스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 및 참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여.
Divalent 양이온 (PBS-) 없이 <ol><li>준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압력가 마로 소독 (1 개 주기 121 ° C에서 15 분)으로 소독 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>이미 300 mM의 재고 솔루션을 준비: ddH 2 O.Adjust HCl. 여과기 소독 0.22 μ m를 사용 하 여 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH 크기 필터 기 공 및 4에서 저장의 10 mL에 이미의 0.204 g ° c.</li>
	<li>준비 균질 버퍼 (HB; 준비 약 100 mL): 250 m m 3 m m 이미에 자당. PH 미터를 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH를 조정 합니다. 필터-0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 4에서 저장 protease 억제제 10 m m leupeptin, 1 mM pepstatin A, 및 10 ng/mL aprotinin에 해당 하는 최종 농도에서 칵테일 ° C. 보수는 HB 사용 직전.</li>
	<li>단계 부양 그라디언트에 대 한 준비 62%, 39%, 및 35% 자당 해결책 3mm 이미, pH 7.4, 아래 설명 된 대로. 굴절 계를 사용 하 여 모든 자당 솔루션의 최종 농도 정확 하 게 결정.
	<li>준비 100 mL 3 m m 이미, pH 7.4에에서 62% 자당 해결책의 <ol>. DdH 2 O 80.4 g 자당의 감동에 의해 해산 사전 예 열 300mm 이미 재고 솔루션 및 ddH 2 O. 조정 100 mL를 채우기의 35 ° C. 추가 1 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터 및 저장소를 사용 하 여 4 ° c.에</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 35% 자당 해결책의 100ml 준비합니다. 40.6 g 300 밀리미터 이미 재고 솔루션의 ddH 2 오 추가 1 mL에 자당의 감동에 의해 해산 하 고 ddH 2 O. 조정 100 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터를 소독을 사용 하 여 0.22 μ m 기 공 크기 필터와 4에 저장를 채우기 ° c.</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 39% 자당의 50 mL를 준비합니다. 35% 자당 해결책으로 62% 자당 해결책을 희석. 4 ° c.에 게</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde (PFA)의 3 세대 dropwise 1 M NaOH를 추가 하는 동안 60 ° C에 100 ml의 PBS-사전 warmed 감동에 의해 해산, NaOH를 사용 하 여 7.4에 최종 pH를 조정. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 및 저장-20 ° c. 
	주의: 3 %PFA 독성 시 약.</li>
	<li>1 M KCl 준비 재고 솔루션입니다. DdH 2 O. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 50 mL에 감동 하 여 KCl의 3.73 g을 녹이 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>준비 50 X 집중 재고 솔루션-20에서 ddH 2 오 약 수 및 저장소에 pH 7.0과 75 mM MgOAc 2에 0.625 M Hepes 포함 ° c.</li>
	<li>준비 설치 미디어입니다. 글리세롤의 6 g 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (PVA)의 교 반에 의해 혼합. DdH 2 O 6 mL을 추가 하 고 실 온에서 2 h 이상 떠나. 추가 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)와 약 53 ° c는 PVA 해산 했다 때까지 가끔 저 어 열.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히합니다. 상쾌한을 수집 하 고 2.5% (w/v) 1, 4 추가-diazabicyclo-[2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 형광 탐지 동안 photobleaching를 방지 하기 위해. 약 30 소용돌이 해산 s. Aliquot 1.5 mL 플라스틱 튜브와 스토어-20 ° c.</li>
</ol> 2. 세포 배양 <ol><li>문화 헬러 셀 Dulbecco &#39; s 10% 태아 종 아리 혈 청, 10% 비 본질적인 아미노산, 보완 수정이 글 중간 10 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스. 37 ° c 5% CO 2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>Transfect 세포 GFP RAB5 10, 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 실험 하기 전에 24 시간 &#39; s 지침.</li>
	<li>필요할 때, 준비 endosomal 분수와 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심의 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing 단백질의 고갈에서 cytosol.</li>
</ol> 3. Endosomal 분수 준비 참고: endosomes 및 다른 가벼운 막 subcellular 분수의 간단한 준비가이 프로토콜에 설명 합니다. 필요한 경우, 순화 된 endosome 분수는 사용된 11 수 있습니다. GFP RAB5 시작 물자로 표현 confluent 셀 2 접시 (10 cm 외경; 57 c m 2)를 준비 합니다. 2 접시에 confluent HeLa 세포의 총 수는 대략 2.5 x 10 7 셀에 해당합니다. 때, 필요는 endosomes 또한 준비 될 수 있다 세포 관심 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 그리고/또한 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing, 항상 표현 GFP-RAB5의 단백질의 고갈에서.
