우리는 우수한 기술 지원에 대한 자신의 귀중한 MS 계측에 대한 조언, 지원 및 액세스뿐만 아니라 미스 켈리 R. Molloy의에 대한 교수 브라이언 T. Chait 감사합니다. 우리는 복사 편집에 지원 씨 켈리 맨 손으로 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 P41GM109824, P41GM103314 및 P50GM107632에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 세포 수확 및 냉동 <ol><li> 관심 25,26의 세포주에 대한 적절한 배양 조건을 이용하여 셀 재 1-8 g의 성장. 이 프로토콜은 참조 19,27,28에서 수정 된 세포의 최대 8g (~ 10 9 세포)에 최적화되어 있습니다. 일반적 ~ HEK-293 세포 인 HeLa 또는 5g을 성장 여덟 500cm이 배양 접시에 90 % ~ 포화 상태에서 얻을 수있다. 주의 :이 프로토콜은 심한 저온 화상을 일으킬 수있는 액체 질소 (LN 2)를 사용합니다. 돈 보호 복 및 운동 적절한 취급주의 사항. </li><li> 큰 비커에 성장 매체 (폐기물)를 붓고. </li><li> 큰 사각형 얼음 팬에 얼음에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 배양 접시에 빙냉 1X 인산염 완충액 (PBS) 20 ㎖를 첨가하고 대형 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시로부터 세포를 분리; 50 ㎖의 튜브에 세포를 옮겨 예비 냉각 얼음; 얼음에 튜브를 개최합니다. 노트모든 셀에 대한 처리 단계는 전송 조작 동안 세포의 과도한 전단을 방지하기 위해 전기 피펫 세트에 &quot;낮은&quot;25 ml를 피펫을 사용합니다. 50 ㎖ 수집 관을 마련하고 이전 절차를 시작하기에 얼음 양동이에 PBS를 1 배. </li><li> 같은 접시에 얼음처럼 차가운 1X PBS의 추가 10 ML을 추가합니다. 나머지 세포를 수집하고 50 ML 튜브로 전송. </li><li> 각각의 요리에 대해 반복; 다른 요리에서 세포 현탁액 시료 번호 플라스틱 폐기물을 감소하기 위해 결합 될 수있다. 주 : 세포 자체 현탁액 용적의 상당 부분을 구성하지 않으므로, 세포 현탁액 상당 3 개의 판은 두 개의 50 ㎖ 튜브에 결합 될 수있다. 50 ㎖ 튜브가 실제로 공칭 볼륨 이상을 보유하기 때문에, 팔 판은 일반적으로 다섯 같은 튜브에 분산 될 수있다. </li><li> 1000 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 10 ml의 얼음처럼 차가운 1X PBS의 각 펠렛을 재현 탁. resu 통합spended 펠릿 당 5 내지 50 ㎖의 튜브에 최대 샘플 수를 감소시킨다. </li><li> 1000 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 10 mL의 빙냉 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁 </li><li> 20 ML의 주사기에서 플런저를 제거하고 따로 보관 해 둡니다. 주사기의 노즐 캡과에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 1000 XG, 4 ° C에서 50 ML 튜브와 원심 분리기 5 분 안에 주사기를 놓습니다. </li><li> 세포의 바로 상위 계층까지 진공 트랩 시스템에 부착 된 미세 팁 피펫으로 뜨는을 대기음 최대 흡입하기 시작합니다. 이 젖은 세포 펠렛을 초래한다. </li><li> , 주사기를 덮개를 벗기다 플런저를 삽입하고 스티로폼 상자에 LN 2 조에서 개최 LN이 가득 큰 플라스틱 비이커에 직접 세포를 물방울. 강제로 주사기에 남아있는 세포를 뛰어. </li><li> 부어 50 ㎖ 튜브에 고정 된 세포를 전송합니다. 느슨하게 초과 LN이 증발 할 수 있도록 튜브 캡; t 개최-80 ° C에서 밑단 하룻밤. 다음 날 완전히 캡을 조입니다. 냉동 세포 cryomilling까지 -80 ° C에서 이러한 방식으로 저장 될 수있다. 참고 : 단단히 그렇지 않으면 과도한 압력이 튜브가 폭발 할 수는 LN (2)가 눈에 띄게 증발 모든 전에 튜브를 닫지 마십시오. LN이 과다한 물 중량을 추가하여 셀 재료의 서리의 축적을 초래할 수 소산 효과적으로 분쇄시의 단백질 농도를 저감 한 후 튜브를 폐쇄 없음. </li></ol> 냉동 세포의 2. 극저온 혼란 참고 : 밀링 및 조작에 대한 모든 도구 LN 2 미리 냉각되어야한다. 작은 디캔터는 단지 내에서 LN 2를 추가하고 폐쇄 밀링 항아리의 맨 위에 LN이 쏟아져을 위해 필요합니다. 수 제 공구 기준 19에 도시된다. 극저온 장갑은 LN이 밀링 장치를 냉각 처리하기 위해 필요하다. 밀링여기에 사용 된 항아리 뚜껑은 일반적으로 설치된 고무 가스켓와 함께 제공 (재료의 표 참조) 이는 확실하게 다음의 프로토콜을 수행하기 위해 시판되는 테플론 뚜껑 개스킷으로 대체 될 필요가있을 것이다. 가스 N 2의 압력이 밀링 동안 단지 내에서 높은 수준으로 구축 할 수 있기 때문에 또한, 우리는 안전 분리주의 사항 (28) 등 시중에서 판매하는 5 바 / 500 kPa의 압력 밸브를 설치하는 것이 좋습니다. <ol><li> -80 ° C 저장 영역에서 셀 비즈를 제거하고, LN 2 조에서 50 ML 튜브 홀더에 개최합니다. </li><li> LN이 포함 된 깨끗한 사각 얼음 양동이에 50 ml의 항아리, 두 개의 20mm 공, 뚜껑을 사전 냉각. 하나를 사용하면 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 절연체를 미리 냉각; 퍽 하나의 세트 (27 항목 참조), 또는 슬리브와 퍽 (도 2 참조). 사전 냉각이 완료되면 LN 2 평온의 폭력 끓는. </li><li> 온 설정 적절한 평형밀. 주 :이 병, 병 뚜껑의 중량과 동일 할 것이며, 밀링 볼을 사용하고, 셀의 양은 병에 첨가한다. 어떤 PTFE 절연체를 사용하는 경우, 이들 물질도 포함한다. 우리는 항아리 뚜껑의 질량을 기록하고, 사전에 (사용되는 절연체를 포함하여 그들의 결합 질량)와 공장 근처에 저장된 정보를 시트에 기록 공 좋습니다. </li><li> 집게를 사용하여 미리 냉각 밀링 항아리 내부에 두 개의 사전 냉각 20mm 밀링 공 및 냉동 세포를 배치합니다. 