Los autores agradecen a los Drs. Jim Lah y Allan Levey, Departamento de Neurología de Emory, para sugerencias y comentarios. Este trabajo fue financiado en parte por la Asociación de medicina acelerar concesión (U01AG046161-02), el Emory Alzheimer centro de investigación de la enfermedad (P50AG025688) y un Instituto Nacional del envejecimiento conceden (R01AG053960-01) a N.T.S. Esta investigación también fue apoyada en parte por el núcleo de la neuropatología de la donacion de Emory Neurociencia NINDS base instalaciones, P30NS055077.

declaración de ética: todos los tejidos del cerebro fueron obtenidos de la Emory de Alzheimer &#39; s enfermedad investigación centro (ADRC) Banco de cerebros. Tejidos humanos post mortem fueron adquiridos bajo adecuados protocolos de la Junta de revisión institucional (IRB).
 1. homogeneización y fraccionamiento <ol><li>selección de tejido Nota: congelados de tejido post mortem corteza frontal de control sano (Ctl) y patológico casos confirmados de AD fueron seleccionados de la Emory Banco de cerebros ADRC (n = 2). Evaluación neuropathological post mortem de la distribución de la placa amiloide fue realizada según el consorcio establecer un registro de Alzheimer &#39; s enfermedad semicuantitativo de puntuación criterios 24, aunque patología neurofibrilares fue evaluado de acuerdo con el sistema de estadiaje de Braak. 16 <ol><li>obtener congelados de tejido cerebral post mortem de control sano (Ctl) y patológico confirmó casos de AD. Utilizando contenedores de hielo seco, pinzas y una navaja, suprimir ~ porciones de 250 mg de materia gris de cada muestra de tejido en desechables previamente tarado pesan barcos, teniendo cuidado de evitar que el tejido descongelado. Registrar el peso de cada pieza a ser homogeneizado.</li>
		<li>Impuesto especial ~ 250 mg de materia gris usando pinzas y navajas por inspeccionar visualmente para localizar la interfaz entre el exterior materia gris y materia blanca interior. Evitar que la materia blanca y lo más importante, cualquier vasos sanguíneos o regiones sangrientas, meninges o aracnoides. Mantener el tejido congelado durante el proceso de corte trabajando rápidamente y con frecuencia colocando peso barco con tejido cerebral en contenedores de poliestireno con hielo seco</li>
		<li>Registrar el peso exacto de la materia gris de cada pieza congelada utilizando una balanza analítica. Calcular el volumen de tampón bajo en sal (LS) (ver tabla 1) necesarios para la homogeneización de dounce (5 mL/g o 20% w/v).</li>
		<li>Preparar 10 mL LS de tampón 1 x inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel y frialdad de hielo.</li>
		<li>Eliminar el tejido pesado y pesaje del barco de hielo seco y dados en trozos de aproximadamente 2 x 2 mm como deshiela. Transfiéralo a un tubo de homogeneizador de 2 mL dounce previamente enfriado en hielo.</li>
		<li>Añadir 5 mL/g (20% w/v) de tampón de helado bajo en sal (LS) con 1 X inhibidor de la proteasa y fosfatasa cóctel.</li>
		<li>Homogeneizar el tejido de cerebro en hielo, mediante aproximadamente 10 movimientos de separación alta Maja A y 15 golpes de mortero de baja holgura B.</li>
		<li>Transferencia de homogeneizado de todos a un tubo de polipropileno de 2 mL con un pipeta Pasteur de vidrio. Etiquetar el tubo con &#8220; TH &#8221; (homogenado Total), el tejido del caso número y volumen de homogenado. alícuota 0,8 mL en un tubo de 1,5 mL etiquetado. Cualquier exceso homogeneizado puede ser semejantemente alícuotas y almacenados a -80 ° C.</li>
		<li>a cada 0,8 mL de alícuota, añada 100 μl de 5 M NaCl y sarkosyl 10% (p/v) a concentraciones de 0,5 y 1% w/v, respectivamente. Tubos de mezclar bien por inversión e incubar en hielo por 15 minutos los tubos etiqueta con &#34; TH-S &#34; (homogeneizado Total-Sarkosyl) para indicar que los homogenados en sarkosyl-buffer (tabla 1).</li>
		<li>Someter a ultrasonidos cada tubo de impulsos tres 5 s en amplitud de 30% en el hielo (intensidad máxima = 40%) utilizando una sonda de microtip.</li> <li>determinar las concentraciones de proteína de los homogenados del ácido bicinchoninic (BCA) ensayo 25 método. 
