역, meninges, 또는 거미 집 모양의 메이 터. 신속 하 게 작업 하 고 자주 폴리스 티 렌 용기 마른 얼음에 뇌 조직으로 무게 배를 배치 하 여 절단 과정에서 냉동 조직 유지</li>
		<li>Excised 분석 균형을 사용 하 여 각 냉동된 조각에서 회색 물질의 정확한 무게를 기록 합니다. 계산 볼륨 낮은 소금 (LS) 버퍼의 dounce 균질 (5 mL/g 또는 20 %w / v)에 대 한 필요 (표 1 참조).</li>
		<li>프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 및 얼음에 진정 x 1 준비 10 mL LS 버퍼</li>
		<li>무게 조직과 무게 보트에서 제거 드라이 아이스와 약 2 x 2 m m 조각으로 주사위로 그것은 녹은. 얼음에 2 mL 미리 냉장된 dounce 균질 화기 튜브에 전송</li>
		<li>프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 X 1와 차가운 낮은 소금 (LS) 버퍼의 5 mL/g (20 %w / v) 추가.</li>
		<li>Homogenize 높은 클리어런스 유 봉 A와 낮은 클리어런스 유 봉 b.의 15 획의 약 10 타를 사용 하 여 얼음에 뇌 조직</li>
		<li>유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 2 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 모든 homogenate를 전송. 와 함께 튜브 라벨 &#8220; 일 &#8221; (총 Homogenate), 조직의 경우 수, 그리고 homogenate 볼륨. 약 수 0.8 mL 레이블이 1.5 mL 튜브에. 어떤 과잉 homogenate 수 마찬가지로 aliquoted-80에 저장 ° c.</li>
		<li>각 0.8 mL aliquot, 추가 100 µ L 각 5 M NaCl 및 10% (w/v) sarkosyl의 농도 0.5 M 및 1 %w / v, 각각. 반전에 의해 잘 튜브를 혼합 하 고 15 분 레이블 튜브에 대 한 얼음에 품 어 &#34; TH-S &#34; (총 Homogenate-Sarkosyl)는 homogenates sarkosyl-버퍼 (표 1)에 나타냅니다.</li>
		<li>얼음에 30% 진폭에서 3 5의 펄스에 대 한 각 튜브를 sonicate (최대 강도 = 40%) 사용 하 여 microtip 프로브.</li> <li>bicinchoninic 산 (BCA)를 사용 하 여 homogenates의 단백질 농도 시험 25 확인 방법. 
		참고: 조직의 그램 당 5 mL LS에서 일 S homogenates의 평균 단백질 농도 15 ~ 20 mg/mL. homogenates 수 수 즉시 분류 한 또는 사용까지-80 ° C에 저장.</li>
		<li>10 mg/ml 1 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 x 차가운 사크 버퍼 (표 1)를 사용 하 여 희석 TH-S homogenates.</li>
		<li>전송 5 mg 단백질 (0.5 mL) 500 µ L 폴 리 카보 네이트 ultracentrifuge 튜브와 쌍-균형 사크 버퍼에 각 TH-S homogenate의. 미리 냉장된 회전자와 180000 x g 1.5 mL 튜브에 4 ° c. sarkosyl-수용 성 전송 supernatants (S1)에서 30 분에서 ultracentrifuge에 튜브를 로드 하 고-80에서 저장 ° c. 
		참고: 사크-버퍼는 ultracentrifuge의 (선택적 세척) 추가 200 µ L 튜브 세제 불용 성 분수 (P1)를 포함 하 고 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 ultracentrifuge 튜브의 아래쪽에서 펠 릿 (P1)를 꺼내 려.</li>
		2-3 s <li>짧게 펄스-스핀은 거꾸로 튜브 (&#8804; 2500 x g) 아래 1.5 mL 튜브에 펠 릿 (P1) 및 버퍼 전송 microcentrifuge에. 펠 릿 중단 되도록 아래로 pipetting으로 사크 버퍼에서 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.</li>
		<li>쌍-균형, 그리고 4에서 추가 30 분 180000 x g에서 원심 분리기 ° c.</li>
		<li>선택적 세척 상쾌한 (S2)를 폐기 하 고 1 요소 버퍼 (표 1)의 50-75 µ L에서 sarkosyl-불용 성 펠 릿 (P2)를 품 어 그림 (프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일) 실 온에서 30 분 동안 solubilize x는 펠 릿. 