참고 : 인해 밀링 동안 항아리와 공 표면에 재료의 작은 손실, 증가 분쇄 세포의 질량으로 회수 된 물질 증가의 비율입니다. 한 방법으로, 소재 손실 ~ 0.3 g 습윤 세포 중량 (WCW)의 순서 인 매우 완만하다. 제조 업체의 가이드 라인은 샘플의 최대 볼륨은 단지 볼륨의 ~ 1 / 3의해야로드를 나타냅니다. 공 (29)의 총 부피는 ~ 1 / 3의 R 및되어야emaining ~ 1 / 3의 여유 공간은 공의 자유로운 이동을위한 것입니다. </li><li> ~ ½ 전체에 항아리 최대 LN이 추가 항아리에 뚜껑을 배치하고 공장에 조립을 전송합니다. 참고 : 하나를 사용하는 경우 먼저 선택 절연체를 설치합니다. </li><li> 역 회전 각 분, 아니 간격으로 휴식을, 400 rpm으로, 3 분 : 장소에 어셈블리를 고정하고 다음 프로그램을 사용하여 밀링의 3주기를 수행합니다. 각주기 사이에 LN 2 밀링 항아리 쿨. 참고 : 공 행성 운동의 단지 내 충돌로 별개의 clunking 소음이 발생 밀링 동안. 이 소리를 듣고하지 않는 경우, 밀링은 발생되지 않습니다. 항아리의 내용을,이주기를 계산 다시 LN 2 단지 어셈블리를 이동하고 검사하지 않는, 밀링 사이클을 종료합니다. 형성하고 더 얼음을 확인하지 않고이있는 경우, 미리 냉각 주걱으로 멀리 항아리 벽에서 그것을 칩. 단계 2.5에서 다시 시작합니다. 더 절연체 또는 절연체 퍽을 사용하지 않는 경우, 다시 항아리 어셈블리를 이동 LN <s주기 사이 UB&gt;이 멋진-다시 풀 때마다 ½ ~에 LN (2)를 추가 할 수 있습니다. LN 2 밀링 동안 항아리의 온도가 증가로 단지 내에서 증발했다. 이 용기 내 압력 빌드 업을 초래한다. 밀에서 jar를 해제 할 때 따라서, 매우 느리게 클램프를 놓습니다. 클램프 급속 해제되면, 휴대 분말 급속한 감압 탈출 할 수있다. 클램프의 느린 방출은 부드러운 제어 방식으로 항아리에서 탈출하는 압력을 허용하고, 전지 재료의 손실을 방지 할 수 있습니다. 이것은 정상입니다 - 가스 N 2의 부드러운 탈출은 종종 클램프가 천천히 방출로 치찰음들을 수 있습니다. 슬리브 앤 퍽 절연체를 사용하는 경우, 용기의 조립이 공장에서 왼쪽 LN 2 시츄 절연체 / 항아리 어셈블리에 추가 될 수있다. </li><li> 다시 LN 2 항아리를 이동하고 냉각 잠시 휴식을 할 수 있습니다. 슬리브 앤 퍽 절연체를 사용하는 경우, 용기는 슬리브 w로부터 제거 될 수있다양쪽에 영향력을 제공하는 두 개의 주걱의 도움, i 번째. 병은 LN이 쉬고되면 신중 집게를 사용하여 공을 제거 뚜껑을 제거하고 미리 냉각 주걱을 사용하여 미리 냉각 된 50 ㎖ 튜브 분말 옮긴다. 오픈 항아리 / 분말에 약간의 LN (2)를 추가하면 그들을 제거하기 전에, 볼에 굳되는 분말을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주 : 용기가 개방되면, 볼을 분리하기 전에 그것을 LN이 소량의 추가. 이것은 표면 상에 굳어 분말을 회수하는 것을 도울 것이다. 휴대 분말은 -80 ° C 이하에서 사용할 때까지 유지되어야한다. 우리의 경험에서, 셀 분말 성능에 영향을주지 않고 실질적으로 무한정 이러한 방식으로 저장 될 수있다. </li></ol> 세포 추출물에서 단백질 복합체의 3 선호도 캡처 참고 : 다음 프로토콜은 관심, 공동의 단백질과 상호 작용 친 화성 친 화성 리간드로 구성된 미디어, 미끼, 또는 항체를 구현상자성 구슬 규모를 미크론 upled. 다음은 시판 키트를 사용하여, 사내 19,30 준비, 또는 기성 시약으로 구입할 수 있습니다. <ol><li> 세포 추출 준비 참고 : 세포 분말을 취급 할 때,기구 및 튜브 LN 2 사전 냉각을 사용하는 기억. 셀 분말을 함유 튜브는 항상하지 않을 경우 -80 ° C에서 LN 2 일에 개최한다. 50 ML 튜브 (들) LN 2 스티로폼 용기, 튜브 랙에 세포 분말을 함유 놓습니다. <ol><li> 1.5 또는 2 ML의의 microfuge 튜브에 세포 분말 100 mg의 달다. 참고 : 우리는 세포의이 양이 일반적으로 나노 그램의 수백 수십 표적 단백질을 생성하는 좋은 출발점이 당 사본의 수천, 적당히 발현 된 단백질 (~ 50 kDa의 질량에 대한 선호도 캡처 후 현재 범위를 관찰 한 표적의 추출 및 포획 효율을 추정하는 셀) ≳70 %이다. 이러한 수익률은 직접 visualiz 제공SDS-PAGE와 단백질 염색으로 정제 된 분획 ATION. </li><li> 빈의 microfuge 튜브 용기 분석 저울. 니오븀 2 스푼 또는 주걱을 냉각하여 튜브로 세포 분말 분배. 분석 균형 튜브 내에서 분배 된 분말의 질량을 확인합니다. 참고 : 셀 분말에서 무게, 작은 부피 측정 숟가락을 사용할 수있다 완화합니다. 이들은 (19 참조 참조) 재현 가능한 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 우리는 스크류 캡 또는 &#39;안전 잠금&#39;의 microcentrifuge 튜브를 사용하여 최상의 결과를 발견했다. 잠재적 시료의 손실이 발생 - 표준 마이크로 원심 튜브 직전 추출 용액의 첨가에이어서 온난화 동안 열려 팝업시킬 수있는 튜브를 입력 할 수 LN이 증발 압력. </li><li> 튜브를 엽니 다 (또는 스크류 캡 풉니 다) 세포 분말을 1 분 동안 실온에서 서 보자. 이는 관 내의 압력을 해제하고 추출 즉시 동결을 방지용액을 때 분말에 추가됩니다. 어떤 해동이 1 분 배양 동안 관찰되지 않는다. </li><li> 3.1.5 단계로 진행하는 동안 잠시 후 얼음에 개최 프로테아제 억제제와 소용돌이로 보충 추출 제 400 μl를 추가합니다. 샘플은 용출 될 때까지 이후의 모든 조작 사이에 얼음에 개최한다. 참고 : 추출 제의 가장 조성물은 단백질 복합체 (들)에 따라 달라집니다 정제한다. 일반적인 지침은 표 1과지지 문헌에 제공된다. </li><li> 샘플 어떤 집계를 분산 할 수있는 간단한 낮은 에너지 펄스를 제공하는 마이크로 팁의 초음파를 사용합니다. 4 펄스 (2 초 각각 2, 총 에너지의 약 15 ~ 20 J)와 (초) 초음파 처리. 