 주의: 얼음에 분별 법 프로토콜의 모든 단계를 수행 해야
<ol><li>평평한 얼음 양동이에 젖은 금속 접시에 배양 접시를 놓고 즉시 두 번의 얼음 처럼 차가운 PBS-5 mL로 세포 세척.</li>
	<li>모든 PBS-마지막 세척에서 제거 하 고의 얼음 처럼 차가운 PBS-접시 당 3 mL를 추가 합니다. 셀 처리 동안 건조 하지 한다: 필요한 경우 적절 하 게 커버 액체와 셀 락 플랫폼에 얼음 양동이 놓습니다.</li>
	<li>는 기계적으로 유연한 고무 경찰관 (즉, 직접 만든 셀 긁는 도구)를 사용 하 여 배양 접시에서 PBS에서 셀을 제거 합니다. 빠르고, 원형 모션 접시, 접시 중간 하강 운동 뒤의 외부 주위에 먼저 요리에서 세포를 다쳤어요. 부드럽게 긁어 &#34; 시트 &#34; 연결 된 세포의. 부드럽게 얼음에 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 전송</li>
	<li>175 x g에 5 분 동안 원심 분리기와 4 ° C</li>
	<li>부드럽게 상쾌한 (SN)을 제거 하 고 펠 릿에 HB의 1-3 mL를 추가 합니다. 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 아래로 한 번 셀 resuspend 하.</li>
	<li>X g와 4 ° C. 부드럽게 제거 SN 1,355에서 7-10 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>셀 균질 수행. 
	참고: 조건 해야 부드러운 셀의 플라즈마 막 끊어집니다는 endosomes 그대로 남아 있도록 합니다.
	<li>추가 각 셀 펠 릿 (약 100 μ 셀 펠 릿 당)에 protease 억제제와 HB의 알려진된 볼륨 <ol>. 사용 하 여 1000 µ L micropipette, 부드럽게 플라스틱 아래로 셀 resuspended 때까지. 안 함 공기 방울을 소개.</li>
		<li>1 mL 투베르쿨린 주사기 22 G 바늘 HB와 미리 씻어 서와 공기 또는 거품의 무료 준비.</li>
		<li>주사기 셀 서 스 펜 션 상대적으로 천천히 ()을 피하기 위해 공기 방울을 만드는, 튜브의 벽에 바늘의 경사진된 끝 배치를 신속 하 게 연결 된 셀의 플라즈마 막에서 전단에 세포 현 탁 액을 추방.</li>
		<li>는 Homogenate (약 3 µ L)의 작은 약 수를가지고 고 유리 슬라이드에 HB의 50 µ L로 희석. 혼합 그리고 덮개 유리 coverslip로. Homogenate X 20 또는 40 X 목표 단계 대조 현미경 검사. 
		참고: 최적의 조건에서 대부분의 세포는 고장, 하지만 핵, 어두운 회색으로 표시 하 고 라운드 구조, ( 그림 1).</li>
		<li>반복 단계 3.7.3 대부분 셀까지 3.7.4 깨집니다; 일반적으로 3-6는 바늘을 통해 위아래 선 필요 하다. 단백질 결정에 대 한 homogenate의 작은 약 수 (10-30 µ L) 유지.</li>
	</ol></li> <li>1,355 g x 4에서 7 분 동안 원심 분리기 homogenate ° c. 
