우리 기술 지원 Dipa Bhaumik, 아론 밀러와 밥 휴즈 감사합니다. 변종은 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 조지아 우즈와 유용한 토론에 대 한 리스 고 우, Kapahi 및 Melov 실험실의 구성원 감사입니다. 메이저 리그는 국립 보건원 (NIH) 훈련 그랜트 T32 AG000266와는 엘리슨 의료 재단/미국 연맹의 노화 연구 장래가 친목에 의해 지원 되었다. 이 작품은 BioAge 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 건강의 국가 학회로 서 래리 L. 럼 재단 부여, 부여 UL1024917, Geroscience, 및 G.J.L.에 1R01AG029631-01A1 학 제 연구 컨소시엄을 지 원하는

1. 버퍼를 준비
<ol><li>
국물 LB
	<ol>
<li>미리 혼합된과 립 ( 자료 표참조)를 사용 하 고 준비에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선 충 류 성장 미디어 (NGM) 한 천
	<ol>
<li>믹스 23 agar의 g, NaCl의 3 세대, bacto 펩의 2.5 g 및 0.972 L. 압력솥에 이온된 수와 60 ° C에 게 멋진 추가 25 mL의 1 M 칼륨 인산 (KPO4) 버퍼 (pH 6.0), 1 M 황산 마그네슘 (MgSO4)의 1 mL 1 mL의 1 M 칼슘 염화 물 (CaCl2), 그리고 (에탄올)에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차 아 염소 산 솔루션
	<ol>
<li>5 M 코의 5 mL 염소 솔루션 (6%), 그리고 이온된 H2O 50 mL의 총 볼륨의 4 mL를 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S 기저
	<ol>
<li>5 g의 NaCl, K2HPO4, KH2포4와 드 이온된 수 1 l, 다음 압력솥 6 g 1 g을 혼합.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 집중된 대장균 (OP50)의 준비
참고:이 단계는 S 기저 버퍼의 25 mL로 포화 대장균 솔루션의 1 리터를 집중 한다.
<ol><li>대장균 (스트레인 OP50)의 단일 식민지와 압력가 파운드 국물 (단계 1.1)의 5 mL를 접종 하 고 진동 (250rpm) 37 ° C에서 4-6 h에 품 어. 이 솔루션의 0.1 mL를 사용 하 여 파운드의 1 L 2 L 삼각 플라스 크에 접종. 1 L 플라스 크 하룻밤 (12-16 h) 진동 (250rpm) 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>500 mL 원심 병 10000 x g와 박테리아를 작은 멀리 나머지 미디어를 가만히 따르다 하 4 ° C에서 5 분에 1 L 숙박 문화 원심 S 기저 (1.4 단계) 25 mL에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에 게</li>
</ol>3입니다. NGM 문화 접시의 준비
<ol><li>대량 배양 배지 벌레의 많은 수를 생성 하는 데 사용, 한 층 류 캐비닛 자동된 유체 디스 펜스 장치 또는 혈 청 학적인 피 펫 10 cm 배양 접시에에 녹은 (60 ° C) NGM 천의 (1.2 단계) 30 mL를 분배 하십시오. 하룻밤 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>각 10 cm 접시, 기울이기 및 회전 접시, agar 표면 표지 확산에 집중된 OP50의 2 개 mL를 피펫으로 다음 접시 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	<li>높은 처리량 분석 결과 문화 접시 심사에 대 한 사용, 층 류 캐비닛에 96 잘 접시의 각 음에 녹은 NGM agar의 0.15 mL를 분배 하는 자동화 된 8 채널 디스펜서를 활용 합니다. 이 내에 그 잘 분석 결과 손상 것 이다 벌레의 하면 있는지 우물을 주의 거품 없는 있습니다. 하룻밤 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
</ol>4. 온도 (ts)에 민감한 살 균 C. 선 충 대량 문화의 준비
