We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the 'native' tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)의 레이저 어블 레이션 (PMMA)에 의해 생성 된 증기는 독성이있을 수있다. 레이저 조각사가 작동 환기 시스템에 연결되어 있는지 확인합니다. (, 보안경, 얼굴 마스크, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지 폐쇄 발가락 신발) 공학적 관리 (흄 후드, 예리한 컨테이너) 및 개인 보호 장비의 사용을 포함하여 마이크로 유체 장치를 구축 할 때 모든 적절한 안전 방법을 사용합니다. 그것은 가능한 분석 과정을 방해 오염 물질을 감소 ACS 등급 이상의 모든 존재와 함께, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 등급의 시약을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 미세 유동 장치의 제조 1 <ol><li> PMMA 마이크로 유체 플랫폼의 건설 <ol><li> 표준 PMMA 블록 (8.9 X 3.8 X 0.6 cm) 및 구 시약을 도입하기위한 proteo을 입력 채널을 레이저 어블 레이션-용해 챔버 및 레이저 조각기 (17), (18)를 이용하여 출력 채널. 주의 : 연장 된 타원형 (30 × 5 mm X 0.05)의 단백질 분해 챔버 에칭. 입력 및 출력 채널은 PMMA 블록의 단부까지 연장하고, GA (30) 모세관을 수용하기 위해 두 폭과 깊이보다 더 큰 75 μm의 없어야한다. </li><li> . 1/64 &quot;두께 차단 디스크와 회전 공구를 사용하여 약 10cm 각의 두 부분으로 30 GA 스테인레스 금속 모세관 컷 모세관의 단부 (이것은 아래 보면서 용이해진다 부드럽게 사포를 사용하여 광학 현미경). </li><li> 납땜 인두를 사용하여 에칭 된 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 블록으로 모세관 녹아. 입력 채널은 자동 주사기 펌프에 연결되며, 상기 출력 채널은 MS에 결합을 위해 사용될 것이다. </li></ol></li><li> 연속 흐름 시간 해결 운동 믹서의 건설 <ol><li> 융합을 구합니다석영 유리 모세관 (ID : 75 μm의, OD 150 μm의) 약 40cm의 약 15cm의 28 GA 스테인레스 금속 모세관 삽입. 필요한 반응 시간에 따라, 더 큰 ID와 장기간 외부 금속 또는 모세관을 사용한다. 주 : 금속 모세관의 &#39;참&#39;내경을 결정하는 정확한 반응 시간을 얻기 위해 중요하다. 이것은 비록 용매 모세관 유동 및 후방 압력, 레코딩 HPLC에 금속 모세관을 부착시킴으로써 이루어질 수있다. 내경 계산에 배압이 이루어질 수 있으며, 금속 모세관의 실제의 내경이 결정. 이것은 (윈도우 버전 6.49의 경우) 분자량 계산기 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 내측 유리 모세관의 일단에 저출력의 레이저 조각기를 이용하여 설정 2mm 노치 생산 내측 유리 모세관 (도 2)의 단부를 밀봉. 또한, 세라믹 유리 capillar를 사용하여 노치을Y 커터 공구 나 미세 절단 날과 회전 분쇄기. </li><li> 라인업 금속 모세관의 끝 부분과 상기 내부 유리 모세관 (이는 광 현미경에 의해 용이하게 볼 수있다). </li><li> 믹싱 티의 일단 (도 2)이 부착 운동 믹서. </li><li> 믹싱 티 운동 혼합기의 반대쪽에 약 40cm의 (가 150㎛ : 75 μm의, OD ID) 융합 된 석영 유리 모세관을 첨부. 이러한 반응을 종결 산 (5 % 아세트산의 pH 2.4)을 제공하기 위해 사용된다. 