주 : 볼텍스 추출 용매로 셀 분말을 분배하지만, 용액 특성에 따라 약간의 응집물이 관찰 될 수있다. 우리는이 집계를 분산하는 것은 이후의 친 화성 캡처 중 최고의 수익률을 제공 것으로 나타났습니다. 간단한 마이크로 팁 SONI양이온은 쉽게 이러한 집계를 분산. 이 솔루션은 분명 집계하지 않고, 반투명하지만 균일 나타납니다. 물 목욕 sonicators 효율적으로 크게 이상 시료 처리 시간없이 같은 집계를 분산 너무 낮은 전력을하는 경향이 있지만, 적절한 설정이 적합 할 수있다. </li><li> 원심 분리에 의해 추출물을 명확하게 (예를 들면, 20,000 × g으로 10 분간, 4 ℃). 주 : 명확히 세포 추출물의 분액 펠릿 포스트 화성 포획 상등액의 내용 비교를 위해 저장 될 수 있고, 친화 매체로부터 용출 후의 분획 표적 단백질의 추출 효율 및 캡처를 결정할 예를 들면, 웨스턴 블롯으로 (토론 참조). </li><li> 상층 액 (명확히 추출물)을 제거하고 친 화성 캡처를 진행합니다. 주 : 펠릿 표적 단백질 D의 분리 정도를 확인하기 위해 70 ° C에서 SDS-PAGE 샘플 로딩 완충액에 재 추출 될 수있다단계 3.1.6에서 얻어진 추출물과 비교하여 초기 비 변성 추출 uring. </li></ol></li><li> 선호도 캡처 <ol><li> 자기 친 화성 매체를 예비 세탁. 세포 추출물은 원심 분리되는 동안이를 수행 할 수있다. </li><li> 자석에 튜브 (들)을 놓습니다. 비드 제거하는 저장 용액을 허용 초 내에 튜브 측에 축적된다. </li><li> 구슬로 추출 용액 500 μl를 추가합니다. 중간 속도에서 간단히 와류 믹스 (재현 탁하기에 충분). 바닥에 모든 내용을 수집하는 미니 원심 분리기에 튜브를 펄스 - 스핀. 이렇게하면 솔루션의 최소 이월을 보장합니다. 자석에 튜브를 놓고 솔루션을 대기음. 참고 : 독특한 특성을 가진 마그네틱 미디어가 상업적 공급 업체의 다양한 사용할 수 있습니다. 결과 비드 크기, 균일 성, 표면 코팅하고, 항체를 화학 결합을 포함한 이러한 특성에 따라 달라질 수있다. 사이드 바이시응용 프로그램에서 드 시험은 선택 시약에 정착하기 전에하는 것이 좋습니다. </li><li> 재현 탁 짧게으로 미리 세정 친화 매체와 소용돌이를 함유하는 1.5 내지 2.0 ml의 튜브에 정화 된 세포 추출물을 전송하여 친화 캡쳐를 시작. </li><li> 회 전자 휠에 연속 부드러운 혼합 4 ° C에서 30 분 동안 품어; 구슬은 배양을 통해 정지 상태로 유지해야합니다. </li><li> 상기 튜브의 하단에있는 모든 내용을 수집하기 위해 소형 원심 분리기에서 튜브를 펄스 - 스핀. 뜨는을 대기음 단계 3.2.3에 기술 된 바와 같이 차가운 추출 용액 1 ml의 구슬을 세 번 씻는다. 자석에 튜브를 놓습니다. 솔루션을 제거합니다. 다음 해결 방법을 추가하고 반복 진행합니다. 2 차 세척하는 동안, 피펫 팅하여 신선한의 microfuge 튜브에 함께 구슬과 세척 용액을 전송합니다. 이 t와 배양에 사용되는 튜브의 벽에 흡착 임의의 단백질에 의해 용출 시점에서, 시료의 오염을 감소그는 추출물을 세포. 제 3 회 세척 한 후, 구슬은 아래로 모든 내용을 수집하는 미니 원심 분리기 펄스 방사 짧게해야한다. 다시 자석에 튜브를 배치하고 잔여 액을 제거합니다. 이것은 용출 균일 볼륨을 가질 것이다 용출 샘플을 확보하기 전에 용액의 마지막 몇 μL의 제거를 허용한다. 또한, 용출 용액 잔류 세척 희석되지 않으므로 용출, 효능을 보장 할 것이다; 이러한 잔류 물은 소금 효과에 기여 (아래 참조) SDS-PAGE에서 단백질의 이동을 변경할 수 있습니다. 주 : 사후 결합 상등액의 분취 3.1.6에서 생성 정화 추출물과 비교하여 저장할 수있다. 웨스턴 블롯에 의해. 그 결과, 세포 추출물로부터 표적 단백질의 붕괴 정도를 나타내는 것이다. </li><li> 어느 네이티브 또는 변성 방식으로 용출; 다운 스트림 응용 프로그램 (1)에 가장 적합한 전략을 고려합니다. 참고 : 기본 용출 멜라의 세부 사항의 사용 선호도 태그 (토론 참조)에 따라 달라집니다. 단백질 염색 31 SDS-PAGE로 샘플을 분석 한 다음 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 용출 변성 대부분의 사용자의 경우, 대부분의 실제 초기 접근 할 것이다. 주 : 전기 시스템에 의존 할 것이다 시료 완충액의 조성은 사용된다. 많은 실험실은 불연속 전기와 램 믈리 버퍼 시스템 32-34을 활용, 자신의 트리스 - 글리신 젤을 캐스팅. 일반적인 샘플 버퍼 레시피 (1 배)를 포함 : 10 % 수 크로스, 50 mM의 DTT, 2 % 파란색 SDS (/ V w), 62.5 mM 트리스 - CL의 pH 8.8, 0.0004 % (w / v)의 브로 모 페놀 31 (/ V w) . 우리는 DTT를 생략 1.1 배의 재고를 준비하는 것이 좋습니다. 500 mM의 DTT의 체적은 SDS-PAGE 이전에 샘플에 첨가한다 1/10 번째 (아래 참조). 많은 상업적으로 이용 가능한 SDS-PAGE 시스템도 사용할 수 있습니다; 이러한 시스템 별 샘플 버퍼를 포함 할 수있다. </li><li> 방출을 완화 (환원제없이 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 추가구슬에서 항체 체인) 그리고 교반과 함께 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어. 참고 :이 뜨는로 촬영 된 단백질을 방출, 가장 선호도 기반의 상호 작용을 방해한다. 더 지속적인 상호 작용이 출시 고온 혜택을 누릴 수있다 (일반적으로 70 ° C 충분하다). </li><li> 수집하고 뜨는을 저장합니다. 샘플은 간단한 저장을위한 C ° -20 (며칠)에서 동결되거나 -80 확장 된 저장을위한 C ° 분석이 요구 될 때까지. </li><li> 표준 기술 (31)를 사용하여 단백질 염색 뒤에 SDS-PAGE에 샘플을 대상. MS는 샘플 1 조성물을 특성화하는데 사용될 수있다. 개별 단백질 밴드가 식별 절제되거나 전체 샘플을 간략 (겔에 4-6mm) 샘플을 전기 영동과 같이 함께 샘플의 모든 단백질을 처리하여 단일 분석을 특징으로 할 수있다 &#39;겔 플러그.