		Nota: La concentración promedio de proteína de TH S homogenados preparados en LS de 5 mL por gramo de tejido es 15-20 mg/mL. Los homogenados pueden ser fraccionada inmediatamente o almacenadas a-80 ° C hasta su uso.</li>
		<li>TH-S diluir homogenados a 10 mg/mL con buffer de sark helada (tabla 1) 1 x inhibidores de la proteasa y fosfatasa.</li>
		Proteína de <li>transferencia 5 mg (0,5 mL) de cada homogenado TH S en 500 μl policarbonato ultracentrífuga tubos y par-equilibrio con tampón de sark. Cargar tubos en un rotor previamente enfriada y ultracentrífuga a 180.000 x g durante 30 min en sobrenadantes de transferencia sarkosyl-soluble 4 ° C. (S1) para tubos de 1,5 mL y guardar a -80 ° C. 
		Nota: (Lavado opcional) Añadir 200 μL de tampón de sark en la ultracentrífuga tubos que contienen las fracciones insolubles en detergente (P1) y desalojar los pellets (P1) de la parte inferior de los tubos de la ultracentrífuga utilizando una pipeta de 200 μl.</li>
		Tubos de <li>brevemente pulso spin la invertida para 2-3 s (&#8804; 2.500 x g) en una microcentrífuga para transferir el pellets (P1) y buffer a los tubos de 1,5 mL a continuación. Resuspender los gránulos insolubles (P1) en el búfer de sark transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de la pelotilla se interrumpe.</li>
		<li>El equilibrio de par y centrifugar a 180.000 x g durante un adicional 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descarte el sobrenadante del lavado opcional (S2) e incubar los pellets sarkosyl insoluble (P2) en 50-75 μl de tampón de urea (cuadro 1) con 1 x PIC (inhibidor de proteasa y fosfatasa cóctel) durante 30 min a temperatura ambiente para solubilizar el pellets de. 
		Nota: Urea caliente la memoria intermedia a la temperatura ambiente antes de su uso para evitar la precipitación de la SDS. Para aplicaciones sensibles al detergente, omitir SDS desde el búfer de urea y considerar lavado el precipitado insoluble (P2) en tampón salino bajo antes de resuspender en tampón urea.</li>
		<li>Transferir las pelotillas resuspendidas (P2) a tubos de 0.5 mL y uso breve (1 s) microtip sonicación en 20% de amplitud (intensidad máxima = 40%) para solubilizar completamente las pelotillas.</li>
		<li>Determinar las concentraciones de proteína del sarkosyl-soluble (S1) y - insolubles fracciones (P2) con el BCA método de ensayo. Utilice estas fracciones inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta su uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western blotting Nota: borrar occidental fue realizado según los procedimientos previamente divulgados con leves modificaciones. 5 , 10 <ol><li>preparar 40 μg muestras de homogenados total (TH-S), soluble en sark (S1) y fracciones de sark-insoluble (P2) en el tampón de muestra Laemmli SDS-page de X 1 con pH de 5 mM TCEP 7. Incubar las muestras a 95 ° C por 5 min</li>
		<li>Carga de muestras en un prefabricado 10-pozo 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese 80 V para el primer centímetro (10 min) y 120 V para el resto (60 min) o hasta que el tinte de seguimiento alcance la parte inferior del gel.</li>
		<li>Utilizar una nueva hoja de afeitar y un cuchillo de gel para split-abrir el cartucho de gel prefabricado. Con cuidado corte el peines y parte inferior del gel con una cuchilla de afeitar nueva.</li>
		<li>Volver a suspender los pellets insolubles (P1) en 200 μL de tampón de sark con 1 x PIC mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
		<li>Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0.2 μm utilizando un método de transferencia en seco en una máquina de Blot (ver la tabla de materiales).</li>