주의 : 반응물 자동 주입 펌프를 사용하여 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브를 통해 기밀 주사기로 장치에 공급된다. </li></ol></li><li> 펩신의 활성화 <ol><li> 돼지의 위 점막에서 20mg의 펩신을 달아 결합 완충액 (0.1 M 인산 나트륨, 0.15 M 염화나트륨, pH를 6.0) 1 ㎖에 중단. </li><li> N 개의 -hydroxysuccinimide (NHS) 부활 아가 로스 비드 50 mg의 체중을 재들에 추가uspended 프로테아제 부드럽게 밤새 4 ℃로 회전한다. </li><li> 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 언 바운드 단백질 분해 효소를 대기음. </li><li> 버퍼 (1 M 트리스 -HCl, pH를 6.0) 차단를 1ml 아가 로스를 인큐베이션하고 1 시간 동안 실온에서 부드럽게 회전한다. </li><li> 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 블로킹 버퍼 대기음. </li><li> 1 mL의 5 % 아세트산, 5 분 동안 pH를 2.4 펩신 아가 로스 부화. </li><li> 수지를 수집하기 위해 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 세 세척의 총 1.3.10 - 반복 1.3.8 단계를 반복합니다. </li><li> 장시간 사용을 위해 4 ℃에서 1 mL의 아세트산 비드를 저장한다. </li></ol></li><li> 장치 조립 <ol><li> 멸균 주걱을 사용하여 5 % 아세트산 펩신 활성 아가 로스 비드 슬러리와 단백질 분해 챔버를 채운다. </li><li> PMMA 마이크로 유체 platfor 배치장치를 밀봉하는 덮개와 같은 두 개의 빈 PMMA 블록 사이에서 m은 액밀 시일을 만드는 실리콘 고무 늘어서. </li><li> 압력 실에 장치를 금속 클램핑 플레이트를 사용한다. 주 : 클램프 맞춤 미세 유체 플랫폼을 맞추기 위해 제출되었다 10.1 cm X 7.4 cm X 1.2 cm 측정 개의 플레이트로 구성되어있다. </li><li> 10 μL / 분의 속도로 5 % 아세트산, pH가 2.4를 흐른다. 1 μL / 분의 속도로 단백질 라인 비록의 50 mM 아세트산 암모늄 완충액 (pH 6.9)을 흐른다. 주 : 아세트산 연속적 실험 전체에 걸쳐 디바이스를 통해 흐르는 것이 매우 중요하다. 거기에는 누설이없는 그 유체 ESI 소스 역할을한다 출력 채널에서만 종료되었는지 확인. </li><li> 몇 일렉트로 최적 조건을 달성하기 위해 조절 가능한 절연 스테이지를 사용하여 개질 중극 비행 시간 형 (Q-TOF) 질량 분광기의 선단부에 장치. 참고 : 바이 패스 스위치상업 ESI 소스의 존재를 시뮬레이션하기 위해 도입된다. (17) </li></ol></li></ol> 2. 시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 <ol><li> 펩신의 수집 및 단백질 만 스펙트럼 주 : ESI-MS 취득 60 V 디 클러스터링 전위에 5,000 4,500의 전압 양이온 모드에서 수행되며, 250 V 전위 집중. 스펙트럼은 (1 개) (S)의 주사 속도 350-1,500 m / z 범위에 걸쳐 취득 -1. <ol><li> 펩신 유일한 스펙트럼을 획득. 단백질이 추가되면이 스펙트럼에서 나타나는 모든 피크가 감산된다. </li><li> 50 mM의 아세트산 암모늄 완충액 이전 흘렀다 1 μL / 분의 속도로 50 ~ 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질 (19 정화 앞서 설명한 제조 13) 소개. </li><li> 단백질 만 스펙트럼을 획득. </li></ol></li><li> 취득 오F 시간 포인트 <ol><li> 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질은 1 μL / 분으로 흐르는 동안, 티 커넥터를 통해 3 μL / 분의 속도로 D O 2를 도입하고 운동 믹서에서 반응 할 수있다. 스펙트럼의 취득 전에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템. 음표 : 교환 후, 라벨링 반응 표지 단백질의 10 μL / 분으로 아세트산의 pH 2.4의 흐름과 절단에 의해 급냉된다 단백질 분해 챔버 내에서 발생한다. </li><li> 수동 레이블 시간을 증가 8의 42 밀리 초의 시간 혼합 달성 내측 유리 모세관의 위치를 ​​위로 끌어하기 위하여. 각 풀 - 백 사이에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 및 통계 분석 <ol><li> 펩티드를 확인하고 중수소 교환의 비율을 계산 <ol><li> , MS 스펙트럼 mMass 소프트웨어를 사용하여 분석 버전 5.5.0 (20)를 수행 </suP&gt;. </li><li> ExPASy FindPept 단백체 서버를 사용하여 펩티드를 확인하고 (21)을 필요한 경우 충돌 - 유도 해리 (CID)에 의해 확인한다. 