&#39; 참고 : initia 전에 DTT 추가팅 전기. 계획은 MS로 진행하는 경우, 시료를 전기 영동 (35) 후 알킬화 될 수있다; 그러나, 종래 전기 36 알킬화에 종종 편리하다. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이러한 세 가지 프로토콜은 (1) cryomilling 의해 고체 파손 셀을 제조, (2), 유성 볼밀의 파손을 달성하고, (3) 복잡한에 포착하는 목적 단백질의 친 화성 세포 분말 추출물을 제조 탠덤 작동 생리 학적 인터랙. 많은 다른 세포 용해 기술은 분쇄 충격, 전단 및 / 또는 압력을 이용하는 기계 / 물리적 접근뿐만 아니라 화학적 / 효소 접근법 다른 장단점 49,50 각각 포함하여 존재한다. 각 연구자는 세포 파손 및 단백질 추출에 대한 선택 방법 (아래 설명) 경험 최적화를 필요로 바이어스 (51, 52)을 소개하는 가능성을 염두에두고, 그들의 분석에 가장 적합한 방법을 탐구하도록 권장된다. 기계 방법은 단백질 복합체를 방해 할 수 있습니다 높은 열 및 / 또는 전단력을 생성 할 수있다. Cryomilling는 t 샘플의 LN 2 냉각을 채용 한 덕분에 발열 효과를 방지공정의 그 기간. 유성 볼밀이 미분화 (53, 54)의 성분으로서, 전단 응력을 포함 충격 및 마찰의 힘에 의존하는 것으로 이해된다. 설정에서 우리는 단백질 복합체의 변성을 관찰하지 않은 보도했다. 실제로 우리는 추출과 &#39;부드러운&#39;세제 기반 용해 7을 사용 제제보다 높은 특정 활성을 나타내는 분명히 그대로 ~ 50 MDA 핵 기공 단지 (11)와 효소 활성 레트로 트랜스포존을 검색했습니다. 세포 용해의 화학 / 효소 적 방법은 셀의 내용물을 시험 관내 환경 세포막 구조적 고분자의 중단을 지원하지만 단백질 복합체의 무결성을 유지하기에 적합하지 않을 것 (ES로 방출되는 것을 제한 고통 ) 관심. 종종 둘 복합체의 성분 관심의 단백질을 형성하지 않고 조건 대상 착체는 안정 필요미리 알고. 고체 밀링의 주요 이점은 파손 추출 원료를 허가, 비결이다 첨가 액체없이 제조 (이하 -80 ° C에서) 저장 축적하고 편리 주문형 실험에 대해 검색 할 수 있다는 점이다; 예를 들면, 친 화성 캡처를위한 시험관 조건에서 최적화 탐험. 단백질 상호 작용 따라서 추출 용매의 양이 생리 학적 작용을 보존하는 것이 유리할 수있다 최소화 고농도 (55, 56)에서 가장 안정하다. 한편, 실제적인 고려있다 - 단백질 복합체의 친 화성 배지 표적 복합체를 섞는하기 위하여, 세포로부터 불용성 응집체없는 비 점착성 수성 상에 분배 될 필요가있다. 또한, 시험 관내 환경 (PH, 염 농도 등)를 통해 일부 표준화 제어 시스템화 및 재현성이 필요하다. 우리는이 홍보를 추출 발견의 희석 범위에서 oduced 1 : 4-1 : 9 (w : v)의 품질의 결과를 산출 실용적이고 이론적 인 문제를 만족시킨다. 또한, 중간 요구 친 화성 세포 추출물의 최적의 비율이 결정된다. 이는 친화력 매체의 다양한 양으로 추출물을 적정하여 실험적으로 수행되며, 아래에 더 논의 된 실험의 신호 대 잡음비를 검출 가능한 효과를 가질 수있다. 표적 단백질의 우수한 붕괴는 일반적으로 표적 단백질의 가용성 분획의 ≥70 %이지만,&gt; 90 %가 바람직하다 및 추출 조건에주의 파라미터로 달성 될 수있다. 이러한 많은 실제적인 고려 사항 참조 1에 설명되어 있습니다. 집에서 만든 대안이 가능한 있지만 상자성 비드, 전문 microcentrifuge 관 홀더에 네오디뮴 자석을 사용하여 조작된다. 상기 홀더 내에 배치 할 때, 비드는 자기장의 영향 하에서 상기 튜브의 측면에 모은다. 솔루션은 디없이 제거 될 수있다구슬을 sturbing. 여기에 사용되는 유성 볼밀 개발되게 cryomilling 프로토콜의 하나의 한계는, (재료의 표 참조), 소재의 최소량 효과적으로 밀에 필요하며,이 장치 (&gt; 1g)를 사용하여 셀 분말 회복된다는 것이다. 이러한 양은 용이하게 많은 미생물 세포주 및 모델 유기체 수득되고, 또한 종종 실험실 동물에서 절제된 조직을 달성 할 수있다. 그러나, 특정 세포주 부족 일 수있다 풍부한 동물 조직에서 성장하는 것은 매우 어려울 수있다. 재료의 소량을 비교적 달성 분말 섬도 희생 비록 잠재적으로 작은 컨테이너를 이용하여 다른 장치를 사용하여 분쇄 할 수있다. 또한, 기계식 분쇄 장치의 비용 일부 실험실 매우 고가 일 수있다. 해충을 사용하여 손으로 가장 저렴 포함한 대안 14-19 설정들을 사용하여 달성 될 수 Cryomilling제작과 박격포, 파손 효율이 상당히 떨어진다 않는다. 선호도 캡처 프로토콜은 일반적으로 최대 따라서 단백질 용액으로 추출하고, 표적 단백질 복합체의 캡쳐를위한 최대 가능성을 용이하게하기 위해 세포 용해의 높은 효율을 목표로한다. 한편,이 시험 관내에서 접합 효모 입증되었다가 최대 용해 시험 관내 생화학 적 활성의 최대 57, 58와 동등하지 않을 수 있음을 추출한다. 우리는 우리가 지금까지 테스트 한 시스템에서 이러한 문제를 관찰하지 않은, 그리고 cryomilling 경우에 따라서 의도적으로 우리의 세포 파괴를 제한하지 않습니다. 체외 효소 분석을 위해 최적화 할 때 그럼에도 불구하고, 이러한 가능성을 염두에 두어야한다. cryomilling 세포를 파괴하기위한 매우 효과적인 방법이지만 불균일 한 응집체가 종종 육안으로 관찰 할 수 있기 때문에, 초음파의 제한된 양들은 포유 동물 조직으로부터 생산 균질 전체 세포 추출물 혜택 : 일반적추출 조건에 소금 (100-300 밀리미터) 및 비 이온 세제 (0.1 %의 v / v)의 농도를 완화하기 위해 낮은 사용. 우리는 이러한 응집체의 존재는 후속 연관 캡처의 수율 및 / 또는 품질을 감소시킬 수 있음을 관찰 때문에, 정기적으로 (그들이 육안으로 관찰되지 않는 경우에도)을 분산시키는 초음파를 구현한다. 응집체는 분쇄 이전 효모 추출물 58에보고 된 것과 유사한 응집 막 단편과 일치한다. 초음파는 그러나이 프로토콜에 적용되는 초음파의 정도는 단편 DNA 상당히하지 않는, DNA 전단 및 솔루션에 염색질 조각을 해방 일부 프로토콜에 사용됩니다. 관심있는 특정 단백질에 대한 우수한 친 화성 리간드 또는 항체의 제한된 가용성 (또는 높은 비용)은 또 다른 장애물이 될 수있다. 