著者は、有用なコメントや提案を夫妻ジム Lah とアランの売れ行き、エモリー神経内科をありがちましょう。この作品もあって資金が供給された医学パートナーシップの促進助成 (U01AG046161-02)、エモリー アルツハイマー病研究センター (P50AG025688)、国立老化研究所 (R01AG053960-01) に与える N.T.S.この研究はだった一部のエモリー神経組織プラスミノーゲンアクテベータ中核施設助成金、P30NS055077 の神経病理コアでもサポートされます。

倫理の声明: すべての脳組織がエモリー アルツハイマーから得られた &#39; s 病研究センター (ADRC) ブレイン バンク。人間の死後の組織は適切な制度審査委員会 (IRB) プロトコルの下で買収された。
 1 均質化と分別 <ol><li>組織選択 注: AD 症例は、エモリーから選ばれた健康管理 (Ctl) からと思われる死後の前頭皮質組織を凍結。アジア防災センター ブレイン バンク (n = 2)。アルツハイマー病のためレジストリを確立するコンソーシアムによるとアミロイド斑の分布の事後神経病理学的評価を行った &#39; 病半定量が基準 24 を得点神経昆布病理学は、ブラークのステージング システムに従って評価されました。 16 <ol><li>取得健康管理 (Ctl) から病理組織学的の死後脳組織の凍結は、広告の場合を確認しました。ドライアイス、鉗子、かみそりの刃の容器を利用して、消費税 〜 250 mg tared 使い捨ての各組織サンプルから灰白質部ボート、組織が融解するを防ぐために世話の重量を量る。均質にする各お荷物の重量を記録します</li>。
		<li>消費税 〜 目視で鉗子やかみそりを使用して外側の灰白質と内部の白質間のインタ フェースを検索する灰白質の 250 mg。白質ともっと重要なは、いずれかを避けるため大きな血管や血地域、髄膜、またはくも膜。迅速に作業し、よく乾燥氷のポリスチレン容器に脳組織と計量ボートを置くことによって切削過程における凍結組織を維持</li>
		<li>は、分析用天秤を使用して各固定部分から摘出した灰白質の正確な重量を記録します。低ソルト (LS) バッファーのボリュームを計算する dounce 均質化 (5 mL/g または 20% の w/v) のために必要 (表 1 を参照).</li>
		<li>準備 10 mL LS バッファー プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテルや氷に興じ x 1</li>
		<li>は、雪解けの季節からドライアイスと約 2 × 2 mm の部分にサイコロの重量を量られた組織と計量ボートを削除します。氷上 2 mL 中古冷蔵 dounce ホモジナイザー チューブへの転送</li>
		<li>5 mL/g (20 %w/v) ホスファターゼとプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 と冷たい低塩 (LS) バッファーを追加します</li>。
		<li>Homogenize 脳組織の高クリアランス杵と杵低クリアランス B. 15 ストロークの約 10 ストロークを使って氷の上</li>
		<li>は、すべての磨砕液をガラス パスツール ピペット 2 mL ポリプロピレン チューブに転送します。ラベルを持つ管 &#8220; TH &#8221; (総磨砕液)、ティッシュ ラベル付き 1.5 mL チューブに番号、およびホモジネート ボリューム。 因数 0.8 mL の場合。避けようと-80 に格納されて任意の過剰の磨砕液を同様にすることができます ° C</li>
		<li>各 0.8 mL を分注、追加 100 μ L 各 5 M の塩化ナトリウムの 10% (w/v) sarkosyl 濃度の 0.5 M と 1 %w/v、それぞれ。逆転でよく管を混ぜるし、15 分ラベル チューブを氷中でインキュベート &#34; TH S &#34; (総磨砕液-Sarkosyl)、乳剤は、sarkosyl バッファー (表 1) を示す</li>。
		<li>氷の上の 30% の振幅で 3 つ 5 のパルスの各チューブを超音波 (最大強度 = 40%) を使用して各プローブ</li> <li>ビシンコニン酸 (BCA) を使用して磨砕液のタンパク質濃度測定 25 決定。メソッド 。
		注: 組織の 1 グラムあたり 5 mL LS で作製した TH S 乳剤の平均蛋白質の集中は 15-20 mg/mL です。ホモジネートをすぐに分別や使用まで-80 ° C で保存することができます</li>。
		<li>を 10 mg/mL の冷たいサーク バッファー (表 1) を用いたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 × 1 回-S の希釈乳剤</li>。
		500 μ L ポリカーボネート遠心管にサーク バッファーとのペア バランス各 TH S ホモジネートの <li>転送 5 mg タンパク質 (0.5 mL)。中古冷蔵ローターと 1.5 mL チューブに 4 ° C sarkosyl 可溶性転送清 (S1) で 30 分間 180,000 × g で遠心管に読み込むし、-80 デパート ° C 