		참고: 따뜻한 요소 버퍼 SDS 강수량을 피하기 위해 사용 하기 전에 실내 온도에. 세제에 민감한 애플리케이션을 위해 요소 버퍼에서 SDS를 생략 하 고 요소 버퍼에 resuspending 전에 낮은 소금 버퍼에 불용 성 펠 렛 (P2) 세척을 고려.</li>
		<li>0.5 mL 튜브에 resuspended 펠 릿 (P2)을 전송 하 고 간단한 사용 (1 s) 20% 진폭 microtip 쥡니다 (최대 강도 = 40%)을 완벽 하 게 알 약을 solubilize.</li>
		<li>Sarkosyl-수용 성 (S1)의 단백질 농도 결정 하 고-BCA를 사용 하 여 불용 성 (P2) 분수 시험 방법. 이 분수를 사용 하 여 즉시 또는 사용까지-80 ° C에 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol>서양 blotting <li> 참고: 약간의 수정을 이전에 보고 된 절차에 따라 수행 했다 서쪽 blotting. 5 , 10 <ol><li>준비 40 µ g 샘플 총 homogenates (TH-S), 사크 성 (S1) 및 5 mM의 TCEP ph 7 1 X Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼에 사크-불용 성 (P2) 분수의. 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품 어</li>
		<li>부하 샘플에는 캐스트 10 잘 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤. 첫 번째 센티미터 (10 분)에 대 한 V 80와 120 V 나머지 (60 분)에 대 한 또는 추적 염료는 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 electrophorese.</li>
		<li>신선한 면도날과 젤 칼 분할-오픈 프리 카스트 젤 카세트를 사용 합니다. 부드럽게 버려야 빗과 신선한 면도날으로 젤의 끝.</li>
		<li>Pipetting으로 그림 고 아래로 1 x 200 µ l 사크-버퍼에 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.</li>
		<li>0.2 µ m 니트로 막 더 럽 히 기계에 건조 전송 메서드를 사용 하 여 전송 (자료 표 참조).</li>
		<li>차단 BB와 뒤를 0.05% 블로킹 버퍼 (BB) 트윈 20 30 분 없이 막 30 분 트윈 20 (BB/T). 차단, 후 린스 TBS/T에서 막 (0.1% Tween 20) 5 분 초과 차단 버퍼 제거.</li>
		<li>준비 1:1,000 희석 주 항 체 pT231, 타우-2 (팬 타우), AT8의 그리고 BB/T에서 EEA1 (0.05% 트윈 20).</li>
		<li>원형 동요와 4 ° C에서 하룻밤 1 차적인 항 체 솔루션에 막 품 어. 3 x 15 분에 대 한 큰 술/T에 막 씻어</li>
		<li>어둠 통에 붙일 레이블 근처-적외선 이차 항 체의 BB/T에 실 온에서 60 분에 대 한 1:20,000 희석와 막 조사. Tbs.에 3 x 10 분 TBS/T와 2 x 5 분 막 씻어</li>
		<li>스캔 이미징 시스템 (예: 700 nm (빨강 채널) 적외선 염료 680 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) 보조와 800 nm (녹색 채널) 적외선 염료 790 당나귀-토끼 IgG (H + L에 대 한 적절 한 여기 파장에는 적외선을 사용 하 여 막 보조)).</li>
		<li>이미징 소프트웨어를 사용 하 여 신호 강도 계량 제조자에 의하여 densitometry 측정 수행을 &#39; s 지시, 평균 전체 배경 설정 자동 배경 설정 보장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. 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저자는 공개 없다.