<ol><li>문화는 ' 웜 ' (연결 된 백 금 철사 또는 제조 웜 유리 피펫은 골라 골라) 해 현미경을 사용 하 여 시작 하려면 전송 20 계란 (TJ1060 변형: spe-9 (hc88) 나, 단계 3.1에서에서 준비 중 문화의 plate(s)에 rrf-3(b26)II). 다음, 6 일 동안 20 ° C에서 번호판을 품 어 (이동 20 계란의 자손의 컬렉션에 대 한 대상으로 성장 한 세대 이상에 대 한 허용 한다).</li>
	<li>시각적으로 해 현미경으로 벗 성인 (자 궁에 계란)의 존재를 확인 합니다. 2-3 mL의 유리 피 펫을 사용 하 여 접시에 기저를 분배 하 여 벗 성인을 수집 합니다. 접시 주위 액체를 손으로, 소용돌이 다음 유리 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 액체를 수집 합니다.</li>
	<li>튜브 (1000 x g 20 ° C에서 1.5 분) 작은 벌레, 그리고 상쾌한에서 발음을 회전 합니다. 웜 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션 (1.3 단계)를 추가 하 고 빠르게 모든 2.5 분 떨고 5 분, 5 미 품에 대 한 위쪽-아래쪽 방향으로 손으로 튜브를 흔들.</li>
	<li>또, 회전 튜브 (1.5 분 1000 x g); 펠 릿은 노란 갈색 이어야 한다. 상쾌한에서 발음. 계란 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션을 추가 하 고 튜브를 적극적으로 악수. 1-3 분, 가끔 흔들어와 해 현미경 외관을 모니터링 하는 동안 품 어. 시각적으로 확인 계란만 남아, 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>튜브 (1000 x g 1.5 분) 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한에서 발음. 펠 릿은 아무 갈색 채색 흰색 이어야 한다. 참고: 후 차 아 염소 산 솔루션의 제거, 그것은 오염부터 살 균 기술 및 버퍼를 사용 하 여 중요 한 (세균 및 곰 팡이, 특히) 낭비 귀중 한 시간과 시 약 실험을 망칠 수 있습니다. 이 연구는 필터링 된 층 류 캐비닛을 사용 하 고 액체 살 균 펫과 팁을 사용 하 여 이동.</li>
	<li>살 균 공간에서 튜브를 엽니다. 3 번 S와 펠 릿 기저 (1.5 분 1000 x g) 아래로 회전 하 고 발음 멀리는 상쾌한 때마다 씻어. 다시 2-3 mL S 기저에 계란 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 계란 지금 L1 유 충 (5 단계) 수집을 버퍼에 하룻밤 해치에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 동기 문화 (L1 애벌레 C. 선 충 을 준비)를 버퍼에 C. 선 충 알을 부 화
<ol><li>커버와 멸 균 유리 페 트리 접시에 달걀 펠 릿 및 버퍼를 가만히 따르다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 S 기저의 2-3 mL와 함께 접시에 튜브에서 나머지 계란을 씻어. 로이 (희 궤도 셰이 커와 20 rpm) 떨고 빛으로 해칭, 격려 수 있습니다 크롤 링을 쉽게 하기 위해 기저 S의 5 mL를 추가 합니다. 계란 해치 (16-24 h) 시간에 20 ° C에서 하룻밤를 품 어. 모든 파묻혀 식품의 부재로 인해 1세인트 애벌레 단계 (L1)에서 체포 됩니다. 참고: 일화 적 증거는 신선한 L1 준비 (달걀 수집 후 16-36 h) 성인 벌레의 가장 동기 인구를 생성을 나타냅니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫 15 mL 튜브에 L1s를 수집 합니다. 원심 분리기 (1000 x g 1.5 분)에서 L1s 아래로 회전 시키십시오, 멀리 상쾌한, 발음 하 고 단계에 대 한 기저 S의 10 mL를 떠나 있는 동안 격판덮개, 부 화에서 모든 L1s가 수집 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>L1s를 포함 하는 관에서 micropipette 0.01 mL (즉시 혼합) 후 고는 unseeded에 분배 (아니 대장균) NGM 접시. 접시에 L1s의 수를 계산 합니다. 10 번 반복 하 고 각 약 수에 있는 L1s의 수에 대 한 평균을 구하십시오. 일반적으로, (때 20 계란을 포함 하는 1 대량 문화 접시와 함께 시작) µ L 당 1-3 L1s 사이 기대 합니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫과 S는 L1s를 들고 기저의 볼륨을 결정 합니다. 그런 다음 L1s의 총 수를 추정 하는 이전 단계에서 얻은 0.01 mL 당 벌레의 평균 수 결정된으로 추정. 일반적으로, (20 계란을 포함 하는 대량 문화 접시) 당 10000-30000 L1s 사이 기대 합니다.</li>