시중에서 판매하는 친 화성 시약의 다양한는 모델 생물은 게놈 태그 또는 그럴 의무가있을 때 활용 될 수있다친 화성 태그로서 관심 융합체 단백질의 발현을 허용 이소성 발현 벡터와 ansfection. 그러나, 정의 된 항체의 제조는 점차 실현되고있다 모두 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체는 친 화성 포획 용도로 양호하게 수행 할 수있다. 이러한 많은 고려 사항도 참조 1에 더 자세히 설명되어있다. 화성 매질의 세포 용해 방법 및 선택 결과에 영향을 줄 수있는 방법의 예는도 1에 도시되어있다. 다른 추출 용매에 의해 가해지는 영향의 예는 참조 1,11,24에서 볼 수있다. 이들 및 다른 실험 파라미터 어려운 FPS를 구별 할 수있게, 친 화성 포획의 품질에 영향을 줄 수 있기 때문에, &quot;비드 프로테옴&quot;및 계산 방법의 저장소가 비 특정 오염물 FPS 40-43 식별을 지원하기 위해 개발되고있다 제거한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 접근 방식 만 substit제한도 59에 최적의 샘플 준비를위한 UTE. 모범 사례를 관찰하고 경험적으로 선호도 캡처 실험, 다운 스트림 분석에 대해 더 논의 최고 품질의 샘플을 제공 할 것입니다 최적화. 샘플 순도를 향상시킬 수 있습니다 쉽게 구현 방법은 기본 용출이다. 고유 용출은 더욱 자주 실험용 그대로 친 화성 절연 단백질 복합체를 얻기 위해 사용된다; 그것은 종종 시료의 순도를 향상으로하지만, 또한 단독 이러한 이유로 사용될 수있다. 도 1 패널 II에서 설명하지만, 시료의 순도를 개선하기위한 고유 용출의 능력은 세포 추출액에서 목적 단백질의 풍부 친화력 매체의 양을 정확 적정에 의존 할 수있다 - 상기 매체가 초과되면 , 빈 paratopes는 기본적으로 용출 분획에서 관찰 FP 단백질의 오프 - 타겟 축적을 허용 할 수있다. 여기에 설명 된 시약 및 절차를 사용하면, 시간우리의 경험이었다 우리의 실험에 FPS의 하나의 큰 기여를 한 번 살아있는 세포의 맥락에서 제거 된 태그 단백질 그 자체입니다. (도. 1.II도. S1). 이러한 경우에, 항원의 부재하에 무관 프로테옴을 수득 부모 세포주 제어없이 실제 값이고; 마찬가지로 표적 항원하지만 아무것도없는 상태입니다 태그 전용 또는 스파이크에 컨트롤. 따라서, 직접 정량적 MS를 사용하는 이후 용해 단백질 상호 작용의 축적을 측정하는 I-7,38 DIRT을마다 실제 구현. 프로토콜의 단계 3.2.7에서 설명 된 바와 같이, 고유 용출 절차 사용한 친화 시스템의 세부에 따라 다를 것이다. 고유 용출은 가장 일반적으로 친 화성 매체로부터 단지 해제 태그의 태그 단백질 복합체 또는 단백질 분해 절단의 경쟁 변위에 의해 달성된다. 작은 에피토프 태그 이루어진 여러 친화 시스템은 fo를 존재R 에피토프 자체는 태그 단백질 복합체 (60)의 경쟁 용출 유용 펩타이드로 사용할 수있다. 마찬가지로, 여러 프로테아제는 융합 단백질 (61)는 특히 전략적으로 친 화성에 배치 동족 사이트를 절단 할 수 태그가 지정됩니다. 선택된 선호도 시스템의 특성에 따라 적절한 용출 방식을 채용 할 수있다. 일반적으로, 얻어진 결과의 품질이 크게 샘플 제조의 품질에 의해 영향을받을 것이다. 관심과 정밀도를 유지하면서 가능한 빨리 이러한 프로토콜의 각 단계를 신중하고 정확하게 일을하고하는 것이 중요합니다. 각 조작의 효율을 이해하는 각 단계를 통해 관심있는 단백질의 분할을 추적하는 것이 바람직하다. 예를 들어 문제의 세포 또는 조직에 대한 관심의 단백질은 얼마나 풍부하다? 아마도 연구 (및 단지)에서 단백질은 질량 특성에 도전 할 것이다낮은 풍부에 의한 분석. 정제 된 복합체 (약 나노 그램 범위) 일반 단백질 염색으로 검출하는 경우, 질량 분석은 성공할 가능성이 높다. 관심의 단백질 포착에만 민감한 향상된 화학 발광 웨스턴 블 롯팅 (약 피코 그램 범위)에 의해 검출 될 수 있다면, 질량 분석 효과가 어렵다. 관심의 단백질이 세포 풍부하더라도, 세포 추출액에 얼마나 풍부한 생산? 용액에 단백질 파티션 않거나 펠릿에? 후자의 경우, 새로운 추출 용액 회복을 향상시킬 것을 고안 할 수있다. 세포 추출액은 친화력 매체와 결합되면, 어떻게 효과적으로 단백질 포착? 단백질은 이후의 세척을 통해 결합 상태를 유지 하는가? 어떤 다른 copurifying 단백질은 어떻습니까? 프로토콜의 적절한 단계에서 각 샘플의 분취 량을 저장하여 이러한 질문에 쉽게 관심의 단백질에 서부 블로 팅에 의해 일반적으로 대답 할 수있다또는 일반 단백질 염색하지만, 다른 분석도 적합 할 수있다. 트레이드 오프가 하나의 속성 또는 다른 극대화를 만들 수있을 수도 있지만, 각각의 단계를 최적화하면, 캡처 된 복합체의 수율 및 순도를 향상시킬 것이다. 많은 연구자 친 화성 포획 전형적인 애플리케이션은 관심 단백질의 소수에 대한 생체 내에서 인터랙 후보를 식별하는 것; 이 후보는 일반적으로 물리적 인 인터랙의 생물학적 중요성을 입증하기 위해 생체 내에서 직교 방식에 의해 검증을 실시한다. 선호도 캡처 또한, (거의) 프로테옴 전체 기초 관찰 단백질 copurifying 생체 복합체의 추정 연산에 관한 추론을 용이리스트를 생성하는 높은 처리량의 연구에 의해 사용된다. 이러한 연구의 많은 예는하기 문헌에서 찾을 수있다. 이 방법은 탐구하는 사람에 찬성 특정 대상에 대해 캡처의 조건의 최적화를 포기합니다y를 대상; 같은 추론 단지 스스로는 거의 주어진 샘플에서 완전히 손상 및 고순도 검색되지 않습니다. 오히려, 다수의 별개의 친 화성 포획 샘플 사이 관찰 조성물의 부분 오버랩 추론 (42)의 기초로 사용된다. 두 가지 접근법은 상호 작용 체에 대한 우리의 이해에 중요한 데이터를 기여한다. 그럼에도 불구하고, 친 화성 포획 한 주요 이점은 자주 손상과 고순도 노력이 절차를 최적화하기 위해 제조되어 제공되는 복합체를 얻을 수있는 기회를 제공 않는다는 것이다. 우리는 접근의 미래는 생리 인터랙 및 하류 생화학, 효소 학적으로 더 자주 사용 및 구조 연구의 영역의 더 정확한 평가를 위해 용이성과 내인성 단백질 복합체 (11)의 캡처를 최적화의 효율성을 증가에 달려 있다고 생각 예를 들면, 7,9,23를 참조합니다.