	참고: 후 원심 분리, 펠 릿 (핵 펠 릿;로 정의 핵 및 (postnuclear 상쾌한;으로 정의 하는 상쾌한 NP) 포함 PNS)는 cytosol와 균질 그리고 무료에 출시 세포 포함.</li>
	<li>신중 하 게 PNS를 수집합니다. 단백질을 위한 PNS와 NP의 작은 aliquots (10-30 µ L)를 유지 하 고 삭제는 NP.</li>
	<li>는 PNS PNS:62% 자당의 1:1.1 비율을 사용 하 여 함께 62% 자당 해결책을 diluting 하 여 40.6% 자당을 PNS를 조정 합니다. 공기 거품을 만들지 않고 부드럽게 하지만, 철저 하 게 혼합. 자당 농도 굴절 계를 사용 하 여 확인 하십시오.</li>
	<li>는 Ultracentrifugation 튜브의 하단에 40.6% 자당에서 PNS를 놓습니다. 신중 하 게 35% 자당 해결책의 2.5 mL와 오버레이 및 HB 원심 분리기 튜브 채울. 
	참고: 인터페이스는 명확 하 게 볼 수 있도록 계층 되어야 한다 자당 솔루션.</li>
	<li>Ultracentrifuge ̴165, 000 x g 4에서 1 시간에 대 한 그라디언트 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 지질 그라데이션 위에 흰색 레이어를 제거합니다. 다음, HB와 200 μ micropipette 컷된 팁을 사용 하 여 35% 자당 사이 endosomes를 포함 하는 인터페이스를 수집. 
	참고: endosomal 분수 체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>PNS와 endosomal 분수의 단백질 농도 결정. 
	참고:이 농도 적어도 100 µ g/mL 해야 합니다. 적어도 100 µ g/mL와 PNS를 약 2.5 x 10 7 셀 2 페 트리 접시에 성장 필요 (위의 참고 참조).</li>
</ol> 4. Cytosol 준비 참고: 준비 2 접시 (10 cm 직경; 57 cm 2) 시작 물자로 confluent HeLa 세포의. 필요할 때는 cytosol 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심 wildtype 또는 관심사의 단백질의 돌연변이 형태를 overexpressing의 단백질의 고갈에서 준비 또한 수 있습니다. Endosome 분별 프로토콜에 관해서는 얼음에 모든 단계를 수행
<ol><li>반복 단계 3.1-3.8.</li>
	<li>PNS는 원심 분리기와 ultracentrifuge ̴250, 000 x g, 4 시 45 분에 대 한 배치 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 위에 흰색 레이어를 제거 하 고 microsome 펠 렛을 방해 하지 않고 SN (cytosol 분수)를 수집 합니다. 단백질을 위한 cytosol 분수의 약 수를 유지. 
	참고:는 cytosol 생체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>는 cytosol의 단백질 농도 결정. 
	참고: 3 mg/mL 이상 이어야 한다.</li>
</ol> 5. 시험 측정 Endosome 종속 말라 합 체 외에서 참고: Endosome 종속 말라 합 두 가지 대체 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 접근 방법에서 자료는 테스트 튜브에 혼합, 고정 및는 coverslip로 전송 하며 분석 여기서 설명 하는 두 번째 방법은에서 분석 결과 수 이미징 챔버에 직접 실시 하 고 고정 고 기계적 섭 동 ( 그림 2C) 없이 분석. 이 두 번째 방법에서는, 분석 결과 혼합 하는 coverslip 테스트 튜브에서 전송 되지 않습니다 그리고 이렇게 교란, F-말라 네트워크 전송 하는 동안 물리적으로 교란 되 고의 위험을 감소 남아 있습니다. 또한,이 두 번째 방법은 F 걸 중의 시간 경과 분석와 호환 됩니다. 어느 방식으로 F-말라 합 분석에 차이가 관찰 했다에 주목 한다. 
참고: 사용 하 여 잘라 프로토콜에 걸쳐 팁.