참고 : 여기, 중수소 흡수 통합은 동위 원소 분포 분석 (22), (23)에 대한 자체 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. </li><li> 구체 웹 도구 (22, 24)를 사용하여 기본 시퀀스에 기초하여 이론적 극한 요금을 계산한다. </li><li> 단일 지수 비선형 회귀를 사용하여 데이터를 장착하고, 그래프와 통계 소프트웨어 (예 SigmaPlot)를 이용하여 정규화. 주 : 비율 K INT / K OBS 보호 인자 (PF)의 특정 영역은 상기 입체 앙상블 내의 구조화 정도 반 정량적 측정 값을 산출한다. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes.">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li></ol>

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그들이 단백질의 매우 상세한 구조를 제공하기 때문에 이러한 X 선 결정학 및 NMR 구조 생물학 등의 방법이 유리하지만, 이러한 이미지들은 정적이다. 과도 종과 약하게 구조화 된 도메인의 특성은 이러한 기존의 방법으로 공부하면 어려운되고 있습니다. 따라서, 이러한 유형의 시스템에 동적 통찰력을 얻기 위해이 빠른 시간 규모에서 일을하는 것이 중요합니다. 우리는 성공적으로 지역화 된 펩타이드 수준에서 잘 연구 된 IDP 내에서 발생하는 구조적 변화에 대한 자세한 통찰력을 얻기 위해 TRESI - HDX-MS를 적용했습니다. 이 기술의 핵심 한계 중 하나는 펩신은 불특정 프로테아제라고하고, 그 자체에, 거의 전체 시퀀스 범위를 생성하지 않습니다. 순서 범위와 특이성을 개선하는 데 도움이하는 한 가지 방법은 소화 챔버 (26)에 아스 페르 길 루스 saitoi에서 단백질 분해 효소 타입 XIII을 결합하는 것입니다. 그것은이 중요하다소화 챔버 효과적으로 교환 반응을 종결하고 다시 교환 (11)의 양을 줄이기 위하여 전체 실험 동안 2.4의 pH에서 유지된다. 어떤 단백질 분해 단계와 이후의 분석은 가능한 한 빨리 수행하는 것이 필수적이다. 이전 연구는 소화 챔버의 크기를 최적화하고 실온 (22)에서 무시할 수준 (≤5 %)으로 다시 교환의 수준을 유지하기 위해 유량을 제안했다. 강력 챔버의 크기가이 프로토콜 내에서 나열된 크기보다 더 큰없는 것이 좋습니다. 고도로 구조화 된 단백질은 두 번째 규모로 밀리 초에 중수소의 상당한 수준을 차지하지 않습니다와 단백질 분해 챔버에 의해 허용 된 시간에 소화하기 어려울 것이다. 이러한 단백질은이 기술을 사용하여 연구를하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 t 용의 50 mM 아세트산 암모늄 완충액 (pH 6.9)의 사용을 권장하지만그는 단백질 샘플은, 모든 단백질이 농도 또는 pH 값과 호환됩니다. 이 단백질의 등전점을 기록하고 버퍼 따라서 위 또는 아래에 적어도 하나의 pH 단위로 조절하는 것이 중요하다. 이 단백질이 적절한 폴딩에 필요한 필수 표면 전하를 가지고 있는지 확인하고 응집을 방지 할 수 있습니다. 아세트산 암모늄의 농도가 증가하는 것은 그러나 밀리미터 피해야하는 500 이상의 농도, 용해도를 증가시키기 위해 단백질 응집 경향이 권장된다. TRESI-HDX-MS는 가장 큰 루프 영역, 용융 된 구체 또는 과도 이차 구조 요소 (22)로 이루어지는 시스템에 적용된다. 간단하고 구현하기가 상대적으로 저렴로 또한,이 기술에 대한 다양한 경제적 이점이있다. 최근 약물 발견 및 개발 (27)에 대한 제약 업계의 HDX-MS의 사용이 급증되고있다. 지난 몇 십 년간생체 고분자의 급속한 성장이 있었다 S, 특히 단일 클론 항체 (단클론 항체)는, FDA에 의해 승인된다. 소분자 약물에 비해, 더 높은 차수의 단백질 구조와 그들의 구조적 역학 약효의 결정에 큰 역할을한다. HDX-MS 성공적 밀러 항체 (28)의 제조를위한 확인 도구뿐만 아니라, 항체 - 항원 29, 30, 31, 및 단백질 - 리간드 상호 작용 (32)의 특성으로서 사용되어왔다. 소프트웨어 개발 및 실험 자동화의 발전은 가까운 장래에이 기술의 추가 확장을 가능하게 분석 시간을 단축합니다.