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	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

제시된 절차의 일반적인 응용 프로그램은 interactomic 특성 1에 대한 관심의 내인성 단백질 복합체의 높은 수율과 순도를 안정 획득하는 것입니다. 주로 단백질로 구성 모두 안정적 일시적 관련된 고분자 복합체의 동적 네트워크는 셀룰러 프로세스 2,3 조율 것으로 이해된다. 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하기위한 다수의 실험 방법이 있지만, 친화 캡처 단리 생리 단백질 복합체 4-6 해부 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다. 또한,이 기술은 판독 데이터 포인트뿐 아니라 물리적 엔티티와 같은 거대 분자 복합체를 수득하는 이점이있다; 바람직하게는, 상기 얻어진 복합체 따라서 추가적인 하류 생화학 적 효소 및 구조 분석 7-9의 호스트로 사용할 수있다. 제시된 프로토콜 PROTEI 매핑 할 필요에 응답하여 개발되었다N - 단백질 상호 작용 네트워크는 세포 생물학의 이펙터 분자로서의 역할 고분자 복합체를 특성화. 그들은 조직 배양에서 성장한 포유류 세포에 대한 애플리케이션에 대해 자세히 설명되어 있지만, 해당 시스템 관련 비틀기 주어진 생물학적 시료의 넓은 범위에 동등하게 적용 가능하다. 선호도 캡처의 역사는 최초의 면역 크로마토 그래피 실험을 다시 20 세기 초에 뻗어 - 일반적으로 면역 침전으로 요즘라고 무엇을 닮은 (IP) - 1950 년대 초에 의해 문헌에 등장. 기술의 주류 사용은 또한, 본 10-13이 세기의 전환기를 통해 개발했다. 다양한 세포 및 분자 생물학적 연구는 적어도 지난 사십년 14-19를위한 저온에서 분쇄하여 세포의 기계적 파손을 활용 한; 및 (슈퍼) 상자성 구슬을 이용하여 분자 분리는 벡이지난 20 년 20 점차 일반화 오메. 스스로 제작 작업의 확장 체와 넓은 연구 커뮤니티에 의해 입증 상승적 단백질 복합체의 친 화성 포획 실험 1에서 얻을 수있는 결과를 향상시키기 위해 제공되었다 이러한 다양한 기술을 결합 7,9,11,18,19,21 -23. 지원 결과는 그림 1에 제시되어있다. 주의 사항 및 효과적인 친화 캡처 실험을 실행에 적용되는 고려 사항의 컬렉션 참조 1에서 찾을 수 있습니다. 즉, 관심의 단백질의 인터랙를 카탈로그 지금까지 알 수없는 copurifying 단백질 (탐색 적 분석)를 식별하는 단백질 질량 분석 (MS)를 사용 (I) : 일반적으로이 방법은에 가장 적합한 특정의 상호 작용 파트너의 존재 (II) 분석, 즉,에 의심되는 단백질은 특정 단백질 또는 제한된 세트를 검출하는 MS 또는 웨스턴 블롯을 사용하여관심 (가설 테스트)의 단백질 teract; 또는 (III) 추가 기술에 의해 추가 연구 (예비 정밀 검사)에 대한 관심의 단백질을 포함 내생 조립 단백질 복합체를 준비합니다. 친 화성 포획 실험 체계에 착수하기 전에 대상 단백질 주목 원시 표적 단백질에 대해 또는 융합 단백질에 첨부 된 태그에 대해 통상적으로 IP 능이있는 항체에 결합하는 고품질의 화성 시약이 절대적으로 필요하다. 모든 일반적으로 선호도 캡처와 함께 사용되어, 서부 블롯 및 단백질 MS (예 : 쿠마 블루, Sypro 루비, 또는은, 다음의 SDS-PAGE 등) 일반적으로 단백질 염색 :이 곳에서 실험 판독 적절한 방법을하는 것도 중요하다 1. 제시된 프로토콜은 선호도 매체로서 항체 복합 자석 구슬을 사용한다. 반면 친 화성 배지의 기능은 처음에 몇 실험 파라미터들을 이용하는 실험에서 검증 할 수각 실험은 경험적 1,11,24을 최적화해야 최상의 결과를 얻었다. 프로토콜은 세 개의 독특한 단계로 분리되어 고정 된 셀 재 (1)의 제조; (2) 저온에서 고체 밀링 세포 파괴; 및 (3) 단백질 추출 및 항체 결합 상자성 비드를 사용한 친 화성 포획.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

선호도 캡처 추가 연구를 위해 내인성 단백질 복합체를 분리하는 효과적인 기술이다. 항체와 함께 사용하는 경우,이 기술은 종종 면역이라고한다. 선호도 캡처 벤치 규모에서 높은 처리량 컨텍스트에서 적용될 수있다. 단백질 질량 분광법과 결합 할 때, 상호 작용 체는 친 화성 포획 분석의 주력이 입증되었다. 관련된 여러 단계를 실행하는 잠재적으로 여러 가지 방법이 있지만, 다음과 같은 프로토콜은 우리의 선호하는 방법을 구현한다. 두 가지 특징은 특유하다 : 친 화성 매체로서 세포 추출물 및 항체 결합 상자성 비드를 생산하는 세포 cryomilled 분말의 용도. 많은 경우에, 우리는 더 많은 기존의 친 화성 캡처 관행을 얻은 우수한 결과를 얻었다. Cryomilling 셀 파손 다른 형태와 관련된 많은 문제점을 회피한다. denat 피하면서 그것은 재료의 효율적인 파손을 제공합니다가열 또는 발포와 관련해서 만들었 문제. 그것은 거대 분자 분리 완화, 추출 지점에 천연 단백질 농도를 위로 유지합니다. 이 추출 된 단백질 유해 효소 활성을 제한 용액에 보내는 시간을 감소시키고, 이는 친화 매체에 의해 단백질의 비특이적 흡착을 감소시킬 수있다. 마이크론 규모의 자기 친 화성이 매체는 점점 전통적인 agarose- 및 파로스 기반 미디어를 교체, 지난 몇 년 동안 더 일반화되고있다. 자기 매체의 주 이점은 통상 하부 비특이적 단백질 흡착을 포함한다; 단백질 복합체가 결합하기 때문에 어떤 크기 배제 한계 대신 모공 내에보다 비드 표면에 발생; 및 조작의 용이성과 자석을 사용하여 처리.