		<li>Bloquear la membrana en solución amortiguadora de bloqueo (BB) sin Tween 20 durante 30 min, seguida con BB con 0,05% Tween 20 (BB/T) para 30 minutos. Después de bloquear, enjuagar la membrana en TBS/T (0,1% Tween 20) por 5 min eliminar el exceso de tampón bloqueo.</li>
		1:1,000 de <li>preparar diluciones de los anticuerpos primarios pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 y EEA1 en BB/T (0,05% Tween 20).</li>
		<li>Incubar las membranas en solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con agitación circular. Enjuagar la membrana en TBS/T 3 x 15 min</li>
		Anticuerpo secundario cercano-IR de <li>punta de prueba de la membrana con una dilución de 1: 20.000 de la marcada con fluorescencia, en BB/T durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad en coctelera. Enjuagar la membrana para 3 x 10 min en TBS/T y 2 x 5 minutos en TBS.</li>
		<li>Analizar la membrana usando un infrarrojo sistema de la longitud de onda de excitación apropiada (por ejemplo 700 nm (canal rojo) para tinte infrarrojo 680 cabra anti-mouse IgG (H+L) secundaria y 800 nm (canal verde) para tinte infrarrojo 790 burro anti-rabbit IgG (H+L de imagen secundaria)).</li>
		<li>Uso del software de proyección de imagen para cuantificar la intensidades de la señal y realizar mediciones de densitometría según el fabricante &#39; instrucciones, asegurando el ajuste de auto-fondo se establece en promedio el fondo entero.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

En este documento presentamos y discutir un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento de solo paso que es aplicable a una amplia variedad de aplicaciones experimentales que van desde análisis de proteómica basada en espectrometría de masa al mal plegamiento de análisis funcional de la proteína y western blot. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodología es más eficaz cuando se utiliza para el estudio de proteinopatías neurodegenerativas como el Alzheimer, ALS, la enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y los diferentes tauopatías. Comparado con el protocolo original de fraccionamiento secuencial de cinco fases, este procedimiento solo paso puede completarse en un solo día y ofrece resultados muy similares. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Un aspecto importante de este protocolo es el uso de sarkosyl como el detergente de fraccionamiento. En contraste con otros detergentes como Tritón X-100 o sodio dodecil sulfato (SDS), sarkosyl parece ser muy adecuado para esta tarea; en cuanto a rigor y fuerza de solubilización, es suficiente para solubilizar la mayoría de las proteínas de forma nativa plegadas preservando la insolubilidad del detergente, la estructura y la función de agregados de proteínas relevantes a la enfermedad que son inherentemente sensible a la SDS. 5 , 9 además, a diferencia de la SDS, sarkosyl permanece soluble a bajas temperaturas y en condiciones de alta sal.
Otra característica clave de este protocolo es la resuspensión de los gránulos de (P1) insoluble en sarkosyl primera tras la primera de ultracentrifugación. Este paso de lavado permite la granza inicial (P1) para extraer y lavar completamente de cualquier residual contaminante de Cruz homogeneizado total o soluble proteínas, con una fracción de proteína insoluble en detergente puro y bien definido. Sin el paso de resuspensión y lavado del pellet opcional (P1), proteínas solubles residuales pueden ser llevado a más en la fracción insoluble en detergente, confundiendo posiblemente los resultados posteriores y experimentos (es decir, análisis de inmunotransferencia o proteómica).