	<li>이 문화를 사용 하 여 96 잘 분석 결과에서, 살 균 라운드 미디어 병 µ L 당 1 L1 L1 현 탁 액을 희석 다음 7 단계로 진행 합니다. 이 문화를 추가 생성 하는 데 사용 되는 경우 C. 선 충 문화, 대량 다음 6 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>6. 대규모 동기 문화 준비
참고: L1 솔루션은 신속 하 게 벌레 인구 증가를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>큰 벌레 번호 L1 솔루션을 생성 하려면 대량 배양 배지 원하는 수의 각 최대 5000 L1s 분배. 4.1-2 단계에 설명 된 대로 벗 성인 2.5 일 후 (20 ° C)을 수집 하 고 달걀을 수집 하는 4.3 단계로 진행.</li>
	<li>Anecdotally 관찰 되었다는 차 아 염소 산 컬렉션 스트레스 정복 된 인구 수, 인구에 의해 분할 반복으로 따기 계란 그래서 차 아 염소 산 치료에 잔여 인구를 겪고 전에 전파에 대 한 그의 여러 인구의 세대 반복적으로 차 아 염소 산 솔루션 치료 대상이 되지 됩니다.</li>
</ol>7. 분석 결과 96 잘 접시의 설치
<ol><li>실내 온도 도달 (단계 3.3에서에서 준비) 분석 결과 접시를 수 있습니다. 다음, 층 류 캐비닛에서 각 음에 집중된 OP50 (준비 단계 2.2에서에서)의 5 µ L를 추가 합니다. 이전 처럼 자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여.</li>
	<li>자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여 각 음에 L1 정지의 10 µ L를 추가 합니다. 이 때문에 1 µ L 당 L1 정지에 있는 잘, 당 평균 10 벌레에 얻을 것입니다. 슬러리에서 L1s의 동등한 배급을 홍보, 분배 섞인 적극적으로 적당히 천천히 돌고 라운드 미디어 병에서 L1s 저 어 바.</li>
	<li>뚜껑, 상자 일괄 플레이트, 플레이트 커버 하 고 2 일에 25 ° C에서 품 어.</li>
</ol>8. 1 성 화학 물질과 하루 성인 C. 선 충 을 치료
<ol><li>화학 라이브러리 접시는 냉장고에서 제거 하 고 진행 하기 전에 실내 온도 도달 하는 격판덮개를 허용. 참고: 여기에 설명 된 대로 화학 라이브러리 접시 96 잘 접시에 각 잘, 모두는 동일한 농도에 있으며 DMSO에 용 해 분리 된 화합물을 포함 하는. 이러한 라이브러리 외부 열을 사용 하지 않는 그리고 이렇게 각 플레이트는 80 가지 화학 물질의 최대. 여기에 설명 된 프로토콜에서 라이브러리 농도 10 m m 이다. 그것은 고기에 용 매 효과 고려 하는 것이 중요입니다. 이 연구는 0.5%의 DMSO 농도에 스크린, 하는 동안이 수준 결코 이러한 수명 분석 실험 및 낮은 처리량 분석 실험, 어디 그것은 더 많은 복합 소재 솔루션의 농도 선택을 초과 했습니다. 이 프로토콜 수준에서 수명 수정 발생 하지 않습니다16, 적어도 N2 스트레인에 0.25%를 초과 하지 않습니다.</li>
	<li>부드럽게 흔들 플레이트 1 분 미 판 통에 60 rpm에서 즉시 사용 하기 전에.</li>
	<li>또는 사용 하는 자동화 된 96-잘 액체 처리기, 화합물의 전송 0.75 µ L (DMSO) 분석 결과 접시에 라이브러리 접시에서. 그런 액체 처리기의 피 펫 팁 (와 웜 단계 7.1에서에서 집중된 OP50 agar의 표면에 액체의 ~ 15 µ L을 0.75 µ L 볼륨을 제공 하는 시험 접시에 액체 전달 중 피 펫의 깊이, 신중 하 게 제어 됩니다. -2)와 agar 표면에 잘 관통 하지 않습니다. 매우 작은 화면에 수동 8 또는 12 채널 펫을 제외 하 고를 사용 하지 마십시오 (< 10 접시), 그들은 오류와 타협 분석 결과 agar 표면 puncturing에 자주 결과 높일 수 있습니다.</li>