여기 소개 하 고 다양 한 misfolding 분석 기능 단백질 질량 분석 기반 proteomics 분석에서까지 실험적인 응용 프로그램에 적용 하는 약식된 단일 단계 세제 분별 프로토콜 토론 그리고 서 부 럽입니다. 5 , 6 , 7 , 10 이 방법론은 아마도 가장 효과적인 치 매 등 신경 proteinopathies 공부 하는 데 사용 하는 경우, 루 게 릭 병, 헌팅턴 병, 프리온 질병 및 다양 한 tauopathies. 원래 5 단계 순차 분류 프로토콜에 비해,이 단일 단계 절차 하루에 완료 될 수 있다 고 매우 비슷한 결과 제공. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
이 프로토콜의 중요 한 측면은 분별 세제로 sarkosyl 사용 하 여. 트라이 톤 X-100 또는 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 같은 다른 세제와 sarkosyl;이 작업에 적합 될 것으로 보인다 엄중 및 solubilizing 힘, 그것은 충분히 강한 세제 용해성, 구조와 본질적으로 질병 관련 단백질의 기능을 유지 하면서 기본적으로 접힌된 단백질의 대부분을 solubilize SDS에 민감한. 5 , 9 또한, SDS, 달리 sarkosyl 남아 용 해 낮은 온도에서 높은 소금 조건에서.
이 프로토콜의 또 다른 주요 특징은 ultracentrifugation의 첫 번째 다음 첫 번째 sarkosyl-불용 성 (P1) 펠 릿의 물의 resuspension 이다. 이 세척 단계 어떤 잔여 교차 오염의 초기 펠 릿 (P1) 철저 하 게 추출 및 세척 수 수용 성 또는 총 homogenate 단백질, 순수 하 고 잘 정의 된 세제 불용 성 단백질 분수 형편. 옵션 펠 릿 (P1) 물의 resuspension 및 세척 단계 없이 잔여 용 해 단백질 수 있습니다 수 실행 오버 후속 결과 실험 (즉 immunoblotting 또는 proteomics 분석)를 가능 하 게 혼동 세제 불용 성 부분에.
불용 성 및 높은 분자량 자연 pathologic misfolded 단백질 집계 (즉 타우 인 타우, Aβ 종) 현재 독특한도 전에 그들의 격리 및 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 분석. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 달리 수용 성 단백질, 불용 성 amyloids (Aβ)와 같은 집계와 쉽게 사후 조직에서 immunoprecipitation와 같은 전통적인 방법으로 정화 또는 빠른 hyperphosphorylated 타우 neurofibrillary tangles (NFTs) 수 없습니다. 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 따라서, 약식된 sarkosyl 분류 프로토콜은 손쉬운 농축 및 사후 뇌 비교적 짧은 시간 프레임 내에서 세제 불용 성 단백질의 격리를 허용 하는 유일한 방법 중 하나. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
추가 단계는 집계 된 단백질의 순수 하 고, 동질적인 샘플을 채택 될 수 있다, 하는 동안 sarkosyl 분류 프로토콜 비교적 작은 시간 투입으로 세제 불용 성 단백질의 손쉬운 농축 수 있습니다. 5 , 6 이 가설을 지 원하는 sarkosyl-불용 성 프로테옴의 proteomic 연구 확인 알려진된 pathologic 집계 경향이 단백질의 대부분 분수에서 sarkosyl 불 용해성으로 모두 전통적인 다중 단계 분 6 , 11 , 21 뿐만 아니라 우리의 새로운 단일 단계 분류 접근. 5 , 7 , 9 , 10

Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 루 경화 증 (ALS), 밀접 하 게 관련된 프리온 질환 등 신경 퇴행 성 질환은 proteinopathies의 점진적인 축적에 의해 특징 세제 불용 성 단백질 집계 동반 인지 뇌에서 떨어진다. 1 , 2 이 공유 병 적인 기능 이상 이러한 신경 퇴행 성 질환의 병 인에 중심 역할을 담당할 생각 이다. 2 이러한 집계 일반적으로 β크로스 misfolded 단백질 전시의 단위를 반복으로 구성 된 고분자 녹말 체 섬유의 구성-구조. 1 , 2 , 3 , 4 화학적, 녹말 체 집계는 화학 또는 열 변성을 가용 화, 그들의 정화, 분석에 독특한 도전을 선물 한다3 높은 저항 하 고 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 공부. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 unsurprisingly, 세제 불용 성 단백질 분수가 되었습니다 misfolded 단백질의 축적을 포함 하는 신경 퇴행 성 질환의 이상으로 많은 연구의 초점. 6 , 12 , 13 , 14