		注: (任意選択洗浄) 追加 200 μ L、遠心するサーク バッファーの管洗剤不溶性画分 (P1) を含む、200 μ L ピペット チップを用いた遠心管の底からペレット (P1) を外します</li>。
		2-3 s 用 <li>簡単にパルス スピン逆管 (&#8804; 2,500 x g) 以下 1.5 mL チューブにペレット (P1) とバッファー転送する遠心機に。ペレットは中断するように、上下にピペッティングでサーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します</li>。
		<li>ペア バランスと 4 でさらに 30 分間 180,000 × g で遠心する ° C</li>
		<li>(S2) の任意選択洗浄滅菌蒸留水し、1 sarkosyl 不溶性のペレット (P2) 尿素バッファー (表 1) の 50-75 μ L を孵化させなさい室温で 30 分間の可溶化、(プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル) PIC x、ペレット 。
		SDS 析出を避けるため使用する前に室温に注意: 暖かい尿素バッファー。洗剤に敏感なアプリケーションの尿素バッファーから SDS を省略し、尿素バッファーに再する前に低い塩バッファーで不溶性のペレット (P2) の洗浄を検討します</li>。
		<li>0.5 mL チューブに再懸濁のペレット (P2) を転送し、簡単な使用 (1 s) 20% 振幅で陰極超音波 (最大強度 = 40%) 完全にペレットの可溶化</li>。
		<li>Sarkosyl 可溶性 (S1) のタンパク質濃度を決定する・ BCA を使用して不溶性 (P2) 分画測定法。すぐにこれらの分数を使用または使用するまで-80 ° C で保存します</li>。
	</ol></li></ol> 2。免疫ブロット <ol>西部にしみが付くこと <li> 注: わずかな修正と以前に報告された手順に従って行われた西部にしみが付くこと 。5 , 10 <ol><li>合計乳剤 (TH 秒)、サーク可溶性 (S1) と 5 mM TCEP pH 7 で 1 X 塩化物イオン sds-page サンプルバッファーでサーク不溶性 (P2) 分数の準備 40 μ g のサンプル。95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベート</li>
		<li>ロード サンプル プレキャスト 10 ウェル 4-12% ビス トリス SDS-PAGE のゲルします。80 最初センチメートル (10 分) のための V、120 V (60 分) 残りの部分または追跡色素がゲルの底まで electrophorese.</li>
		<li>は、開いている分割既製ゲル カセットに新鮮なかみそりの刃とゲル ナイフを使用します。櫛と新鮮なかみそりの刃とゲルの一番下を優しく切り取る</li>。
		<li>1 x ピペッティングの写真上下で 200 μ l サーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します</li>。
		<li>あぶらとりマシン上乾燥の転送方法を使用して 0.2 μ m 硝酸セルロースの膜への転送 (材料表を参照してください).</li>
		<li>ブロック BB と続いて 0.05% Tween 20、30 分間なしバッファー (BB) の妨害で膜トゥイーン 20 (BB/T) 30 分間。ブロック後、TBS/T で膜をすすいでください (0.1% Tween 20) 余分なブロック バッファーを削除する 5 分</li>。
		一次抗体 pT231、タウ 2 (パン タウ)、AT8 の <li>準備縮尺希釈液BB/t EEA1 (0.05% Tween 20).</li>
		<li>では、円形撹拌で 4 ° C で一晩一次抗体溶液中膜を孵化させなさい。3 x 15 分 TBS/T の膜を洗浄</li>
		<li>は、シェーカーで暗闇の中で蛍光標識した近赤外線二次抗体 BB/T で室温で 60 分間の 1:20,000 希釈で膜をプローブします。TBS で TBS/T で、2 × 5 分の 3 × 10 分の膜を洗浄</li>
		<li>スキャン イメージング システム (例えば 700 nm (赤のチャネル) 赤外光吸収色素 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L) セカンダリと 800 nm (グリーン チャンネル) 赤外光吸収色素 790 ロバ抗うさぎ IgG (H + L のための適切な励起波長の赤外線を用いた膜) セカンダリ).</li>