	<li>테스트 중인 라이브러리 DMSO를 사용 하 여 용 매로 가정 하 DMSO (디 메 틸 sulfoxide)와 화학 라이브러리 부정적인 제어 플레이트를 준비 합니다. 10 부정적인 제어 플레이트까지 접시 테스트 모든 5 1 부정적인 컨트롤 플레이트를 확인 합니다. 가능 하다 면, 또한 긍정적인 제어 접시 만들기 (NP11 20 m m, 0.1 m m의 최종 분석 결과 농도이 목적;에 대 한 효과적인 대표적인 결과 섹션 참조). 그들은 건조에 특히 취약는 격판덮개의 2 외부 열에 화학 물질 (테스트 또는 컨트롤)을 추가 하지 마십시오.</li>
</ol>9. 건조 문화
<ol><li>agar의 표면에서 액체를 제거, 층 류 4-8 h에 대 한 캐비닛에 접시를 건조. 그것은 중요이 판을 완전히 건조 하지만 포장해 될 하지 않습니다. 몇몇 접시는 다른 사람 보다 건조 하 고, 모든 접시를 밀접 하 게 모니터링 하 고 최대한 빨리 그들은 건조를 제거 하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다. 접시의 개별 우물의 주의 깊은 검사에 의해 건조를 확인 합니다. 참고: 캐비닛의 배기 속도 포함 하는 요소에 따라이 작업에 걸리는 시간은 수 경험적으로 결정 합니다. 이 건조 단계 전체 캐비닛에 대 한 약 4-8 h 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>투명 필름, 번호판 봉인 다음 접시 뚜껑에 넣어.</li>
	<li>45에 대 한 분석 결과 96 잘 접시를 회전 1000 x g에서 s.</li>
	<li>매장 판 25 ° c.에서 반전</li>
</ol>10. 장 수에 대 한 선 충 C. 문화 점수
<ol><li>부정적인 제어 플레이트까지 모니터링 > 95% 사망률이 관찰 됩니다. 주 매일 이후 첫 2 주간에 대 한 번호판을 확인 하십시오. 동일한 긴장 및 종 꼬마 동료 재판17크게 다른 수명을 표시할 수 있습니다. 참고: 설명, 25 ° C에서 배양 하는 TJ1060 동물 수명 분석 결과 대 한 95% 사망률이이 인구에 있는 성인 하루 16-20에서 발생 했습니다.</li>
	<li>때 부정적인 제어 우물에 도달 했습니다 간주 됩니다는 > 95%, 45에 대 한 모든 분석 결과 96 잘 접시를 회전 s는 미 판으로 탁상용 원심 분리기에 적응로 터 (45 250 x g s 20 ° C에서).</li>
	<li>제어 판 모든 우물을 점수. 이것은 계산 하 고 각 잘에서 살아 있고 죽은 동물의 수를 기록 하 여 이루어집니다. 죽은 벌레는 움직임의 그들의 완전 한 부족에 의해 살아있는 벌레에서 분화 될 수 있다. 갖는 응답에 대 한 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 해 현미경 표면에 약 7 cm에서 96 잘 접시를 놓아 살아 벌레에 움직임을 자극 합니다. 죽은 벌레는 응답 하지 않습니다, 그리고 인근 연구소 동료 반복적인 소음을 감사 하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>테스트 판에 대 한 계산 하 고 살아있는 벌레를 포함 하는 우물만을 기록 합니다. 살아있는 벌레를 관찰 하는 경우에 잘 위치 및 접시는 잘 모든 살아있는 죽은 동물 계산 합니다. 참고: 그것은 종종 다시 점수 후 접시에 유용한 > 부정적인 제어 벌레의 99%는 죽 었 다. 대형 화면에서 초기 득점 할 최고의 포인트 수 있습니다. 두 경우 모두, 점수/다시-score 위에서 설명한 대로</li>
</ol>11. 다시 테스트 화합물
<ol><li>소수의 후보 화합물을 테스트할 때 (< 320 화합물), 다시 테스트 또는 후보 화면 (대표 결과 참조), 분석 결과를 제한 32 중앙 우물 가능한 판 효과 최소화 하기 위해 노력에서. 이것은 2 우물 접시의 가장자리에 가까운 치료 하지만 여전히 한 천, 음식, 그리고 벌레.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. 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저자는이 작품을 지 원하는 아무 자금 엔터티 데이터, 결과, 분석 또는 게시 하는 결정에 입력 했다 선언 합니다.