생 화 확 적인 분류 기법 종종 사후 뇌 homogenates에서 세제 불용 성 부분을 풍부 하 게 이용 되어 있다. 6 , 12 , 13 , 14 가장 일반적인 방법 중 하나는 버퍼와 조직 homogenates의 연속 추출과 엄중, 가용성과 불용 성 부분을 분할 하는 ultracentrifugation 다음 증가의 세제 포함 됩니다. 일반적으로 사용 되는 순차 분류 프로토콜6,14 세제 무료 낮은 소금 (LS) 버퍼에서 냉동된 조직 샘플의 균질 화를 포함 하 고 결과 불용 성 펠 릿은 다음 순차적으로 추출 높은 소금, 비 이온 세제, 높은 자당을 포함 하는 버퍼, 이온 세제 그리고 마지막으로 chaotropes 요소 처럼. 6 , 14 이러한 순차적 분별 프로토콜의 명백한 결점은 상당한 시간과 노동 투입을 완료 하는 데 필요한. 균질과 ultracentrifugation를 포함 하 여 전형적인 5 단계 분류 프로토콜 걸릴 수 있습니다 몇 시간 또는 일. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 또한, 많은 pathologic 단백질 집계 남아 모든 가혹한 조건19,20 하지만 불용 성 생성 된 분수의 대부분은 제한 된 값의. 따라서, 높은 소금 농도 및 비 이온 세제 덜 엄격한 분류 단계 크게 중복 됩니다.
이전 연구는 이온 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 단순화 된 단일 단계 세제 분별 프로토콜에 대 한 우수한 후보 나타났습니다. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 변성 세제로 sarkosyl는 충분히 solubilizing misfolded 단백질 집계 베타-아 밀 로이드 (Aβ),6,11의 구성 없이 뇌에서 기본적으로 접힌된 단백질의 대부분을 solubilize 엄격한 phosphorylated 타우 (pTau),6 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43),14 알파 synuclein,12,13 scrapie,23 또는 u 1 작은 핵 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) u 1-70 K 등. 5 , 21 , 22 Sarkosyl 유비 쿼터 스 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 보다 덜 엄격으로, SDS 처리를 견딜 수 없는 misfolded 단백질 집계의 덜 강력한 oligomeric 형태 유지 합니다. 9
이전에 우리는 더 힘 드는 순차 분류 방법론에 유사한 결과 달성 하는 약식된 세제 분별 프로토콜을 설명 합니다. 5 덜 엄격한 분류 단계를 생략 하 여 우리 수 있었다 사후 인간의 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 손쉬운 단일 단계 분류 프로토콜을 개발. 5 여기에 설명 된이 상세한 프로토콜 서쪽에 게 더 럽 히기에서 배열 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 적합 하 고 기능적인 단백질 misfolding 및 집계 시드를 질량 분석 기반 단백질 분석 실험. 5 , 6 , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

이 연구에서 우리는 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜을 설명합니다. 이오니아 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 효과적으로 뇌 조직 신경 proteinopathies의 넓은 범위에서 세제 불용 성 단백질의 농축을 같이 허용에 기본적으로 접힌된 단백질 solubilizes Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 및 루 경화 증, 그리고 프리온 질병 인간의 제어 및 광고 사후 뇌 조직 되었고 무 균 sedimented ultracentrifugation sarkosyl 세제 불용 성 단백질 집계 pathologic phosphorylated 타우, neurofibrillary의 핵심 구성 요소를 포함 하 여 풍부 하 게 존재 하 여 광고에 tangles입니다. 서 부 럽 집계 phosphorylated 타우와 세제 수용 성 단백질, 제어 및 광고 두뇌에서 초기 Endosome 항 원 1 (EEA1)의 차동 가용성을 설명 했다. Proteomic 분석은 또한 β의 농축을 밝혀-아 밀 로이드 (Aβ), 타우, snRNP70 (U1-70 K), 그리고 apolipoprotein E (APOE) 제어, 이전 조직 분류 전략 일치의 그들에 비교 하는 광고 두뇌의 sarkosyl-불용 성 분수에 . 따라서,이 간단한 농축 프로토콜에 이르기까지 서 부 럽 고 기능 단백질에서 공동 집계 분석 실험 단백질 질량 분석 기반 실험 응용 프로그램의 광범위 한 이상적입니다.