		<li>イメージング ソフトウェアを使用して信号強度を定量化し、メーカーごとのデンシトメトリーによる計測を実行 &#39; の指示、自動-背景の設定を確保する背景全体を平均に設定されます</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins.">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).</li><li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards.">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li><li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここを紹介し、議論する省略形のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルさまざまな試金の折りたたみ機能性タンパク質質量分析を用いたプロテオミクス解析に至る実験アプリケーションに適用されます。西部にしみが付くこと.5,6,7,10この方法論は、おそらく最も効果的なアルツハイマー病など神経変性 proteinopathies を勉強していたとき、ALS、ハンチントン病、プリオン病、様々 なタウオパチー。元の 5 つのステップ順次分別のプロトコルと比較して、単一手順は 1 日で完了することができ、非常に同様の結果を与えます。5,6,7,9,14,22
このプロトコルの重要な側面は、分別洗剤として sarkosyl の使用です。トリトン X-100 またはナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) のような他の洗剤とは異なり、sarkosyl は、このタスクに適してと思われる金詰りと可強度の面でそれは十分に強い洗剤不溶性、構造と本質的には、疾患関連タンパク質集合体の機能を維持しながらネイティブ折られた蛋白質の大半の可溶化SDS に敏感。5,9また、SDS とは異なり sarkosyl まま水溶性低温および高い塩の状態です。
遠心の最初に続く最初の sarkosyl 不溶性 (P1) ペレットの再懸濁がこのプロトコルの大きな特長です。この洗浄ステップにより、初期のペレット (P1) を徹底的に抽出し、洗浄、残留クロス汚染性の水溶性または総磨砕液タンパク質、純粋で明確に定義された洗剤不溶性タンパク質画分を得たします。省略可能なペレット (P1) 再懸濁および洗浄ステップなし残留の可溶性タンパク質がする実施の洗剤不溶性分画は、おそらくそれ以降の結果と実験 (イムノブロットやプロテオミクス解析) を交絡に。
その分離と伝統的な生化学的手法による解析に向けてのユニークな挑戦を提示病理の誤って折りたたまれたタンパク質集計 (すなわちタウ、リン酸化タウと a β の種) の不溶性と高分子量性質。5,6,7,8,9,12,17,21,26水溶性タンパク質とは異なり不溶性アミロイド (a β) などを集約、過リン酸化タウ蛋白もつれ (Nft) が容易に死後の組織から精製した免疫沈降などの従来の方法や高速にすることはできません。蛋白質液体クロマトグラフィー (FPLC)。3,5,6,7,11,12,23,27したがって、略称 sarkosyl 分別のプロトコルは安易な濃縮と比較的短時間フレーム内で死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の分離のためにできる唯一のテクニックの 1 つ。5,6,8,13,15,17,21,27
集約された蛋白質の純粋な均質なサンプルを分離する追加の手順を用いることが、比較的少ない時間のコミットメントと洗剤不溶性タンパク質凝集体の簡便な濃縮可能になります sarkosyl 分別のプロトコル。5,Sarkosyl 不溶性プロテオームのプロテオミクス解析の6この仮説を支持すること知られている病理学的集約しやすいタンパク質の大半に分割 sarkosyl 不溶性分画の両方の伝統的な多段階確認します。6,11,私たちの新規シングル ステップ分別のアプローチと同様、 21 。5,7,9,10

アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、密接に関連のプリオン病などの神経変性疾患はの漸進的な蓄積によって特徴付けられる proteinopathies脳内認知を伴う洗剤不溶性タンパク質凝集体を辞退します。1,2この共有の病理学的特徴は、病因とこれらの神経変性疾患の病態の中心的な役割を果たすと考えられています。2これらの凝集体は通常繰り返し誤って折りたたまれたタンパク質がβクロス展示の単位から成る高分子アミロイド線維の構成-構造。1,2,3,4生化学的、アミロイド凝集体は耐化学または熱変性と溶解、分析、浄化に特有の課題3と、従来の生化学的な手法で研究します。2,5,6,7,8,9,10,11当然、洗剤不溶性タンパク質画分されている誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を伴う神経変性疾患の病態生理に多くの研究の焦点。6,12,13,14