<ol>에 테스트 튜브에 <ol><li>부드럽게 혼합 차가운 순화 GFP RAB5 endosomes (3 단계)는 얼음 처럼 차가운 1.5 mL 원뿔 테스트 튜브에 (단백질 농도)를 1시 10분의 비율로 cytosol (4 단계)와 <li>. 
		참고: 일반적인 실험은 실시 약 40-50 µ L.</li>
		<li>125 m m KCl (1 개 M KCl 재고 솔루션을 사용 하 여), 12.5 mM Hepes, 및 1.5 m m MgOAc 2 (재고 솔루션 x 50를 사용 하 여)의 최종 농도에 얼음 처럼 차가운 반응 혼합물을 조정 합니다. 다음, 10 m m leupeptin, 1 m m pepstatin, 그리고 10 ng/mL aprotinin의 최종 농도 protease 억제제와 혼합을 조정 합니다. 모든 구성 요소를 부드럽게 혼합.</li>
		<li>테스트 튜브 없이 떨고, 37 ° C에서 반응 혼합물을 포함 하 고 원하는 시간에 품 어. 
		참고: 일반적으로, 그것을 감지 말라 합 endosomes와 광범위 한 네트워크의 형성에 대 일 분에 약 3 분.</li>
		<li>원하는 시간에 (즉, 3 분 또는 30 분), 얼음에 테스트 튜브를 배치 하 여 반응을 중지 하 고 precooled 3 %PFA 솔루션의 1/10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>Polymerized 말라 얼룩 레드 오렌지 염색에 활용 된 200 단위/mL (~6.6 μ M) phalloidin의 0.3:10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>12에 혼합물의 장소 12 μ μ 마이크로 유리 슬라이드에 PVA 장착 매체의. 18 x 18 m m 2 유리 coverslipon 상단에 넣어.</li>
		<li>Confocal 현미경 검사 법으로 샘플 분석.</li>
	</ol></li> <li>이미징 챔버에 <ol><li>현미경 이미징 챔버를 사용 플라즈마 청소기 1 분 라운드 18 m m 직경 coverslip 및 라운드 35 m m 직경 20 m m 유리 바닥을 갖춘 페 트리 접시를 청소 (0.16 0.19 m m).</li>
		<li>1% β-카 세 인 단백질 바인딩 유리를 최소화 하기 위해 20 분에 있는 청소 표면 품 어. 3mm 이미와 두 번 세척.</li>
		<li>추가 endosome 고 cytosol, 같은 단계 5.1.1, 5.1.2, precooled 1.5 mL 테스트 튜브에서 혼합물 분석 결과 분석 결과 혼합물 0.1 μ g/μ rhodamine-걸을 보완.</li>
		<li>최종 굴절률 1.375 (26.5% 자당) 혼합물의 39% 자당 해결책을 사용 하 여 조정. 
		참고: 일반적으로, 동일한 볼륨 추가 됩니다; 그러나, 이것은 경험적으로 다시 자당 농도 약간 실험에서 실험을 변경 될 수 있습니다 이후는 refractomer를 사용 하 여 결정 하는 수집 된 분수의 자당 농도에 따라 조정 되어야 합니다.</li>
		<li>청소용된 35 m m 접시 (5.2.1 단계)에 혼합물을 놓고 청소용된 18 m m coverslip (5.2.1 단계)으로 커버.</li>
		<li>동요 없이 37 ° C에서 챔버 장소.</li>
		<li>형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 샘플 분석.</li>
	</ol></li></ol> 6. 이미지 Acquisition 및 분석의 말라 네트워크 <ol><li>이미지 수집 <ol><li>거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집. 