El carácter insoluble y de alto peso molecular de proteínas mal plegadas patológicos agregados (es decir, tau, fosfo-tau y especies Aβ) presente desafíos hacia su aislamiento y análisis a través de las técnicas bioquímicas tradicionales. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 a diferencia de las proteínas solubles, insolubles en agregados como amiloides (Aβ) e hiperfosforilada tau los enredos neurofibrillary (NFTs) no pueden ser fácilmente purificada de tejido post mortem por métodos tradicionales tales como inmunoprecipitación o rápido cromatografía líquida de la proteína (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 por lo tanto, el protocolo abreviado sarkosyl-fraccionamiento es una de las técnicas únicas que permite el fácil enriquecimiento y aislamiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro post mortem en un relativamente corto plazo. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Mientras que pasos adicionales pueden ser empleados para aislar una muestra pura, homogénea de proteínas agregadas, el protocolo de fraccionamiento sarkosyl permite el fácil enriquecimiento de agregados de proteína insoluble en detergente con comparativamente poco compromiso de tiempo. 5 , 6 en apoyo de esta hipótesis, estudios proteómicos del proteoma sarkosyl-insoluble confirman que la gran mayoría de las proteínas conocidas de propensas a la agregación patológicas de la partición en el sarkosyl insoluble en fracción ambos tradicionales multi-step 6 , 11 , 21 así como nuestro enfoque novedoso fraccionamiento solo paso. 5 , 7 , 9 , 10

Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de prión estrechamente relacionados son proteinopatías caracterizada por la acumulación gradual de agregados de proteína insoluble en detergente en el cerebro con el acompañamiento cognitivo disminución. 1 , 2 esta característica patológica común se cree que desempeñan un papel central en la etiología y la patofisiología de estas enfermedades neurodegenerativas. 2 estos agregados consisten en típicamente poliméricas fibras amiloides, que se componen de unidades de proteínas mal plegadas que Cruz β-estructura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquímico, agregados amiloides son altamente resistentes a la desnaturalización térmica o química y solubilización,3 que presenta retos únicos para su purificación, análisis y estudian por medio de técnicas bioquímicas tradicionales. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , la fracción de proteína insoluble en detergente ha sido el foco de mucha investigación en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas que implica la acumulación de proteínas mal plegadas. 6 , 12 , 13 , 14
Técnicas de fraccionamiento bioquímico a menudo han sido utilizadas para enriquecer la fracción insoluble en detergente de homogenados de cerebro post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno de los métodos más comunes consiste en la extracción secuencial de homogenados de tejido con tampones y detergentes de aumentar rigor, seguido por ultracentrifugación para dividir las fracciones solubles e insolubles. Un protocolo comúnmente usado fraccionamiento secuencial6,14 implica la homogeneización de las muestras de tejido congelado en un tampón libre de detergente bajo en sal (LS) y los pellets insolubles resultantes entonces son extraídos secuencialmente con buffers que contengan alta sal, detergentes no iónicos, alta sacarosa, detergentes iónicos y finalmente chaotropes como urea. 6 , 14 un inconveniente obvio de tales protocolos de fraccionamiento secuencial es el substancial del tiempo y el compromiso de la mano de obra necesaria para completarlos. Homogeneización y ultracentrifugación, un protocolo típico fraccionamiento de cinco pasos puede tomar varias horas o incluso días. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 además, tantos agregados de proteína patológica permanecen insolubles en casi todos las más duras condiciones19,20 la mayoría de las fracciones generadas son de valor limitado. Así, los pasos de fraccionamiento menos-rigurosos utilizando altas concentraciones de sal y detergentes no iónicos son en gran medida redundantes.
Estudios previos han demostrado que el detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) es un excelente candidato para un protocolo simplificado solo paso detergente fraccionamiento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como un desnaturalización detergente sarkosyl es lo suficientemente estricta como para solubilizar la gran mayoría de proteínas de forma nativa plegadas en cerebro sin solubilización agregados de proteínas mal plegadas compuestos de beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43),14 alfa-sinucleína,12,13 tembladera,23 o U1 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs U1) como U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl es menos estricto que el dodecil sulfato de sodio detergente aniónico ubicua (SDS), conserva formas oligoméricas menos robustas de agregados de proteínas mal plegadas que no pueden soportar el tratamiento de la SDS. 9
Anteriormente, hemos descrito un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento que logra resultados comparables a la metodología de fraccionamiento secuencial más laboriosa. 5 por omitir las medidas menos estrictas de fraccionamiento, hemos sido capaces de desarrollar un protocolo de fácil fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. 5 este protocolo detallado descrito en este documento es adecuado para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde el Western Blot y análisis de proteómica basada en espectrometría de masa mal plegamiento de proteínas funcionales y siembra de agregación. 5 , 6 , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

En este estudio, se describe un protocolo abreviado fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. El detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) efectivamente solubiliza proteínas forma nativa plegadas en el tejido cerebral que permite el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de una amplia gama de proteinopatías neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades priónicas. Control humano y los tejidos del cerebro post mortem AD fueron homogeneizadas y sedimentados por ultracentrifugación en presencia sarkosyl enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente incluyendo patológica tau fosforilada, el componente principal de ovillos enredos en AD. Western Blot demostró la solubilidad diferencial de agregados tau fosforilado y la proteína soluble en detergente, temprano Endosome antígeno 1 (EEA1) en control y el cerebro de AD. Análisis proteómico también revelaron enriquecimiento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) y apolipoproteína E (APOE) en las fracciones insolubles en sarkosyl de AD cerebral comparados con los de control, consistente con anteriores estrategias de fraccionamiento de tejido . Así, este Protocolo simple enriquecimiento es ideal para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde borrar occidental y funcional de la proteína ensayos de agregación Co proteómica basada en espectrometría de masa.