지난 몇 년 동안 상당한 발전 단백질 구조와 역학 1, 2, 3, 4를 측정하기위한 분석 기술의 개발되었습니다. X 선 결정학은 단백질 구조를 결정하기위한 원리 공구 유지하는 동안, 단백질의 고농도가 필요하다 광범위한 최적화 회절 품질의 결정을 제조 할 필요가있다. 이러한 막과 본질적으로 연관된 장애 단백질로서 결정화하기 어려운 단백질, 고전 수소 - 중수소 교환 (HDX) NMR (5)에 의해 연구되었다. 그러나 최근 수십 년간, HDX에 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)의 커플 링은 빠르게 인기 6, 7 얻고있다. 질량 분석은 솔루션을 제공합니다X 선 결정학 및 NMR로 인한 제약 사항에. 특히, MS는 매우 민감한 (필수 μM 농도로 ㎚)이고, 단백질의 크기에는 제한이 거의 없다. 또한, MS 분석의 높은 듀티 사이클은 효소 회전율, 미스 폴딩, 복합체 및 기타 중요한 생물학적 과정을 겪는다 같은 단백질 연구의 가능성을 허용한다. 이러한 프로세스는 종종 두 번째 규모로 밀리 초에서 발생 및 분석에 앞서 시약의 신속한 혼합이 필요합니다. 2003 허용 반응에서 윌슨과 Konermann 소요 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 (TRESI)의 개발은 ESI-MS에 의한 의사 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 이들의 설정은 계속 조정 가능한 반응 실 용적 8 모세관 믹서로 통합된다. 장치는 좁은 상호 capillar 내 혼합을 허용하도록 밀봉 내부 모세관의 측면으로 잘라 노치 두 동심 모세관 이루어져내부 모세관 (일반적으로 2mm)의 단부에 절 결부의 공간 Y. HDX 실험에 적용 할 때, 상기 내부 모세관 관심 단백질을 운반 외측 모세관 표지 D를 다음 ESI로 직접 전송하기 전에 HDX 라벨링 있도록 조절 반응 챔버로 들어가기 전에 단백질과 혼합 겪는다 2 O 용액을 운반 출처. 간단히, HDX 용액 9, 10 중수소 원자 교환을 진행 백본 아미드 수소에 의존한다. 교환은 염기 - 촉매 생리적 pH에서, 산 촉매는 약 2.6 이하의 pH에서 함께 널리 사용되고있다. 산도, 온도, 용매 접근성과 분자간 수소 결합 : 교환 율은 네 가지 요인에 기초한다. 이전의 두 가지 요인이 실험 특히 펩티드 백본 아미드 위치에서의 환율에 걸쳐 일정하게 유지되기 때문에, 우선적 인 dependen단백질 구조 (11)에 t. 밀접 루프와 무질서 영역 (때때로 전혀) (12)에 비해 실질적으로 느린 속도로 중수소 소요될 것이다 α 나선과 β-시트 광범위한 안정된 수소 결합 네트워크 영역으로 접혀. 이 글로벌 단백질 분석을 가능 여기서 구조 섭동 (예., 응집 또는 기질 결합시) 중수소 흡수 (도 1)에 다른 리드. 운동 모세관 믹서 중수소 흡수 제이션을위한 단백질 분해 챔버를 포함하는 미세 유체 플랫폼으로 통합 될 수있다. 이러한 단백질 분해 챔버 효과적으로 교환 반응을 급냉시키기 위해 낮은 pH로 유지하고, 지역화 된 펩티드 (도 2)로 단백질을 소화하기 위해 고정화 산 프로테아제를 필요로한다. 두 번째 시간 규모에 밀리 초에서 모니터링 백본 교환은 특히 중요하다어려운 내 구조적 변화 특성 루프 영역, 용융 구체와 본질적으로 무질서 단백질 (실향민) (13) (14)을 특성화한다. 대안 적으로, TRESI-HDX 또한 COREX 알고리즘 (DX-COREX) 방법 (15, 16)에 결합 된 중수소 교환을 이용하여, 현재 X 선 결정학 및 NMR의 방법을 통해 해결할 원자 구조를 갖고 있지 않은 단백질을 특성화하는데 사용될 수있다. 이 상세한 프로토콜은 병원성 hyperphosphorylated 상태입니다으로 모두가 기본 형태뿐만 아니라의에, 타우, 실향민을 연구하기 위해 TRESI - HDX을 적용합니다. 기본 타우가 가장 잘 연구 실향민 중 하나이지만, 약간은 아밀로이드 대응 (13)에 대한 알려져있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:244px;">Poly(methyl methacrylate) or PMMA</td>
			<td style="width:136px;">Professional Plastics</td>
			<td style="width:145px;">SACR.250CCP</td>
			<td style="width:159px;">8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Fused Silica Glass Capillary</td>
			<td style="width:136px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:145px;">106815-0018</td>
			<td style="width:159px;">ID: 75&#181;m, OD: 150&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Metal Capillaries</td>
			<td style="width:136px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">28 ga &#8211; 89875K97 
			30 ga&#160; - 89875K99</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">1477 
			1548</td>
			<td style="width:159px;">ID: 0.007&#8221;, OD: 1/16&#8221; 
			ID: 0.020&#8221;, OD: 1/16&#8221;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Standard Polymer Tubing Cutter</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">A-327</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; and 1/8&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micro Static Mixing Tee</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">M-540</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">or</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore</td>
			<td style="width:136px;">Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td>