		참고: 이미지 수집 설정 63 X 1.25 나 오일 목적으로 거꾸로 스캔 confocal 현미경에 최적화 했다. 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 레이저 전원 (일반적으로 약 50%)을 조정.</li>
	</ol></li> <li>말라 네트워크의 정량화 <ol><li>형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
		<ol><li>먼저, GFP RAB5 신호를 사용 하 여 기본 개체 endosomes 식별. 그런 다음 F-말라 말라 신호 전파를 사용 하 여 개별 endosomes와 관련 된 계량 (레드 오렌지 염색 활용 Phalloidin) 보조 개체로.</li>
			<li>평균 제어 조건에 각 개체에 대 한 관련된 자료의 수를 정규화.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system.">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9,,1115쪽으로 다운스트림 전송 방지 합니다. 특히, 우리는 초기 endosomes에 F-말라 합의 순차적 단계를 분석 하 고 특성을 분자 수준에서 과정을 설명한 분석 결과 사용 합니다.
이 실험에서 초기 endosomes vivo에서GFP-RAB5로 표시, subcellular 분류에 의해 순화 되며 알을 품을 수 있도록 F-말라 중 합에서 체 외에cytosol 존재 테스트 튜브에. 원하는 시간에 반응 중지 되 고 반응 혼합물 분석에 대 한 현미경 슬라이드에 형광 현미경 검사 법, F-말라를 phalloidin를 사용 하 여 전송 됩니다. 이 실험적인 전략을 사용 하 여, 우리는 annexin a 2는 SPIRE1, 함께 초기 endosomes에 F 걸의 nucleation에 필요한 예상 대로 ARP2/3 F-말라 분기, 중재 하는 동안 보였다. 우리는 또한 moesin 및 cortactin는 중재 ECV/MVB 속 및 포유류 세포9,11의 저하 통로 성숙 F 말라 네트워크의 형성에 필요한 것을 보여주었다.
Ectopically 표현된 RAB5의 낮은 수준 팬 들은 어떤 뜻깊은 넓이10endosomes의 정보를 변경 하지 않습니다, 하지만이 작은 GTPase는 초기 endosome 막 역학16,17의 키 레 귤 레이 터에에서 유지 하는 것이 중요 하다 . 일부 실험에 따라서 라벨 endosomes 대체 프로토콜을 사용 하 여 분석 결과에서 적절 한 수 있습니다. 예를 들어 초기 endosomes 수 있습니다 편리 하 게 표시 표 피 성장 인자 또는 처리가4,14같은 endocytosed 형광 추적기를 사용 하 여.
또한 그것은 기술적으로 어려운 전통적인 confocal 현미경 검사 법으로 이미지 개별 걸 필 라 멘 트에 주목 한다. 따라서, 우리는 endosomes에 말라 네트워크를 설명 하는 텍스트에 걸쳐 F 걸 구조를 참조 하십시오. 결과적으로, 우리는 F-말라 네트워크의 형성 수 있습니다 그들의 강도 보다는 네트워크의 형광 표면적을 측정 하 여 보다 정확 하 게 측정할 수 느낀다.
그것은 완전히 말라 nucleation 활동은 체 외에 어떤 다른 구조 또는 정화 하는 동안 RAB5 endosomes에 바인딩된 남아 있는 세포 기관이 중재 관찰 하는 가능성을 배제 하기 쉽지 않다. 그러나, 이러한 오염을 매우 가능성이 크다. 반면 일부 세포 공동 그라디언트에 비슷한 물리적 특성 때문에 정화, 정화 후 서로 양적 바인딩된 남아 경향이 하지. 또한, 말라 nucleation 활동은 엄격 하 게는 RAB514를 포함 하는 초기 endosomes에 A24,14, annexin에 따라 다릅니다. 마지막으로, 우리는 F-말라 구조 연관 된 선택적으로 RAB5 endosomes에서 vivo에서 및 다른 endosomes에 또는 다른 세포 막4,14에서 찾을 수 없는 찾을. 결론적으로, 말라 nucleation 활동 이후이 정화 공동 활동과 공동으로 RAB5 endosomes localizes RAB5 endosomes와 관련 된 가장 가능성이 높습니다.