生化学的な分別の技術は、死後脳乳剤から洗剤不溶性分画を豊かにするためしばしば利用されています。6,12,13,14最も一般的な方法の 1 つを含むバッファーを持つ組織ホモジネートの連続抽出と水溶性と不溶性画分を分割する遠心続いて逼迫化洗剤。一般的に使用されるシーケンシャル分別プロトコル6,14を含む洗剤を用いない低塩 (LS) バッファーの凍結するティッシュ サンプルの均質化と結果不溶性のペレットが順番に抽出した、高い塩、非イオン性洗剤、高蔗糖を含むバッファー、界面活性剤そして chaotropes 尿素のような。6,14このような連続した分別のプロトコルの明らかな欠点はかなりの時間とそれらを完了するために必要な労働のコミットメントです。均質化と超遠心法を含む典型的な 5 つのステップ分別プロトコル取ることができるいくつか時間、あるいは日で完了します。4,6,7,10,15,16,17,18また、として多くの病理学的タンパク質凝集体残る過酷な条件19,20を除いてすべての不溶性生成された分数のほとんどは、限られた価値。したがって、高い塩の集中および非イオン性洗剤を利用したより少なく厳しい分別手順は主に冗長です。
以前の研究では、イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) が簡易のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルのための優秀な候補者であることを示しています。5,6,12,13,14,21,22,23変化洗剤として sarkosyl は β-アミロイド (a β)6,11 から成る誤って折りたたまれたタンパク質凝集体を可なし脳内ネイティブ折られた蛋白質の大半を可溶化に十分に厳格リン酸化タウ (pTau)、6タール DNA 結合蛋白質 43 (TDP-43)、14 α-シヌクレイン、12,13スクレイピー、23または U1 小さなに原子力 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) U1-70 K など。5,21,22Sarkosyl ユビキタス陰イオン洗剤ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) よりより少なく厳しいが、SDS の処置に耐えることはできません誤って折りたたまれたタンパク質の凝集体の堅牢性の低いオリゴマー フォームを保存します。9
以前より面倒の順次分別方法論に匹敵する結果を達成する省略形の洗剤-分別のプロトコルについて述べる。5以下の厳しい分別手順を省略するが死後の人間の脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮の安易なシングル ステップ分別のプロトコルを開発することができました。5記載この詳細なプロトコルは西部にしみが付くことから、さまざまな実験的用途の広い範囲のために適して、プロテオミクスの質量分析を用いた機能性タンパク質の折りたたみと集計のシードを試金します。5,6,21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

本研究ではヒトの死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮のため短縮されたシングル ステップ分別プロトコルについて述べる.イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) は効果的に脳組織の変性 proteinopathies の広い範囲から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮を許可するようにネイティブで折られた蛋白質を可溶性します。アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病。人間の制御と広告死後脳組織病理学的リン酸化タウ、原線維変化のコア コンポーネントを含む洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする sarkosyl の存在下で超遠心法による均質化と堆積をいた広告のもつれ。集約されたリン酸化タウと洗剤水溶性タンパク質、初期エンドソーム抗原 1 (EEA1) コントロール、AD 脳での差分の溶解性を示した西部にしみが付くこと。プロテオーム解析も明らかに豊かなβ-アミロイド (a β)、タウ、snRNP70 (U1-70 K)、およびコントロール、前組織分別戦略と一貫性のあるのに比べて AD 脳の sarkosyl 不溶性画分におけるアポリポ蛋白 E (アポ).したがって、この単純な濃縮プロトコルは質量分析を用いたプロテオミクス共同凝集アッセイ西部にしみが付くこと機能性タンパク質からまで実験用アプリケーションの広い範囲に最適です。