도 1은 패널 I는 cryomilling 자기 비드 샘플의 품질을 향상하기 위해 함께 작동 할 수 있음을 나타낸다. 패널 IA-C는 선호도 캡처에 사용되는 불용성 매체를 포함하는 재료를 회수 프로테옴 (19)에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 관심의 단백질, 정제 FLAG-태그 세균 알칼리 포스 파타 아제 (BAP)는 인간의 세포 추출물로 급증했다. BAP는 특히 상호 작용과 인간 단백질을 copurify 것으로 예상되지 않습니다. SDS-PAGE 및 쿠마시 염색하여 판정 copurifying 단백질의 서명은 사용 된 매질에 따라 변할. 마이크론 크기의 자성 비드는 비특이적 단백질 흡착의 비교적 낮은 레벨을 나타내는, 깨끗한 프로파일을 보였다. 패널 ID IE 및 세포 용해의 방법은 또한 회수 프로테옴에 영향을 미칠 수 있다는 것을 예시한다. 제공된 예에서, 내인성 단백질 복합체 (다음 37 착체), 친 화성 captu시켰다cyromilled 또는 초음파 세포에서 재 (19)를 추출한다. 세포 추출액은 세포 cryomilled 분말로부터 제조 될 때 적은 높은 질량 오염이 관찰되었다. 내인성 단백질 복합체를 연구하기 위해 친 화성 캡처를 사용하는 문제는 잘못된 반응 (FPS)에서 관심있는 단백질의 선의의 생리 인터랙을 구별하기 어려울 수 있다는 것이다. FPS 및 / 또는 관심이 자신의 단백질에 비특이적 튜브 용기에 흡착 친화력 매체 항체 또는 친 화성 리간드를 포함하는 많은 소스로부터 발생할 수있다. 그 결과, 상당한 노력 캡처 프로세스 최적화에 할애해야한다. FPS의 검출은 다른 도구의 많은 수의 실험 38-40 전산 서로 다른 장점과 단점에 41-43, 각각의 접근을 포함하여 개발되었다하는 중앙 도전 남아있다. 우리의 실험에서 우리는 이전에 F의 패턴에 주목P 단백질, 조절 세포 추출물과 α-FLAG 자기 매체의 배양 후의, 즉 3xFLAG 표지 된 단백질의 존재하에 수득 된 패턴과 구별 결합시킨. 또한, 이러한 FPS는 3xFLAG 펩타이드 (7) 배양 배지에서 방출 될 수있다. 이러한 관찰 기회 동족 에피토프의 부재에서 α-FLAG의 paratope에 FPS의 결합과 일치한다. 많은 연구가 친 화성 캡처를위한 모의 제어와 같은 태그가없는 &#39;부모 세포주&#39;를 사용하기 때문에이 FP 배경의 본질을 이해하는 것은 중요하다 이러한 컨트롤 따라서 태그 단백질과의 상호 작용의 특이성을 결정하는 것이 부적절 할 수있다. 배경을 확인하기 위해 항체 paratopes 점유 할 때 우리의 친 화성이 매체에 기부 여부, 우리는 3xFLAG의 α-FLAG 자기 매체와 존재 HEK 293T 세포 추출물 (더 태그 단백질이 발현 없음) 또는 부재를 사용하여 모의 친 화성 캡처 실험을 바인딩펩타이드 스파이크입니다. 결과는 그림 1, 패널 II에 표시됩니다. 간단히, α-FLAG 자기 매체 세포 추출물의 배양을 30 분 동안 pH 7.4의 20 mM의 HEPES - 나 트리톤 X-100 V 500 mM의 염화나트륨 및 1 % 절 / 포함하는 (≳10 ㎎ / ㎖의 총 단백질). 매체는 경쟁적 변성 용출을 달성하기 위해 α-FLAG의 paratope 기본적 또는 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 결합하는 단백질을 치환하는 1 ㎎ / ㎖ 3xFLAG 펩타이드와 함께 배양 하였다. 세포 추출물을 1 μg의 용액 및 / 3xFLAG 펩타이드 10 μg의 / ㎖으로 스파이크 때 부가 적으로, 동일한 실험을 수행 하였다. 모든 용출 된 분획을 SDS-PAGE 및은 염색을 실시 하였다. 우리는 그의 동족 에피토프의 부재 하에서, α-FLAG 매체 3xFLAG 펩티드로 용출 될 수 배경 단백질의 검출 레벨 캡처 않는다는 관찰 -도 1-II에 의해 제공되는 예에서는, 우세한 종 (37) 사이에 존재 하였다 50 kDa의. 용출 패턴SDS-PAGE 샘플 버퍼에 추가 띄는 종으로 비교 하였다. 그러나, 1 μg의 / ㎖ 3xFLAG 펩티드의 존재 하에서, FP는 친화 매체 결합 검출의 수준 이하로 제거하고, 하나 또는 변성 천연 용출 분획에서 관찰되지 않았다. 이 결과는 3xFLAG / α-FLAG M2의 경우와 같이 빈 항체 paratopes가 그들의 동족 항원의 부재하에 난잡한하고 심지어 높은 친화 그들의 에피토프에 결합하는 항체에 대한 친 화성 포획 동안 획득 프로테옴에 크게 기여할 수 있다는 것을 암시 편성. 또한 종종 비특이적 결합을 줄이기 위해 선택 높은 염을 사용하여 매우 엄격한 조건은 항원 / 항체 상호 작용의 부재에 비 효과적 일 수도 suggestd. 후속하려면 우리는 SDS-PAGE뿐만 아니라 양적 MS (그림. S1)에 의해 유사한 실험을 포함하여 분석을 수행 하였다. 계량 347 단백질, 우리는 모든 단백질이 하나 (거짓 디스코을 위해 저장하는 것이 관찰매우 속도 = 1 %; 3xFLAG 펩타이드는 대조 시료 아군에 비하여 표 S1)는 3xFLAG 태깅 미끼 단백질 연관되었다. 이러한 결과는 실험에서 관찰 된 단백질의 압도적 인 다수가 태그 단백질과 공동으로 정화 할 가능성이 또는 빈 α-FLAG의 paratopes의 부산물 오프 대상임을 나타냅니다. 우리의 경험에서, 높은 신호대 친화 캡쳐 결과, 날카로운 풍부하고 대략 화학량 밴드뿐만 아니라 다른 희미한 밴드에서 배경 얼룩의 소수의 분리 패턴에 의해 SDS-PAGE와 단백질 염색에 예시된다; 이 원리의 많은 예를 참조 (11)에서 볼 수 있습니다. cryomilling 때 (권장되는)은 PTFE 절연체를 사용하는 동기는, 밀링 중 항아리 온난화의 속도를 감소 밀링 과정을 반복 LN이 냉각의 부담을 경감하고, 얼음의 정도를 감소시키는항아리에 형성. 이것은 일관된 분쇄 성능을 용이하게하고 세포 분말의 취급이 용이. 예 절연체 참조 27 (퍽)를 발견하고 그림 2, 아래 (소매 앤 퍽)에 묘사 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> 그림 1 : 대표 결과를 선택합니다. (I)이 패널은 참조 (19)에서 수정되었습니다. 쿠마 블루 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 스테인드. (왼쪽) 마이크론 크기의 자석 구슬 오프 대상 아가로 오스 기반 미디어보다 결합 낮은 보여줍니다. (A) 자석 구슬; (B) 전통적인 아가; (C) 철 함침 (자기) 아가로 오스; 각 항 FLAG M2 항체에 결합되고, FLAG 태그가 박테리아 알칼리 포스파타제 캡처하는 데 (BAP를 표지 된) cryomilled HEK-293 세포로부터 제조 된 추출물에 아군. 아가로 오스 기반 정제를비특이적 흡착 (비 표지 대역)보다 높은 수준을 나타내었다. 내인성 단백질 복합체를 정제하는 데 사용할 때 cryomilled HeLa 세포에서 생성 (RIGHT) 추출물은 초음파 처리에 의해 생성 된 것보다 항체가 결합 된 자성 비드에 낮은 오프 - 타겟 흡착을 나타낸다. LAP-태그 (44) RBM7은 다음 복잡한 19,37 (D)를 정화 클론 항 GFP 항체에 결합 자기 구슬을 사용하여 캡처 친 화성이 cryomilled 분말로부터 제조 추출합니다되었다; (E) 추출물을 그대로 셀의 초음파에 의해 제조. 