이 분석 결과에 훨씬 같은 복잡 한 생 화 확 적인 반응을 endosomes16 또는 다른 막18 의 역학 테스트 튜브에서 수행 되는 컨트롤을 다시 구성 하는 다른 분석 실험에서는 되도록 준비 하는 것이 중요 세포 추출의 최적입니다. 세포는 부드러운 조건 endosomes 및 다른 세포, 특히 핵와 리소좀에 손상을 제한 하에서 무 균 한다. 또한, endosome 분수 삼 투 이온 스트레스 뿐만 아니라 자연 스러운 걸 합을 최소화 하는 조건 하에서 얼음에 보관 한다. Endosome 분수 (≥0.1 mg/mL)와 cytosol (≥3 mg/mL)의 추가, 상대적으로 높은 농도에 대해서는 endosomes 및 탐지, 3.13, 4.4, 단계에 표시 된 적절 한 F-말라 합 각각. 유사 하 게, 1:10 시험을 수행 하는 것이 중요 하다 cytosol (단백질: 단백질), 단계 5.1.1 같이 하 endosome의 비율. 마지막으로, 말라 합 (즉, PFA와 phalloidin 추가) 후 pipetting 할 수 매우 부드럽게 축소 또는 말라 네트워크 침입을 피하기 위해.
필요한 경우, 체 외에서 말라 합 분석 결과 또한 실시 될 수 있습니다 직접 현미경 분석 결과 혼합물 생산 말라 네트워크의 기계적 섭 제한 하에 정화 rhodamine 말라를 추가한 후 챔버, 이미징에 에 endosomes (단계 5.2.3 및 그림 2참조). 이 경우에, 그것은 최고의 조정 26.5% (0.85 M) 자당 (1.375 굴절 인덱스), 제한 확산을 추출 하 고 브라운 모션 (5.2.3 단계), 및 제거의 가능한 집계를 사용 하기 전에 ultracentrifugation 여 rhodamine 걸 정화. 우리의 관측 endosomes에 F-말라 네트워크의 형성을 제어 하는 그 moesin 완벽 하 게 우리의 분석 결과4,14이 대체 버전을 사용 하 여 지 했다.
테스트 튜브 또는 이미징 챔버, 우리의 프로토콜의 버전 F 걸 nucleation 글로벌 분석 합 endosomes에 최적입니다. 그러나, 그것은 일부 endosomes 움직이지 않기 때문에이 접근을 사용 하 여 시간을 통해 걸 중 합 과정을 따라 하기 쉬운. 따라서, 개별 필 라 멘 트의 그리고 이렇게 성장 모니터링 쉽지 않다 말라 네트워크의 역사를 확인. 예를 들어 F-말라 가교에서 분기를 구별할 수 어려울 수 있습니다. 그러나, 우리는 확신 F-말라 합 실시간으로 모니터링 하는 조건 endosomes를 무력화 하는 조건을 최적화 하 여 이미징 챔버에 향상 시킬 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 순화 된 구성 요소를 사용 하 여 인공 세포 막에서 F-말라 합 모니터링 흥미로울 것입니다. 사실, 우리가 이전 보여주었다는 F-말라 nucleation 및 중 합 바인딩 t 후 리에 발생할 수 있습니다.그는 nucleation liposome bilayer11에 annexin a 2 요소. 이 전략 더 특정 지질과 F 걸 nucleation 및 중 합 과정에서 단백질의 역할을 해 부하 고 endosomal 세포 막에는 F-말라 네트워크를 형성 하는 데 필요한 최소한의 구성 요소 특성화에 유용할 것 이다. 마지막으로, 우리는이 전략 유학 endosome 막, 특히 모집 및 동원 retromer/세척 기계에 발생 하는 다른 F-말라-종속 프로세스에 매우 도움이 될 것입니다 믿습니다.

높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.
말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.