축약된 한 단계 sarkosyl-분별 프로토콜 제어 및 광고 사후 뇌 (그림 1)에서 세제 불용 성 단백질 집계를 풍부 하 게 사용 되었다. TH-S, S1, S2, P2 분수에서 단백질 SDS-PAGE, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼와 부드러운 얼룩 뒤에 15 분에 대 한 고정 해결 했다. 때문에 s 2 분수에 단백질의 탐지 수준 물의 resuspension 단계는 선택 사항 (1.1.14 참조). 서쪽 오 점 분석 (그림 2A 와 B) 광고 두뇌 pathologic 높은 분자 무게 phosphorylated 타우 집계 했다 sarkosyl-불용 성, 그리고 아주 작은 pTau에 남아 있었다 명확 하 게 설명 합니다 sarkosyl-수용 성 분수입니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 반대로 제어 두뇌에 있는 pTau의 대다수 sarkosyl 수용 성 부분으로 분할. 5 , 6 , 10 반면, EEA1 주로 파티션을 제어 및 광고 뇌 (그림 2C) S1 분수에. 여기, EEA1는 본질적으로 sarkosyl 성5가장 기본, 비-pathologic 단백질에 대 한 일반 마커 역할을 합니다. 특히, EEA1의 작은 풀 가능성이 sarkosyl-불용 성,이 특정 항 체로 서쪽 오 점 하 여 탐지의 한계 아래 아직 나타내는 일 S 분수에 비해 녹는 분수 (S1)에서 EEA1에 대 한 약간은 덜 신호가입니다. 그것은 동등 하 게 가능한 수용 성 분수 (S1)에서 EEA1의 신호 강도에 약간의 감소 ultracentrifuge 튜브에 EEA1의 비 특정 바인딩 때문입니다 또한 예상된 결과에서 약간의 편차를 설명할 수 있다.
벤치 마크 (그림 3B), 전통적인 다중 단계 순차 분류 방법론에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜 (그림 3A)의 효능 sarkosyl 불 용해성의 상대적 수준 녹말 체 선구자 단백질 (APP), 타우 (MAPT), 작은 핵 ribonucleoprotein U1-70 K (snRNP70)와 apolipoprotein E (APOE) 풀링된 제어 (Ctl), 가벼운 인지 장애 (MCI)에 걸쳐 레이블 무료 질량 분석 (MS) 기반 단백질에 의해 비교 되었다 및 광고 이전에서 사례 연구7,18 (그림 3). 세제 불용 성 애플 리 케이 션의 측정은 효과적으로 Aβ 펩 티 드를, 모든 완전히 tryptic APP 펩 티 드 정량으로 전체 길이 695 잔류물 APP 단백질7의 Aβ 영역에 매핑된 나타냅니다. 두 방법으로 모두 4 pathologic 단백질의 sarkosyl-불용 성 수준 인지 감소와 병 적인 부담 강한 상관 관계와 함께 일관 된 컨트롤에 상대적인 MCI 및 광고 경우에 위쪽으로 줍니다. 전반적으로, 농축 세제 불용 성 분수 (P2)에이 단백질의 현저 하 게 일관 된 단일 단계18 및 다단계 분류 프로토콜7를 사용 하 여 했다.
그러나, 유리 또는 정확한 특성에 따라 해로운 증명할 수 있는 두 가지 방법론 및 개별 실험의 목표 간의 약간의 차이가 있다. 그림 3 에 요약 비교 proteomic 데이터 특정 실험적인 매개 변수 및 응용 프로그램에 따라 사용 하는 프로토콜을 알릴 수 있습니다. 하나는 예상 하듯이, 일반 절충 샘플 농축 및 순도, 다단계 방법 보다 적은 단백질 손실 더 풍부한 샘플을 affording 단순화 된 분류 프로토콜입니다.