El protocolo abreviado solo paso sarkosyl-fraccionamiento fue utilizado para enriquecer a agregados de proteína insoluble en detergente de control y cerebro post mortem AD (figura 1). Proteínas de fracciones TH S, S1, S2 y P2 fueron resueltas por SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie. El paso de resuspensión es opcional puesto que había niveles indetectables de proteína en la fracción S2 (véase 1.1.14). Análisis de Western blot (figura 2A y B) demuestra claramente que en cerebro de AD, los agregados patológicos tau fosforilada de alto peso molecular son insolubles en sarkosyl, y muy poco pTau permaneció en el fracciones solubles en Sarkosyl. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 por el contrario, la mayoría de pTau en cerebro de control repartido en la fracción soluble en sarkosyl. 5 , 6 , 10 en cambio, EEA1 principalmente las particiones en la fracción S1 en control y cerebro de AD (figura 2). Aquí, EEA1 actúa como un marcador general para proteínas más nativos, no patológicas que son inherentemente sarkosyl-soluble5. En particular, es un poco menos señal para EEA1 en la fracción soluble (S1) en comparación con la fracción de TH-S, que indica que un grupo menor de EEA1 es probable sarkosyl-insoluble, sin embargo por debajo del límite de detección por western blot con este anticuerpo particular. Es igualmente posible que la leve disminución en la intensidad de la señal de EEA1 en la fracción soluble (S1) es debido a la Unión inespecífica de EEA1 a los tubos de la ultracentrífuga también podría explicar la leve desviación de los resultados esperados.
Para comparar la eficacia del protocolo abreviado fraccionamiento solo paso (Figura 3A) contra la tradicional metodología de fraccionamiento secuencial de pasos múltiples (figura 3B), los niveles relativos de sarkosyl-insoluble proteína precursora de amiloide (APP), tau (MAPT), ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 - 70K (snRNP70) y la apolipoproteína E (APOE) se compararon por etiqueta-libre espectrometría de masas (MS) basado en proteómica a través de los control (Ctl), deterioro cognitivo leve (DCL) y AD casos de anteriores estudios7,18 (figura 3). Medidas de aplicación detergente-insolubles efectivamente representa el péptido Aβ, como los péptidos APP completamente trípticos cuantificado trazado a la región de Aß de la longitud total 695 residuos APP proteína7. Con ambos métodos, los niveles de sarkosyl insoluble de las cuatro proteínas patológicas marcado una tendencia hacia arriba en casos de MCI y anuncios en relación con los controles, consistentes con la fuerte correlación del deterioro cognitivo y la carga patológica. En general, enriquecimiento de estas proteínas en las fracciones insolubles en detergente (P2) fueron notablemente coherentes solo paso18 y el de fraccionamiento de pasos múltiples protocolos7.
Sin embargo, hay ligeras diferencias entre las dos metodologías que pueden resultar ventajosas o perjudiciales dependiendo de la naturaleza exacta y los objetivos de un experimento individual. La información proteómica comparativa resumida en la figura 3 puede informar a que el protocolo a utilizar dependiendo de los parámetros experimentales específicos y aplicaciones. Como es de esperar, hay un equilibrio general entre el enriquecimiento de la muestra y la pureza, con el protocolo de fraccionamiento simplificado con más enriquecida las muestras con menos pérdida de proteína que el método de paso múltiples.