여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1287">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:477px;">NaCl</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71380</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>196770010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424370025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesiun acetate tetrahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017101001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10253286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236624001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehide</td>
			<td>Polysciences. Inc</td>
			<td>380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 555 phalloidin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actin rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton. Inc</td>
			<td>APHR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DABCO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 0.22um</td>
			<td>Millex&#160;</td>
			<td>SL6V033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Round 10cm dishes for cell culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>569/3 40569003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-ml polypropylen tube&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hypodermic Needle 22G Black 30mm&#160;</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro glass slides&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>2406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18X18-mm glass coverslip</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1000/1818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200-&#956;l yellow tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1000-&#956;l Blue Graduated Tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5-ml test tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C 311-04-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18-mm diameter round coverslip&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1001/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19&#160;mm)&#160;</td>
			<td>In vitro Scientific</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>79729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>TL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>335649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>346936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fugene HD transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:145px;">E2311</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent A</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent B</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent S</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Meter 691</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NIH, Bethesda MD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.

초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 의해 중단 됐다. 샘플 수집 그리고 현미경 슬라이드에 입금 했다. 마지막으로, F 걸 phalloidin (그림 3A)으로 밝혀졌다. 다음 중 합 과정 뿐만 아니라 초기 endosomal 막에 F 걸의 nucleation 급속 하 게 발생 했습니다. 실제로, F 걸 수 이미 구상 될 endosomes 1 분 이내에 반응 (그림 3A)의 시작 후.  처음 짧은 했다,이 말라 구조는 급속 하 게 분기 길고 걸 필 라 멘 트 (그림 3A), 아마도 불균형된 말라 역동성 생체 외에서 반영에의 한 네트워크의 형성에 지도 한 다른 연결 된 되었다. 유사한 nucleation 및 중 합 속도 분석 결과 셀 cytosol 뿐만 아니라 순화 rhodamine 표시 된 걸으로 실시 되었다 때 관찰 되었다. 이 구조를 직접, 어떤 섭 동 (그림 3B)의 부재에 이미지로 수 있도록 유리 바닥 요리에서 이루어졌다. 여기서 설명 하는 분석 결과에서 초기 endosomes nucleate 드 노 보 걸 합 선택적으로. 실제로, 생체 외에서 반응 endosomes 또는 cytosol의 부재에서 수행 되었다 말라 합 발생 하지 않았다. 따라서 초기 endosomes nucleation 고 걸 필 라 멘 트9,11의 연속적인 합을 지원 하기 위해 기본 능력을 보유 결론 수 있습니다.