			<td style="width:145px;">ZT1C</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PEEK Tee for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-727</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 Female to Female Luer</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-659</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 PEEK Double-Winged Nut</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-300</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ferrule for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-142</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">100 Series Rotary Tool</td>
			<td style="width:136px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">F013010001</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cut-Off Discs</td>
			<td style="width:136px;">Jobmate</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;">1/64&#8221; thickness</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stereomaster Digital Zoom Microscope</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-563-411</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Soldering Iron</td>
			<td style="width:136px;">Mastercraft</td>
			<td style="width:145px;">58-6301-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">VersaLaser</td>
			<td style="width:136px;">Universal Laser</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Syringes</td>
			<td style="width:136px;">Hamilton</td>
			<td style="width:145px;">81220</td>
			<td style="width:159px;">500&#181;L capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe Pumps</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:145px;">70-4501</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Reagents</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NHS-Activated Agarose</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">26196</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">P6887-250MG</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">151882-10X0.6ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">695092-100ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">HPLC Grade Water</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">W5-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7330-500G</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Phosphate</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S671-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Software/Online Tools</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">CorelDraw X3</td>
			<td style="width:136px;">Corel</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Molecular Weight Calculator</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 6.49</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">mMass</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 5.5.0</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">ExPASy FindPept</td>
			<td style="width:136px;">Swiss Institute of Bioinformatics</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SigmaPlot</td>
			<td style="width:136px;">Systat Software</td>
			<td style="width:145px;">Version 11.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PyMOL</td>
			<td style="width:136px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:145px;">Version 1.5.0.4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:136px;">AB SCIEX</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics

본질적으로 무질서 단백질 (실향민) 길이 때문에 안정적인 이차 구조 요소의 부족 구조적 생물 학자에 도전하고있다. 수소 - 중수소 빠른 시간 척도로 측정 교환 (HDX)는 네이티브 앙상블 일시적인 이형태 체의 특성을 허용 간단히 채워진 구조와 수소 결합 네트워크를 검출하는 고유 적합하다. 질량 분석에 HDX의 커플 링은 높은 감도, 낮은 샘플 소비와 단백질의 크기에 제한을 포함하여 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 이 기술은 밀리 초 시간 규모 HDX 라벨 시간을 모니터링 할 수있는 기능을 포함하여, 지난 몇 년간 크게 발전했다. 또한, 산성 프로테아제 마이크로 리액터 하우징 미세 유체 플랫폼 상 HDX 흐름을 도입함으로써, 우리는 펩타이드 레벨에서의 동적 속성을 지역화 할 수있다. 본 연구에서는 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 질량 분석법 (TRESI-MS)는 HDX의 WA 결합S는 타우 단백질에 잔여 구조의 상세한 그림뿐만 아니라 과인산에 유도 된 형태 적 변화를 제공하기 위해 사용된다.