Por ejemplo, fracciones insolubles de control preparados usando el protocolo simplificado (Figura 3A) exhiben niveles de fondo ligeramente superiores de proteínas relevantes a la enfermedad que los preparados vía el acercamiento multi-step. Por el contrario, la técnica de fraccionamiento de solo paso puede ser ventajosa para las proteínas de baja abundancia como la muestra global, las pérdidas se reducen considerablemente. Por ejemplo, el enriquecimiento relativo de APOE sarkosyl-insoluble en los casos MCI es significativamente mayor en las fracciones insolubles preparadas mediante el protocolo abreviado (figura 3A).
Aunque ambos enfoques son más que suficiente para observar cualquier incremento significativo en agregados de proteínas mal plegadas enfermedad relevante o patológica, la más numerosa y amplia fraccionamiento y pasos de lavado del enfoque multi-step pueden generar un limpiador y firma de proteómica más específica. Sin embargo, nuestros datos verificar que el método de fraccionamiento de solo paso es consistente con los resultados publicados que agregados patológicos como los enredos de neurofibrillary tau (NFTs), placas de Aß y priones de scrapie (PrSc) son insolubles en sarkosyl, mientras que sus homólogos de forma nativa plegadas permanecen solubles. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Mediante el cálculo de las cantidades relativas de proteína que en las fracciones insolubles en detergente de control (n = 3) y AD (n = 3) cerebro (tabla 2), solamente ~ 10% de la piscina de la proteína total es insoluble en sarkosyl. Cuando 5 mg de proteína total de homogeneizado de cerebro (TH-S) es fraccionado, 10.4% y 11,3% del proteoma particiona en la fracción insoluble en detergente en control y AD, respectivamente. Aunque la cantidad total de proteína insoluble en sarkosyl enriquecida en el cerebro de AD es ligeramente superior de control, diferencias significativas no se observaron entre los dos grupos (p = 0.703). Esto indica que mal plegamiento de proteínas y la agregación no es generalizadas en el cerebro de AD, pero más bien se limita a un subconjunto estrecho y específico de proteínas como el tau, Aβ y U1 snRNPs. 7 , 21 , 22

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig1.jpg"> 
Figura 1: esquema de fraccionamiento Sarkosyl. (A) A cerebro humano postmortem se homogeneizó en tampón salino bajo, después de lo cual sarkosyl y NaCl se agregó a concentraciones finales de 1% w/v y 0.5 M, respectivamente y se incubaron durante 15 min en hielo. Después de la sonicación, los homogenados fueron fraccionados por ultracentrifugación a 180.000 x g durante 30 min con el sobrenadante sarkosyl-soluble (S1) y el sedimento insoluble en sarkosyl (P1). La pelotilla de P1 (opcionalmente) se lavó con tampón de sark y re-sedimentados por ultracentrifugación a permitirse el final precipitado insoluble en sarkosyl (P2). Esta fracción de la P2 fue solubilizada en tampón de urea durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de sonicación de s de 3 x 5 con una sonda limpia micropunta. (B) proteínas (20 μg) de TH-S, S1, S2 (10 μl) y fracciones de P2 se resolvieron mediante SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción azul brillante de Coomassie G-250 durante la noche a temperatura ambiente.<a href="//ecsource.jove. href=""></a href="//ecsource.jove.>com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"target ="_blank"&gt; haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig2.jpg"> 
Figura 2: enriquecimiento de tau fosforilada en la fracción insoluble detergente del cerebro AD. (A y B) Proteína (40 μg) del total (TH-S), (S1) solubles y las insolubles (P2) fracciones fueron borrados con un anticuerpo contra tau fosforilada en la treonina 231 (pT231) o AT8 (pSer202, pThr205) para demostrar el enriquecimiento de especies de fosfo-tau patológica en la fracción insoluble (P2) del cerebro de AD. En cerebro de AD, alto peso molecular agregado tau exclusivamente particiones en la fracción de (P2) insoluble en el detergente. (C) EEA1 sirve como un marcador de proteína soluble y control de la carga relativa para el total (TH-S) y soluble (S1) fracciones de cerebro AD y control. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig3.jpg"> 