말라 endosomes에서 생산의 양을 분석, 이미지에 서로 다른 시간에 인수 CellProfiler (그림 4A)를 사용 하 여 분석 되었다. 말라 endosome 당 생산 금액 말라 단일 초기 endosome 주변 지역으로 측정 했다. 말라 중 합 속도 프로세스의 시작 부분에서 더 높은 고 시간 (그림 4B) 감소.  말라 네트워크 반응 시작 후 초기 시간 포인트에서 좀 더 자세하게에서 분석 수 있습니다. 이러한 초기 시간 지점에서 개별 말라 포함 된 구조 수 수 아직도 분화 될 서로에서. 말라 네트워크의 복잡 한 조직, 평가 하기 위해 각 endosome에서 나오는 걸 필 라 멘 트의 수 계산 되었다 (즉, 기본 필 라 멘 트). 마찬가지로, 모든 다른 걸 필 라 멘 트를 네트워크에서 식별 될 수 및 그 endosomes (에서 기 인하지 않았다 수 뿐만 아니라 기본 필 라 멘 트 (즉, 보조 필 라 멘 트)에서 발생 하는 걸 필 라 멘 트의 수 계산 했다 즉, 다른 필 라 멘 트) (그림 4C-E. 일단 걸 필 라 멘 트 추적, 다른 매개 변수를 개별 걸 필 라 멘 트와 같은 걸 필 라 멘 트에 연결 endosomes의 수의 길이 쉽게 될 수와 같은 계산 (4 층 그림).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig1.jpg"> 
그림 1: 단계 대조 현미경 사진 HeLa 세포 Homogenate의. 균질, 후 추출 현미경 슬라이드 사이 coverslip 탑재 했다. 게시에 대 한 현미경 기름 침수 후 100 X 목적으로 점령 했다. 그러나 일상적인 검사에 대 한, 세포 추출 물 20 X 또는 기름 침수 없이 40 X 목표 시각 이었다. homogenate의 높은 확대 보기의 두 가지 예 (A-B) 표시 됩니다. 핵 (별) 색상, 연결 된 셀 나머지 없이 라운드 구조 어두운 회색으로 표시 됩니다. 화살표는 특성의 립 세포 균질에 따라 발표 되 고 세포내 물질 (즉, 세포)에 해당 하는 다양 한 크기, 모양, 및 반투명, 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig2.jpg"> 
그림 2: 프로토콜의 도식 대표. Endosomal 추출 물 (A)과 cytosol 추출 (B)을 준비 하 고 말라 합 endosomes에서 생체 외에서 (C)에서 모니터링 하는 데 사용 되는 프로토콜의 개요 설명입니다. 상쾌한 (SN), 균질 버퍼 (HB), postnuclear 상쾌한 (PNS), 핵 펠 릿 (NP), 고 paraformaldehyde (PFA). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig3.jpg"> 
그림 3: Nucleation 및 F-말라 초기 Endosomes에 생체 외에서의 중 합. (A) Endosomes 헬러에서 정화 세포 표현 GFP-Rab5 (녹색) 및 헬러 cytosol 별도로 준비 했다. 분석 결과, 초기 endosomes (EEs) cytosol, 혼합 했다 고 혼합물은 알을 품는 표시에 대 한 시간. 혼합물 다음 고정, 레이블 F 걸을 (빨간색) phalloidin으로 표시 되었고 형광 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. 바: 10 µ m (맨 위 패널) 그리고 5 µ m (하단 패널). (B)에 스 헬러 세포 GFP-Rab5 (녹색)와 헬러 cytosol 별도로 준비에서 정화. 이러한 셀 추출 했다 제시 된에 대 한 정화 rhodamine-걸 (레드)와 알을 품을 현미경 실에서 시간 그리고 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 실험 A에서 수행 되었다. (EEs) 없이 헬러 cytosol 그리고 헬러 endosomes (그린) (cytosol) 없이 GFP-Rab5로 표시 별도로 incubated 했다 (왼쪽 및 가운데 패널) 또는 함께 (오른쪽 패널) 30 분, 고정, 레이블 F 걸을 phalloidin (레드)으로 표시 및 분석 형광 confocal 현미경 검사 법입니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig4.jpg"> 
그림 4: 말라 네트워크의 분석. (A) 워크플로 CellProfiler 분석의. (B) 수가 생산 말라 endosomes CellProfiler 소프트웨어를 사용 하 여 수를 감안 정량 했다. 데이터는 평균 ± s.e.m. (n = 3). 데이터는 ± 사 우 스 다코타 (n = 3). 15 분 대 5 분 (ns P= 0.0736), 5 분 30 분 대 (* P = 0.0195), 그리고 15 분 30 분 대 (ns P = 0.3129). (C)헬러 세포 표현 GFP Rab5 그리고 HeLa cytosol에서에서 정화 초기 endosomes (EEs) 별도로 준비 하 고 분석 결과 그림 2A에서 실시 되었다. 샘플 7 분 후 고정 했다. 중간 패널 같은 현미경 사진, F 걸 구조 ImageJ 소프트웨어의13 NeuronJ 플러그인 사용 하 여 그린의 흔적의 중복을 보여줍니다. 오른쪽 패널 추적만 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. F-말라의 (D) 표현 구조 ImageJ 소프트웨어 정량화에 사용 하는 번호 매기기 시퀀스. 말라 필 라 멘 트, C D에 정의 된 수의 (E) 정량화. 데이터는 ± 사 우 스 다코타 (n = 3). 보조 지점 대 기본 분기 (ns P = 0.5262), 다른 지점 대 보조 지점 (ns P 0.6815 =), 그리고 다른 분기 대 기본 분기 (ns P 0.2254 =). (F) F 걸의 길이 구조와 말라 구조 당에 스 수 C D에 정의 된 정량화와 분석 될 수 있다 보다 다른 매개 변수의 예제로 표시 됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

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8.9K 조회수.  University of Geneva. 초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.