네이티브 및 인산화 타우 분해 프로파일이 각각 77.1과 71.7 %의 서열 커버리지를 수득 유사 하였다. 펩타이드 중수소 흡수 값은 사내 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 생성 된 이론적 인 분포로 관찰 동위 원소 분포를 피팅하여 구 하였다. 최상의 결합 분포 연관된 중수소 흡수 값과 함께 (도 3a)을 나타낸다. 통풍 운동 프로파일은 생성되고, 또한 하나의 지수 표현에 의해 설명되었다. 3 개 이상의 라벨 항상 관찰 모든 펩티드 운동 프로파일 (N = 3)를 분석 하였다. 관찰 된 흡수 값이 단일 지수 맞는 각 펩타이드 환율 상수 K 흑요석을 얻었다. 이것은 기본 시퀀스 종속 &quot;랜덤 코일&quot;고유 속도 상수 k 값 INT 비교된다. 계산 된 PF (INT K / K &lt;/ 1.52 S에서 EM&gt; OBS)은 네이티브 및 hyperphosphorylated 타우 (도 4)의 대표적인 구조에 매핑된다. 예상 한 바와 같이, PF에 더 일반적 네이티브 타우 약한 내부의 수소 결합을 나타내는 것을 확인 차 구조 요소와 연관된 범위에서 관찰되지 않았다. 상당한 보호가 N과 C 말단, 중앙 영역 및 응집하기 쉬운 (헥사 펩티드 I 및 II) 영역 (도 4)에서 관찰된다. 1.52 (S) 후, 단백질을 90 % 전체 교환기 2 분 이내에 발생하여, 중수 소화된다. 네이티브 단백질이 경우에는 변경된 상태로 우리가 단백질에서 중수소 흡수의 일반적인 증가를 관찰 아밀로이드 hyperphosphorylated 상태를 비교할 수 있습니다. N- 형 및 C 말단에서 상기 H2 영역에 상당한 증가가있다. 흡수의 일반적인 증가는 C를 지원합니다과인산가 확장 구조를 채택하는 단백질을 야기 가설 urrent. 두 헥사 펩티드 중, H2는 hyperphosphorylated 상태에서 거의 보호를 원시 상태에서 가장 높은 보호 지역 중 하나 인에서 중수소 흡수에 가장 큰 증가를 보여줍니다. 이것은 H2 도메인의 노출이 아밀로이드에 대한 중요 제안합니다. 반면에, 흡수의 감소를 보이는 지역 중 일부는 S352에 Q124에 L114 및 G326에 걸친 지역을 포함한다. 후자의 영역, 반복 영역의 미세 소관 - 연관된 R3 및 R4 영역에 대응한다. 새로 형성된 잔여 구조의 스트레칭 이전 연구 hyperphosphorylated 타우는 미세 소관 (25)을 결합하기위한 감소 된 친 화성을 갖는 것으로 입증 동의. Q124 L114에 걸친 영역이 나선 구조의 중요한 경향을 갖는 것으로 천연 상태에서 발견되며, 흡수의 감소는 세코 높은 유병율에 기인 할 수있다<html> hyperphosphorylated 상태 ndary 구조. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55464/55464fig1.jpg" /> 이전 질량 분석 분석에 HDX을받은 단백질의 도식 묘사 그림. 관심의 단백질 골격 불안정한 수소 시간 동안 중수소 교환을 허용 산화 중수소 (D 2 O)의 용액으로 희석 하였다. 높은 동적 영역이 빠르게 교환 할 것이고, 두 번째 비율로 밀리 초에서 모니터링되어야한다. 보다 경질 인 이차 구조를 포함하는 다른 지역보다 천천히 교환한다. 교환 반응은 산 프로테아제 (예 : 펩신)으로 소화 가능 단백질을 전개 산 (PH 2.4), 급냉에 의해 종료된다. 소화는 단백질의 다른 영역에서 중수소 이해의 수준을 지역화.<html> 여윈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55464/55464fig2.jpg" /> TRESI - HDX-MS 그림 2. 실험 세트입니다. 운동 믹서의 상세보기는 하단에 도시되어있다. 믹서가 두 동심 모세관 외부 금속 모세관 내의 내측 용융 실리카 유리 모세관으로 구성된다. 노치는 노치를 종료하고 착신 중수소와 혼합 단백질을 허용하는 연결 단부와 내부 모세관의 끝에서 2mm로한다. 이 운동 믹서는 혼합 티에 연결되어 있습니다. 혼합기의 반대쪽에, 5 %의 아세트산을 전달 채널 (PH 2.4)에 부착된다. 반응 담금질 후, 중수 소화 단백질 펩티드를 생성하기 위해 펩신 아가 로스 비드 충전 한 단백질 분해 챔버를 통과한다. 원위 모세관은 ESI 공급원으로 사용된다.ES / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55464/55464fig3.jpg" /> 기본 및 hyperphosphorylated 단백질에서 선택된 펩타이드 운동 플롯 원시 데이터로부터 그림 3. 일반적인 워크 플로우. 네 개의 펩티드 (열)에 대한 (a) 원료 스펙트럼은 세 개의 다른 시점 (행)에서 중수소 흡수 %를 결정하기 위해 예측 된 동위 원소의 분포에 장착된다. (b) 각 펩티드 (실선)에 대한 시간 대 % 중수소 흡수 운동 플롯을 관찰 K 흑요석을 추출하는데 사용. 모든 펩티드 키네틱 플롯은 3 이상의 라벨 시간에 관찰되었다 (N = 3), 오차 막대는 SE 계산 &quot;랜덤 코일&quot;프로파일 (점선)이 비교를 위해 도시된다 나타낸다. Zhu의 등에서 재현. 권한을 가진 8.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55464/55464fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55464/55464fig4.jpg" /> 도 4 HDX 차단 지수 데이터는 (a) 천연 전장 타우 (b) hyperphosphorylated 타우의 대표적인 구조에 매핑. hyperphosphorylated 타우 구조 VADAR 후속하여 정제로 FRODAN 시뮬레이션을 이용하여 생성 하였다. 전설 (왼쪽)과 같이 보호 요인의 정도는 무지개 방식으로 색상이 지정됩니다. Zhu의 등에서 재현. 권한을 가진 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55464/55464fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