Figura 3: análisis proteómico de patológicas proteínas AD utilizando un protocolo de fraccionamiento single-step o multipasos. Niveles relativos de las representativas sarkosyl insoluble proteínas APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) y APOE en diversas enfermedades entre control, casos de MCI y AD con el solo paso (A) o sarkosyl multi-step (B) método de fraccionamiento. Para ambos conjuntos de datos, nivel de la proteína se estima por péptido espectral partidos (PSMs) de estos identificaron proteínas y normalizaron para establecer el máximo a 100. PSMs de casos Control, MCI y AD (n = 5 cada) fueron utilizados para el conjunto de datos de grupo. Para el abordaje de múltiples paso, PSMs de piscinas replicadas dos de control, casos de MCI y AD (n = 5 cada) fueron analizados. Barras de error indican los valores de media ± SEM <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55835/55835fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% w/v sarkosyl solución: sal de sodio 10 g N-lauril sarcosina por 100 ml de ddH2O (agitación a temperatura ambiente durante la noche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baja sal (LS) de tampón: 50 mM HEPES, pH 7.0, sacarosa 250 mM, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Sarkosyl (sark): Buffer de LS + 1% (p/v) sarkosyl 0,5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea de tampón (conservar a -20 ° C): 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, urea de 8 M, SDS 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 carga X SDS de tampón: 200 mM Tris-HCl pH 6.8, glicerol al 40%, 8% suflate de dodecyl de sodio (SDS), 0.4% azul de bromofenol (BPB) y 20 mM TCEP pH 7.0 ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solución fijadora de Coomassie: 40% metanol, ácido acético al 10% en ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie: 25% metanol, ácido acético al 5%, 0.1% coomassie blue G-250 en Dec2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie desmanchar tampón: 25% metanol, ácido acético al 5% en ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-HCl de 1 X Tris tamponada salino (TBS): pH 7,45, 150 mM NaCl en ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-HCl de 1 X Tris tamponada con solución salina con Tween 20 (TBS/T): pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 ddH en2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X bloqueo de tampón (BB): 50 mM Tris-HCl, pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% proteína patentada (véase lista de materiales), 750 mM Methylchloroisothiazolinone en ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Tampón X bloqueo con 0,05% Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl de pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% proteína patentada (véase lista de materiales), 0,05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone en ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Lista de Buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Muestra</td>
			<td>Volumen de muestra (μL)</td>
			<td>Concentración (μg/μl)</td>
			<td>Proteína total (μg)</td>
			<td>Promedio de proteína Total (μg) y SEM</td>
			<td>% TH-S (5 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 CTL</td>
			<td>70</td>
			<td>9.89</td>
			<td>692.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 CTL</td>
			<td>70</td>
			<td>7.38</td>
			<td>516.6</td>
			<td>518.7 (±99.63)</td>
			<td>10.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 CTL</td>
			<td>70</td>
			<td>4.96</td>
			<td>347.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.77</td>
			<td>683.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD 2</td>
			<td>70</td>
			<td>6.67</td>
			<td>466.9</td>
			<td>567.0 (±63.20)</td>
			<td>11.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANUNCIO 3</td>
			<td>70</td>
			<td>7.86</td>
			<td>550.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Cantidad de proteína en las fracciones insolubles en sarkosyl (P2). En promedio, el porcentaje de proteína que particiona en la fracción insoluble en sarkosyl de control (n= 3) y AD (n= 3) cerebral fue de 10,4% y 11.3%, respectivamente. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa de la cantidad de proteínas insolubles en sarkosyl de control y cerebro del anuncio, según lo evidenciado por el por de student t-test (p = 0.703) y error estándar de los valores de la media (SEM).

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K vistas.  Emory School of Medicine. Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Video: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Investigación

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Enriquecimiento en un solo paso de una histona deacetilasa con etiqueta TAP del hongo filamentoso Aspergillus nidulans para la prueba de actividad enzimática

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...