여기 우리 96 잘 접시에 C. 선 충 배양을 위한 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리 화학 검사 및 수명 분석 실험에서 사용 하기 위해 이러한 문화를 설명 하지만 많은 유형의 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 동안 멀티 잘 문화 조건 화학 심사에 대 한 이전 보고8, 여러 가지 방법으로 여기에 설명 된 분석 결과가 다릅니다 수명 분석10를 포함 하 여. 여기에 설명 된 수명 분석 결과 96 잘 접시를 활용 하 여, (대신 화학 살 균) 살 균 돌연변이에 의존, 천 문화 조건을 사용 하 여, 웜, 이동 처리 하는 간단한 액체를 사용 하 여 하며 수동으로 끝점에서 득점. 이 분석 결과에서 사용 하는 다른 접근 상영이 조건을 포함 하는 방법을 찾고 연구 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 중요 한 요소는 주로 분석 결과 대 한 생산 하는 접시의 품질에 센터. 첫째, 플레이트를 만들 때 한 천 표면 거품 및 다른 결점의 무료입니다 필수적입니다. 한 천 표면에이 변이 거의 항상 이어질 내 우물의 손실. 둘째,이 프로토콜 설치 및 약물 중독자 단계 입금 액체 떨어져 건조에 의존 합니다. 그것은 중요 이러한 액체는 완전히 제거 하 고, 하지만 한 천 밖으로 건조 될 하지 않습니다. Anecdotally, 그것 되지 않은 완전히 스 웜 (액체에서 수영) 건조 나타납니다 건조 및 균열 웜 내과 손실에 이르게 agar의 리드 플레이트의 이상 건조 하는 동안 제대로 건조 웰 스 보다 오래 산다. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 요소는 무 균 상태를 유지 하 고. 와 마찬가지로 모든 수명 분석 결과, 거기 많은 일 판 설치와 관련 된 그리고 많은 기회와 시간 시험 망치고 정착 하 고 성장 판에 오염에 대 한 존재.
여기에 설명 된 수명 분석 결과 C. 선 충에서 화합물의 심사에 대 한 유용 하지만, 그것은 특정 유전 배경, 제한 온도 (ts)에 민감한 살 균 스트레인;에 의존 우리는 높은 불 임 penetrance TJ1060를 사용 합니다. 이이 방법으로 심사에 사용할 수 있는 긴장을 제한합니다. 대체 원하는 배경으로 ts 메 마른 돌연변이 건너 등 화학 살 균을 사용 하 여 접근 한다. 우리는이 분석 결과와 화학 소독을 시도 하지 않은 하지만 가능 해야 한다. 잠재적인 장애물 배치는 소독 기는 벌레에 올바른 단계에서 적절 한 복용량에 포함 됩니다. 설명 하는 프로토콜은 여기 액체 디스펜서는 빠르고, 그러나 성인을 효과적으로 분배 하는 표시 되지 않습니다을 사용 합니다. 그래서,이 벌레는 접시에 개발 하 고 살 균 판에 화학으로 대우 되어야 한다. 최적의 복용량을 결정 하 고 타이밍 성공을 위해 중요 한 것입니다. 대체 전략 성인 이동할 수 있는 분배 방법을 사용 하 여 포함 됩니다. 과거에는, 우리 식별 하 고 성인 정렬 기계는 일반적으로 일시 중단 된 유 충의 균질 슬러리 분배 수 있습니다 간단한 액체 처리기 보다 훨씬 느린 것으로 나타났습니다.