省略されたシングル ステップ sarkosyl-分別のプロトコルは、管理と広告死後脳 (図 1) から洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする使用されました。TH S、S1、S2、P2 の一部分からの蛋白質は、SDS-PAGE、Coomassie 青い固定バッファー続けて Coomassie ブリリアント ブルー G-250 染色バッファーと穏やかな染色で 15 分間固定によって解決されました。S2 画分中のタンパク質の検出不可能なレベルがあったので、再懸濁の手順は省略可能 (1.1.14 を参照)。西部のしみの分析 (図 2 a とB) AD 脳の病理学的高分子量のリン酸化タウ凝集された sarkosyl 不溶性とに残ったほとんど pTau を明らかに示して、sarkosyl 可溶性画分。5,6,7,8,10,22逆に、制御の脳内 pTau の大半は sarkosyl 可溶性画分に分割。5,6,10一方、EEA1 主にパーティション分割コントロールで AD 脳 (図 2) S1 分数。ここでは、EEA1 は本質的に sarkosyl 可溶性5最もネイティブな非病理学的蛋白質の一般的なマーカーとして機能します。特に、EEA1 EEA1 のマイナーなプールがまだこの特定の抗体を用いたウエスタンブロットによる検出限界以下の可能性が高い sarkosyl 不溶性であることを示す TH S 分画と比較して可溶性画分 (S1) でわずかに少ない信号があります。それは均等に可溶性画分 (S1) EEA1 の信号強度の低下はわずか EEA1 遠心管の非特異的結合が可能なまた期待される結果からのわずかなずれを説明できます。
Sarkosyl 不溶性の相対的なレベル (図 3 b)、従来の多段連続分別方法論に対して、(図 3 a) 省略されたシングル ステップ分別のプロトコルの有効性をベンチマークするにはアミロイド前駆体タンパク質 (APP)、タウ (MAPT)、低分子量リボ核 U1-70 K (snRNP70) およびアポリポ蛋白 E (アポ) がプールされる制御 (Ctl) 軽度認知障害 (MCI) の間で比較したラベル無料質量分析法 (MS) 基づくプロテオミクスによる広告以前からケース研究7,18 (図 3)。洗剤不溶性アプリの測定は効果的に全長 695 残渣アプリ タンパク質7の a β 領域にマップされているすべて完全にトリプシン アプリ ペプチド定量化として、a β ペプチドを表します。両方の方法ですべての 4 つの病理学的蛋白質 sarkosyl 不溶性レベルは認知機能の低下と病理学的負担の強い相関をもつ一貫したコントロールを基準として MCI と広告の場合上向き傾向。全体的にみて、洗剤不溶性画分 (P2) のこれらの蛋白質の濃縮された著しく一貫性のある多段分別のプロトコル7とシングル ステップ18を使用します。
ただし、有利なまたは正確な性質によって有害証明するかもしれない 2 つの方法と個々 の実験の目標のわずかな違いがあります。図 3に示す比較プロテオーム データ特定の実験的パラメーターとアプリケーションによって使用するプロトコルに通知可能性があります。1 つは想像のとおりサンプル濃縮と純粋さ、マルチ ステップ法より少ない蛋白質の損失より濃縮試料を affording 簡易分別のプロトコルの一般的なトレードオフがあります。
たとえば、簡易プロトコル (図 3 a) を使用した制御不溶性画分はマルチ ステップの手法で調製したものより疾患関連タンパク質のわずかに高いバック グラウンドのレベルを表わします。逆に、シングル ステップ分別手法は、損失が大幅に削減の全体的なサンプルとして低豊富な蛋白質のために有利にできます。たとえば、MCI の場合 sarkosyl 不溶性アポの相対的な強化は省略されたプロトコル (図 3A) 準備不溶性画分で有意に高値。
どちらのアプローチがより多数の疾患関連または病理学的変性蛋白質集合体の大幅な増加を観察する以上十分な豊富な分別とマルチ ステップの手法の洗浄手順が発生する掃除機具体的なプロテオーム署名。それにもかかわらず、我々 のデータ一貫性を検証シングル ステップ画法とタウ蛋白もつれ (Nft)、a β プラーク スクレイピー プリオン (PrSc) など病理学的集合体 sarkosyl、水溶性が調査結果を公表ネイティブで折られた相手が溶けるまま。5,6,7,8,10,11,23,26
分割コントロールの洗剤不溶性画分タンパク質の相対的な量を計算することによって (n = 3) と広告 (n = 3) 脳 (表 2) のみ 〜 総蛋白プールの 10% は sarkosyl 不溶性。ときに脳のホモジネート (TH 秒) の 5 mg 総蛋白質を分別すると、10.4% とプロテオームの 11.3% にパーティション分割コントロールと広告の場合、洗剤不溶性分画それぞれ。2 つのグループ間で有意な差は認められなかった AD 脳の濃縮 sarkosyl 不溶性タンパク質の総量はコントロールよりわずかに高いが、(p = の 0.703)。これはタンパク AD 脳では普及していないが、むしろ snRNPs タウ、a β と U1 のような蛋白質の狭い、特定のサブセットに制限を示します。7,21,22

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig1.jpg"> 