예를 들어 제어 불용 성 분수 (그림 3A) 간단한 프로토콜을 사용 하 여 준비 다단계 접근 방식을 통해 준비 보다 질병 관련 단백질의 약간 높은 배경 수준을 전시 한다. 반대로, 단일 단계 분류 기법 손실을 크게 줄일 수 있습니다 전반적인 샘플으로 낮은 풍부한 단백질에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어, MCI의 경우 sarkosyl-불용 성 APOE의 상대 농축 약식된 프로토콜(그림 3)을통해 준비 하는 불용 성 분수에 크게 높은 수준 이다.
두 방법 모두는 질병 관련 또는 pathologic misfolded 단백질 집계, 더 수많은에 상당한 증가 관찰 하는 것 보다 더 적절 한 광범위 한 분류 및 다단계 방식의 세척 단계 청소기를 생성할 수 있습니다 그리고 좀 더 구체적인 proteomic 서명입니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 데이터 단일 단계 분류 방법은 타우 neurofibrillary tangles (NFTs), Aβ 플 라크 등 scrapie prions 홍보 (Sc) pathologic 집계 sarkosyl에 용 해 되지 않습니다 게시 된 결과와 일치 한지 확인 그러나 기본적으로 접혀 들 유지 성. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
컨트롤의 세제 불용 성 조각으로 분할 하는 단백질의 상대적 금액을 계산 하 여 (n = 3) 및 광고 (n = 3) 두뇌 (표 2)만 ~ 총 단백질 풀의 10%는 sarkosyl-불용 성. 때 뇌 homogenate (TH-S)의 5 mg 총 단백질은 분류 한, 10.4%와 11.3%는 프로테옴의 파티션을 제어 및 광고의 경우, 세제 불용 성 부분에 각각. 두 그룹 간에 큰 차이가 관찰 했다 광고 두뇌에서 풍성 하 게 하는 sarkosyl-불용 성 단백질의 총 금액은 컨트롤 보다 약간 더 높은, (p = 0.703). 이 단백질 misfolding 및 집계 광고 뇌에 광범위 하 게는 하지만 오히려 타우, Aβ 및 U1 등 단백질의 좁고 특정 하위 집합 제한 snRNPs을 나타냅니다. 7 , 21 , 22

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig1.jpg"> 
그림 1: Sarkosyl 분류 계획. (A) A 사후 인간의 뇌 후 sarkosyl와 NaCl 각각 1 %w / v, 0.5 M의 최종 농도에 추가 되었고 얼음에 15 분 동안 incubated 낮은 소금 버퍼에서 무 균 했다. 쥡니다, 후는 homogenates 했다 분류 일 분 sarkosyl-수용 성 상쾌한 (S1)와 sarkosyl-불용 성 펠 렛 (P1)을 affording 180000 x g 에서 ultracentrifugation에 의해. P1 펠 릿 ultracentrifugation 최종 sarkosyl-불용 성 펠 렛 (P2)을 감당할 여 사크 버퍼와 다시 sedimented 세척 (선택적으로) 이었다. 이 P2 분수 깨끗 한 microtip 프로브와 3 x 5의 쥡니다 뒤 실 온에서 30 분 동안 요소 버퍼에서 solubilized 했다. (B) 단백질 (20 µ g) TH-S, S1, s 2에서 (10 µ L) 및 P2 분수 SDS 페이지, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼 하룻밤 실 온에서 부드러운 얼룩 뒤에 15 분 동안 고정 확인 했다.<a href="//ecsource.jove. href=""></a href="//ecsource.jove.>com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"target ="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig2.jpg"> 
그림 2: 광고 두뇌의 세제 불용 성 부분에 phosphorylated 타우의 농축. (A 와 B) 단백질 (40 μ g) 총 (TH-S)의 성 (S1)과 불용 성 (P2) 분수 했다 트레오닌 231 (pT231)에 phosphorylated 타우에 대 한 항 체와 얼룩이 또는 AT8 (pSer202, pThr205)에서 pathologic 인 타우 종족의 농축을 입증 하는 광고 두뇌의 불용 성 부분 (P2)입니다. 광고 뇌에서 높은 분자량 집계 타우 세제 불용 성 (P2) 분수에 독점적으로 분할. (C) EEA1 수용 성 단백질 마커 및 총 (TH-S)와 제어 및 광고 두뇌의 용 해 (S1) 분수에 대 한 상대적 로드 제어로 제공. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig3.jpg"> 
그림 3: 단일 단계 또는 여러 단계로 분류 프로토콜을 사용 하 여 pathologic 광고 단백질의 Proteomic 분석. 대표 sarkosyl-불용 성 단백질 응용 프로그램 (Aβ), 타우, snRNP70의 상대 수준 (K u 1-70) 및 다른 질병 사이 APOE 풀링 제어, (A) 단일 단계 또는 여러 단계 (B) sarkosyl를 사용 하 여 MCI 및 광고 사례 분류 방법입니다. 두 데이터 집합에 대 한 단백질 수준 선수 (Psm) 이들의 단백질, 식별 및 100 최대를 설정 하는 정규화 스펙트럼 펩 티 드에 의해 추정 되었다. 제어, MCI, 및 광고의 경우에서 Psm (n = 5 각) 집합 단일 데이터 집합에 대 한 사용 되었다. 다단계 접근, 제어의 2 개의 복제 수영장에서 Psm에 대 한 MCI 및 광고의 경우 (n = 5 각) 분석 했다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M.