검은 수직 바는 높은 질량 비특이적 인터랙는 초음파에 의해 제조 된 샘플이 풍부한 것으로 관찰 된 겔의 영역을 강조한다. 검은 색 화살표가 예상되는 특정 인터랙를 표시 (표시). 레인 D와 E에 ~ 50 kDa의 관찰 밴드 라마의 IgG 중쇄 때문이다. (II) 실버 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 스테인드. (표준입니다.) 모의 친화 캡처 HEK-293에서 수행T 세포는 표준 방법으로 추출한다. 캡쳐 후에, 결합 된 물질의 용출은 (N) 1 ㎎ / ㎖ 3xFLAG 펩티드 또는 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 용출 변성 (D)과 비 변성 용출을 통해 달성되었다; 표준으로 (PB 1). 그러나 3xFLAG 펩티드 친화 매체상의 α-FLAG의 paratopes를 차단하는 1 ㎍ / mL로의 추출 용액에 포함 하였다; PB 한 그러나 10 μg의 / ㎖ 3xFLAG 펩티드의 존재 (PB 10). IgG에 관련 밴드와 3xFLAG 펩타이드가 표시되어 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> 그림 2 : 소매 앤 퍽 PTFE 절연체. 250 ML의 PTFE 항아리가 표시됩니다 (1). 50 ㎖의 스테인레스 스틸 밀링 항아리 (2)는 PTFE 항아리 (3)의 내부에 맞는과를 제공합니다기회를주기 사이의 공장 내에 설치 밀링 항아리를두고 있습니다. 상부 PTFE 절연체 퍽 (2)는 클램프 조립체와 병 뚜껑 사이에 사용된다. 설치된 항아리와 절연체 어셈블리 (3) 냉각, LN 2 단지 주변, 절연체의 몸에 직접 추가됩니다. 밀링 다음 사이클은 시작된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 추천 농도 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 0.1 ~ 0.5 M </td><td> 높은 농도 (&gt; 300 밀리미터) 총 단백질의 추출을 개선하고 낮은 배경을 유지하는 경향이 있지만, 일부 그렇지 않으면 안정적인 간을 벗겨 수배우. 150 밀리미터 이하 농도는 비 특정 배경을 감소에서 일반적으로 적용되지 않습니다. </td></tr><tr><td> 초산 암모늄 </td><td> 0.2 M </td><td> 이 버퍼로 구성된 소금, 즉 중성 pH 솔루션 (57)를 산출한다. 높은 농도의 일부 단백질 복합체를 안정화. 산성 용액은 암모니아 손실의 계정에 이전, 잘못 저장된 결정 주식에서 발생할 수 있습니다. 추가 pH 완충 염 또는 아세트산 암모늄을 포함하는 추출 용매에 필요하지 않다. 얻어진 결과를 변조 NaCl로 조합 될 수있다. </td></tr><tr><td> 트윈 20 </td><td> 0.1 %의 v / V </td><td> 비이 온성 세제 (58); 일반적으로 염화나트륨과 함께. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 0.5 %의 v / V </td><td> 비이 온성 세제 (58); 일반적으로 염화나트륨 또는 NH 4 CH 3 CO 2 H 중 하나와 결합 </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 양쪽이 온성 세제 58 &lt;/ SUP&gt;; 일반적으로 염화나트륨과 함께. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 ㎜ </td><td> 배경을 줄이고 잠재적 이진 연결을 공개, 안정적인 복잡한 구성 요소를 제거 할 수있는 음이온 성 세제 (58); 일반적으로 염화나트륨과 함께. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 트리스 (CL) </td><td> 20 mM의 </td><td rowspan="2"> 의 pKa 4 ° C, 25 ° C에서 8.1에서 8.8의. </td></tr><tr><td> (PH 8.0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES - 나 </td><td> 20 mM의 </td><td rowspan="2"> 의 pKa 4 ° C, 25 ° C에서 7.5에서 7.8의. 또는 NaOH를 KOH는 소금에 따라 산도 평형에 사용 (예를 들면, 염화나트륨, KCl을, 또는 CH 3 CO 2 K)를 추출 용매에 사용됩니다. </td></tr><tr><td> (PH 7.4) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 단백질 복합체를 정제 제안 몇 가지 시약 유용합니다. 이 테이블 리터제안 작업 농도 우리는 인간의 세포 라인에서 정화 단백질 복합체에 대한 유용하다고 몇 가지 시약을, 주의자. 일반적인 추출 제 제제의 pH 버퍼, 소금 및 세제 1,11,24,45-48이 포함되어 있습니다. 최상의 방법은 원하는 결과를 산출 시약의 적어도 복잡한 조합을 식별 할 수있다. <img alt="그림 S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> 그림 S1 : 혼합 오탐 (false positive)의 정제 (맵 -) SILAC 분석 후. I. 개요 도표 :이 실험에서 각각 heavy- 빛 표지 HEK-293T 세포 (7)로부터 정제 하였다 (pLD401에서 표현) ORF2p 단백질 복합체를 3xFLAG-태그. 빛 라벨링 된 셀 추출물은 경쟁적 저해제에 의해 3xFLAG 태그가 ORF2p의 친 화성 캡처를 방지하기 위해 3xFLAG 펩타이드에 타서; 이것은 비보고 특정 발생할 수 있습니다 단백질의 결합을 차단하는 예상되지 않는다자기 매체 또는 항체의 비 paratopic 구조와 캘리. 상기 자성 비드로부터 용출 한 후, 중쇄 및 광 샘플 혼합 후 정제 및 정량 MS로 분석 샘플 중 하나와 관련된 단백질의 비율을 결정 (39 SILAC MAP); 표 S1에있는 또 다른 방법 론적 세부 사항입니다. II. 실버는 라이트 - 무거운 표지 물질이 유사한 결과 (H와 L과 비교)을 수득하는 것이 도시 겔을 염색하고 3xFLAG 스파이크 인 (LI)의 존재 하에서 수행 정제 경쟁적 억제했다. 하기 표 S1에 기재된 바와 같이, 혼합 H 전에 겔 기반 프로테옴 분석 LI 분획 이루어진 쿠마시 블루 G-250 염색 겔 플러그. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 S1 :MAP-SILAC. 이 시트는 그림 S1에 설명 된 MAP-SILAC 실험의 실행시 얻은 데이터가 포함되어 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K 조회수.  The Rockefeller University.  여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다. 

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...