time-resolved-electrospray-ionization-hydrogen-deuterium-exchange

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K 조회수.  York University.  구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다. 

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

연구

생화학

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Bio3D-web을 이용한 단백질 염기 서열 구조 역학 관계 조사

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and enzyme-substrate interactions. Among its many benefits, HDX-MS consumes only small amounts of material, can be performed under near native conditions without the need for enzyme/substrate labeling, and can provide spatially resolved information on enzyme conformational dynamics&#8722;even for large enzymes and multiprotein complexes. The method is initiated by the dilution of the enzyme of interest into buffer prepared in D2O. This triggers the exchange of protium in peptide bond amides (N-H) with deuterium (N-D). At the desired exchange time points, reaction aliquots are quenched, the enzyme is proteolyzed into peptides, the peptides are separated by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and the change in mass of each peptide (due to the exchange of hydrogen for deuterium) is recorded by MS. The amount of deuterium uptake by each peptide is strongly dependent on the local hydrogen bonding environment of that peptide. Peptides present in very dynamic regions of the enzyme exchange deuterium very rapidly, whereas peptides derived from well-ordered regions undergo exchange much more slowly. In this manner, the HDX rate reports on local enzyme conformational dynamics. Perturbations to deuterium uptake levels in the presence of different ligands can then be used to map ligand binding sites, identify allosteric networks, and to understand the role of conformational dynamics in enzyme function. Here, we illustrate how we have used HDX-MS to better understand the biosynthesis of a type of peptide natural products called lanthipeptides. Lanthipeptides are genetically encoded peptides that are post-translationally modified by large, multifunctional, conformationally dynamic enzymes that are difficult to study with traditional structural biology approaches. HDX-MS provides an ideal and adaptable platform for investigating the mechanistic properties of these types of enzymes.

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases catalyze multistep reactions during the biosynthesis of peptide natural products. Here, we describe a continuous, bottom-up, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) workflow that can be employed to study the conformational dynamics of lanthipeptide synthetases, as well as other similar enzymes involved in peptide natural product biosynthesis.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...