의 값을 나타내는 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(저 어 RT에서 하룻밤) ddH2O의 100 ml 당 10 %w / v sarkosyl 솔루션: 10 g N-라우릴-sarcosine 나트륨 소금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>낮은 소금 (LS) 버퍼: 50 mM HEPES pH 7.0, 자당 250 m m, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl (사크) 버퍼: LS 버퍼 + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>요소 버퍼 (-20 ° C에서 스토어): 50 mM Tris HCl pH 8.5, 8 M 요소, 2% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 X SDS 로딩 버퍼: 200 mM Tris HCl pH 6.8, 40% 글리세롤, 8% 나트륨 라우릴 suflate (SDS), 0.4 %bromophenol 블루 (BPB), 및 20 m m TCEP pH 7.0 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie 통 버퍼: 40% 메탄올, ddH2O 10% 초 산</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-250 Coomassie 화려한 블루 얼룩 버퍼: 25% 메탄올, 5% 초 산, 0.1% coomassie ddH2O G-250 블루</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie 버퍼 destain: 25% 메탄올, ddH2O 5% 초 산</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 버퍼링 X Tris 염 분 (TBS): 50 mM Tris HCl pH 7.45, ddH2O에서에서 150 m m NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트윈 20 (TBS/T) 1 버퍼링 X Tris 염 분: 50 mM Tris HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20에서 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1으로 X 차단 버퍼 (BB): 50 mM Tris HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% 독점 단백질 (자료 목록 참조), ddH2O 750 m m Methylchloroisothiazolinone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X 차단 버퍼 0.05%와 트윈 20 (BB/T): 50 mM Tris HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% 독점 단백질 (자료 목록 참조), 0.05% 트윈 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 버퍼 목록입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>샘플</td>
			<td>볼륨 샘플 (µ L)</td>
			<td>농도 (µ g / µ L)</td>
			<td>총 단백질 (µ g)</td>
			<td>평균 총 단백질 (µ g) 및 S.E.M.</td>
			<td>% 일-S (5mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.89</td>
			<td>692.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 2</td>
			<td>70</td>
			<td>7.38</td>
			<td>516.6</td>
			<td>518.7 (±99.63)</td>
			<td>10.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 3</td>
			<td>70</td>
			<td>4.96</td>
			<td>347.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>광고 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.77</td>
			<td>683.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>광고 2</td>
			<td>70</td>
			<td>6.67</td>
			<td>466.9</td>
			<td>567.0 (±63.20)</td>
			<td>11.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>광고 3</td>
			<td>70</td>
			<td>7.86</td>
			<td>550.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 단백질 양을 sarkosyl-불용 성 분수 (P2)에. 평균, 단백질의 비율을 제어의 sarkosyl-불용 성 부분으로 분할 (n= 3) 및 광고 (n= 3) 두뇌는 각각 10.4%와 11.3%, 이었다. 의해 입증 제어 및 광고 뇌에서 sarkosyl-불용 성 단백질의 양의 통계적으로 유의 한 차이가 없었다는 학생의 t-테스트 (p = 0.703)와 평균 (S.E.M.) 값의 표준 오차.

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K 조회수.  Emory School of Medicine. 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...