일반적으로, 빠르게 화면 화학 물질과 치료가이 메서드 사용 하 여 수명에 큰 긍정적인 영향에 대 한. 방법은 여러 복용과 함께 사용 될 때 특히 효과적, 높은 숫자, 및 부정적인 컨트롤을 항상 유지 하 고 시험 접시 중 산재의 모니터링을 닫습니다. 긍정적인 컨트롤은 또한 디자인 하 고 구현 하는이 원고에서 설명 하는 스크린 경우에 유용 합니다. 그러나, 효과적인 긍정적인 것, 컨트롤 상당히 유력한 매우 강력한 될 필요가 것입니다. 화면 원래 배포 되 면 적당히 강력 하 고 강력한 화합물 확인 하지 않을 수 있습니다. 현재, 많은 보고가 있다 긍정적인 컨트롤에 대 한 가능성이 후보 '노화' 문학에 여기에서 설명 하는 스크린에 유용. 이 원고의 예상된 결과 섹션의 후보 화면 섹션에서 하 고 그림 2 및 표 1에서 설명한 대로 복합 NP1은이 화면에 대 한 효과적인 긍정적인 컨트롤. 우리는 일반적으로 3mm 문화 접시에 표준 수명 분석으로이 화면에서 긍정적인 안타를 확인합니다.

여기는 프로토콜 꼬마 선 충 수명에 미치는 영향에 대 한 화합물의 높은 처리량 검열을 위한 개발 된 설명 합니다. 프로토콜 자체는 기자 C. 선 충 종자를 이용 하 여 연구를 포함 하 여 다른 phenotypic 스크린에 쉽게 적응할 수입니다. 이 프로토콜 NP1 소설 생물학적 활성 화합물을 식별 하기 위해 성공적으로 이용 되었다 (nitrophenyl-piperazine 1), 하 강하게 식이 제한 메커니즘을 통해 C. 선 충 의 수명 연장. NP1과 놀이, 유전 통로의 설명을 포함 하 여 수명에 미치는 영향의 특성은 이전1설명 되어. 그 보고서에는 대규모 구현의 화면에서 결과의 설명도 포함 됩니다. 여기 우리가 설명 훨씬 더 자세히 방법론 및 화면 자체의 설치는 모두 작은 큰 규모 응용 프로그램에 대 한 확장 가능한.
목표는 여기에 설명 된 프로토콜의 창조에 주도 소설 생물학적 활성 화합물에 대 한 큰 화학 라이브러리의 신속한 심사에 대 한 허용 하는 C. 선 충 문화 플랫폼을 개발 했다. 화학 화면이이 프로토콜의 개발에 앞서 수행 되었습니다, 하지만 이들은 주로 소규모 또는 후보 형식 접근2,3. 실제로, 대부분의 화합물의 수만에 실험실에서 수행 하는 화면 장 수 효과4상영 되 고 안타와 스트레스 저항 분석 실험, 활용. 이 연구 하고자 했다 대신 직접 수명 효과 대 한 화면. 놀랍게도, 수행 하는 대규모 화학 스크린 C. 선 충의 때에 과학 문학에서 몇 가지 설명 했다. 실제로, 화면5,,67의 다른 유형에 비해, C. 선 충 을 사용 하 여 대규모 화학 심사에서 고용 것 같았다.
이 접근 방법을 개발 하는 기초로 사용 된 C. 선 충 에서 대규모 화학 화면 두 설명 했다. 이 중 첫 번째 화학 화면을 사용 하 여 동물의 개발을 교란 할 수 있는 화합물을 식별 하는 피터로이 실험실에서 우아한 연구 했다. 연구는 다음8이러한 화학 물질 유전 목표를 식별 하기 위해 앞으로 mutagenesis 화면 따라. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜 사용 24 잘 pates,이 연구의 특정 요구 사항 (제한 된 양의 화학 라이브러리에 제한 된 사용 가능한 보육 공간)를 위해 간단 하 게 실행할 수 아니었다. 다른 연구는 수명 연장 화학9,10마이클 Petrascheck의 혁신적이 고 야심찬 작은 분자 화면을 했다. 그 연구는 384-잘 접시와 액체 문화를 사용합니다. 이 스크린의 다른 주요 기능 FUDR (5-fluorodeoxyuridine) 화학적으로 자손 생산을 억제 하기 위해 사용 했다. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜의 상당한 고려 후 화학 살 균과 액체 문화 C. 선 충 의 피해 했다.