図 1: Sarkosyl 分別方式。(A) A 死後人間の脳は低 salt のバッファーは、その後 sarkosyl と塩化ナトリウムがそれぞれ最終濃度 1 %w/v の 0.5 M に追加され、氷で 15 分間インキュベートで均質化されました。超音波処理後、ホモジネートは sarkosyl 可溶性清 (S1) と sarkosyl 不溶性のペレット (P1) を affording 30 分 180,000 × gで遠心によって分画されました。(必要に応じて)、P1 ペレットは超遠心法最終 sarkosyl 不溶性のペレット (P2) を支払うことで、サーク バッファーと再堆積を洗浄しました。この P2 割合きれいな各プローブで 3 x 5 s 超音波処理に続いて、室温で 30 分間尿素バッファーで可溶化。(B) 蛋白質 (20 μ g) TH-S は、S1、S2 から (10 μ L) と P2 の分数は、SDS-PAGE、Coomassie 青い固定バッファー後室温で一晩 Coomassie ブリリアント ブルー G-250 染色バッファーと穏やかな染色で 15 分間固定によって解決されました。<a href="//ecsource.jove. href=""></a href="//ecsource.jove.>com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"ターゲット ="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig2.jpg"> 
図 2: AD 脳の洗剤の不溶性画分中のリン酸化タウの濃縮します。(AとB)タンパク質 (40 μ g) 合計 (TH 秒) の (S1) 水溶性と不溶性 (P2) 分数がスレオニン 231 (pT231) にリン酸化タウ抗体と消されたまたは AT8 (pSer202、pThr205) の病理学的リン酸化タウ種の濃縮を示すため、不溶性画分 (P2) AD 脳の。AD 脳の高分子量集計タウ洗剤不溶性 (P2) 分数にパーティションのみ。(C) EEA1 可溶性タンパク質マーカーと合計 (TH 秒) とコントロールと AD 脳可溶性 (S1) 分数の相対的な読み込み制御として提供しています。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig3.jpg"> 
図 3: シングル ステップまたはマルチ ステップの分別のプロトコルを用いた病理学的広告タンパク質のプロテオーム解析.代表的な sarkosyl 不溶性タンパク質アプリ (a β)、タウ、snRNP70 の相対的なレベル (U1-70 K) との間でさまざまな病気にアポ プール制御、MCI と広告の場合 (A) シングル ステップまたはマルチ ステップ (B) sarkosyl を使用して分別のアプローチ。両方のデータセットの蛋白質のレベルは、マッチ (Psm) これらの蛋白質を識別し、最大値を 100 に設定する正規化スペクトル ペプチドによって推定されました。広告、MCI コントロール ケースから Psm (n = 5各) セットを 1 つのデータセットに使用されました。複数のステップのアプローチは、コントロールの 2 つの複製プールから Psm MCI と広告の場合 (n = 5各) を行った。誤差範囲は、平均 ± S.E.M. の値を示す<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(RT で一晩の攪拌) ddH2O の 100 ml あたり10 %w/v sarkosyl ソリューション: 10 g N ラウリルサルコシン ナトリウム塩</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低ソルト (LS) バッファー: 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM ショ糖 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl (サーク) バッファー:LS バッファー + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 M の NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尿素のバッファー (-20 ° C で保存): 50 mM トリス塩酸 pH 8.5、8 M 尿素、2% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 X SDS 読み込みバッファー: 200 mM トリス塩酸 pH 6.8, 40% のグリセロール、8% ナトリウム ドデシル suflate (SDS)、0.4% ブロモフェノール ブルー (BPB)、および 20 mM TCEP pH 7.0 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie 固定バッファー: 40% メタノール、ddH2O 10% 酢酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie ブリリアント ブルー G-250 染色バッファー: 25% メタノール、酢酸 5%、0.1% coomassie G-250 を ddH2O