비록 FUDR C. 선 충 수명 실험에서 널리 이용 된다, FUDR 예기치 못한 약물 상호 작용을 발생할 수 있습니다 또는 그 FUDR 자체 수명에 어떤 영향을 미칠 수 있습니다 우려 했다. 최근이 후자의 문제는 검증, 적어도 일부 농도 및 25 ° C11에서 특히. 자손 오염의 문제 회피, C. 선 충 스트레인 TJ1060 사용 되었다는 두 개의 독립적인 온도 민감한 돌연변이 항구 (spe-9 (hc88) 나, 정자 생산을 폐지 하 고 유용한 것으로 입증 되었습니다 rrf-3(b26)II) 대 한 동기 인구12의 대량 문화. 이 긴장은 25 ° C에서 완전히 살 균 하지만 15-20 ° c.에 교양 때 자손을 생산할 예정 이다 이 연구 액체 문화 얻은 결과 항상 기존의 한 천 배지와 재현 한 천의 표면에 크롤 링 하는 벌레와 함께 기존의 문화 조건, 사용. 이 현상을 완전히 이해 되지 않습니다, 그러나 그것은 입증 되었습니다 그 웜 교양 교양 표준 미디어13,14에 웜 보다 다른 방식으로 박사 (식이 제한) 액체 반응에. 따라서 액체 미디어 화면 식별 것입니다 그렇지 않으면 일부 박사 mimetics 마스크 수 그럴 듯 하 게 이다.
한 천 문화 조건에 정착 하는 데,이 분석 결과에서 우물의 성능 점수에 대 한 다른 옵션 고려 되었다. 다양 한 자동화 또는 이미징 기반된 분석 사용할 수 있는 동안, 그들은 필요한 수집 및 배포의 기술적으로 도전적인 장치, 대부분의 엄청나게 비싼 했다. 이 옵션을 고려 하는 동안 모든 종류의 이전 수명 화면 참조 필수적 이었다. 궁극적으로,이 연구 수명 고기15시 우 실비아 리 연구소의 전체 게놈 RNAi 스크린에서 적응 점수 메서드를 사용 합니다. 특히, 모든 수명 접시 같은 방식으로 설정 하지만 부정적인 컨트롤만 감시 되었다. 일단 부정적인 컨트롤 플레이트 근처 전체 사망률을 확인 했다, 테스트 플레이트 손으로 득점 했다. 이 대형 스크린에서 긍정 주 반응의 3 중 반복 갓 화학 물질을 사용 하 여 다시 테스트 하 여 확인 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1311px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">LB Broth Miller Granules</td>
			<td style="width:363px;">VWR</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Unispense&#160;</td>
			<td>Wheaton Science Products</td>
			<td></td>
			<td>automated fluid dispensing apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96 well assay plate; COSTAR 3370</td>
			<td style="width:363px;">Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manufactored worm pick</td>
			<td style="width:363px;">Genesee Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td>Stovall Life Science inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td>
			<td>IKA Works, inc.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td>
			<td>&#160;Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&#160;</td>
			<td>Sorenson Bioscience, inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:363px;">we use rainin&#8230;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 은 생리학에 화학 효과 테스트 하기 위한 유용한 유기 체입니다. 전체 유기 체 분자 스크린 수명 등 복잡 한 고기를 수정할 수 있는 생물 학적 활성 화학 구조를 식별 하는 데 상당한 이점을 제공 합니다. 여기에 설명 된 각 잘에서 C. 선 충 의 상당히 일관 된 번호 96 잘 문화 접시의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜이입니다. 다음으로, 우리는 선 충 류 C. 선 충의 수명에 미치는 영향에 대 한 이러한 문화 화면 화학 물질의 수천을 사용 하는 방법을 지정 합니다. 이 프로토콜 온도 민감한 살 균 긴장, 한 천 격판덮개 조건 및 심사에 대 한 동기화 된 동물 문화의 신속 하 고 높은 처리량 생산을 촉진 하기 위하여 처리 하는 간단한 동물의 사용.