の青</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie すすぐバッファー: 25% メタノール、ddH2O 5% 酢酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 バッファー X Tris 食塩水 (TBS): 50 mM トリス塩酸 pH 7.45、150 mM NaCl ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 バッファー X Tris は Tween 20 (TBS/T) と生理食塩水: 50 mM トリス塩酸 pH 7.45、150 mM NaCl 0.1% Tween 20 の ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X ブロック バッファー (BB): 50 mM トリス塩酸 pH 7.45、150 mM の NaCl、1% 独自のタンパク質 (材料のリストを参照)、750 mM メチルクロロイソチラソリノン ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 %1 X ブロック バッファー トゥイーン 20 (BB/T): 50 mM トリス塩酸 pH 7.45、150 mM の NaCl、1% 独自のタンパク質 (材料一覧参照)、0.05% Tween 20、ddH2O の 750 mM メチルクロロイソチラソリノン</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: バッファーのリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>サンプル</td>
			<td>ボリューム サンプル (μ L)</td>
			<td>濃度 (μ g/μ L)</td>
			<td>総蛋白 (μ g)</td>
			<td>平均総蛋白 (μ g) と S.E.M.</td>
			<td>TH-%s (5 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.89</td>
			<td>692.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 2</td>
			<td>70</td>
			<td>7.38</td>
			<td>516.6</td>
			<td>5187億 (±99.63)</td>
			<td>10.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl 3</td>
			<td>70</td>
			<td>4.96</td>
			<td>347.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>広告 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.77</td>
			<td>683.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>広告 2</td>
			<td>70</td>
			<td>6.67</td>
			<td>466.9</td>
			<td>567.0 (±63.20)</td>
			<td>11.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>広告 3</td>
			<td>70</td>
			<td>:7.86</td>
			<td>550.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: 蛋白質量 sarkosyl 不溶性画分 (P2).平均では、蛋白質の割合、分割コントロールの sarkosyl 不溶性分画 (n= 3) と広告 (n= 3) 脳され、10.4% 11.3%、それぞれ。によって証明されるようコントロールし、AD 脳から sarkosyl 不溶性蛋白質の量の有意差はなかった、学生のt-テスト (p = の 0.703) と (S.E.M.) の平均値の標準誤差。

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K ビュー.  Emory School of Medicine. ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。

ビデオ: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

生化学

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

糸状菌のタップタグ付きヒストンデアセチラーゼのシングルステップエンリッチメント酵素活性アッセイのためのカビnidulans

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...