우리 96-잘 수명 분석 실험을 위해이 프로토콜을 채용에서 대표적인 결과 검토 하 여 시작 합니다. 첫 번째 예제에서 메서드는 30000 화학 물질을 통해 성공적으로 스크린에 사용 되었다 C. 선 충 의 수명을 확장 하 고 또한 화학 물질을 사용 하 여 수행 하는 최고의 후속 다시 테스트 화면에서 결과 포함 하는 화학 물질 확인에 동일한 프로토콜입니다. 이러한 결과 앞에서 설명한1했다입니다. 두 번째 예에서는 후보 화합물의 작은 규모 스크린에 동일한 프로토콜을 사용합니다.
대형 스크린 및 다시 테스트: 30000 화합물을 테스트 하는 대형 화면 중복에 단 하나의 복용량에서 수행 되었다. 각 화학 따라서 20의 예상된 총 동물 인구와 가진 2 개의 우물에서 시험 되었다. 이 위해 3 개의 개별 세트 (중복)에서 10000 화합물의 전체 30000 화합물을 충당 하기 위해 3 개월의 기간 동안 상영 했다. 이 부분에서 수동 분석 결과의 끝에 득점의 관리 금액을 보장 하기 위해 수행 했다 하 고 각 집합에서 분석 결과 96 잘 접시의 260의 총 필요 합니다. 도서관 사진 판, 80만 웰 스 포함 화합물; 10000 화합물에의 한 복제 125 분석 결과 접시를 만든다. 이 연구 각 세트에서 10 부정적인 컨트롤 플레이트 2 복제 사용. 처리량을 증가, 접시 때 부정적인 제어 인구 ~ 99% 사망 경험 평가 했다 득점 했다. 살아있는 벌레에 대 한 모든 테스트 웰 스 다음 조사 했다.
한 라이브 벌레 스에서 화학 안타 라고 했다. 웰 스 되었고 또한 라는 안타, 그리고 그 우물에 또한 모든 벌레 (살아있는 죽은) 이상 1 웜 살아에 포함 된 화학 물질 간단한 점수 생성을 계산 했다 (백분율 살아 점수, 살아있는 벌레 죽은 벌레의 수로 나눈 수). 라이브러리에 있는 각 화학 수 따라서 히트 두 번 그리고 그 안타, 하지만 수도, 그들과 관련 된 점수를가지고. 512 가지 화학 30000 화합물의 화면에서 조회 수 (적어도 한 번) 전화를 했다. 화면 강력한 그리고/또한 강력한 (재현성) 프로 장 수 효과 식별 목적으로 수행 되었다. 이러한 두 가지 다른 속성 뚜렷한 효과 있을 수 있습니다. 강력한 화학 물질 수 극적으로 어떤 경우에 우리는 그 화학 물질의 잘 살아있을 벌레의 높은 % 기대 수명을 증가. 강력한 화학 물질에 대 한 두 복제 살아있는 벌레를가지고 것으로 예상 것입니다. 히트 리스트는 이러한 기준에 따라 평가 되었다. 화학 물질의 179 높은 백분율 살아 점수, 굴복 또는 두 복제에 성공 했 고 따라서 다시 테스트를 위해 선정 됐다. 라는 안타, 하지만 다시 테스트를 위해 선택 하지 나머지 화학의 대부분 복제 우물 중 하나에서 단일 웜 살아 포함만 했다.
다시는 안타의 테스트, 3 복제 (예상된 총 동물의 인구 30), 그리고 치료 제어 판에서 동물의 수명의 주의 정량화를 제외 하 고 기본 화면으로 유사 했다. 이러한 변화는 비교 테스트 및 제어 우물에 도움이 추가 되었습니다. 화학 안타의 179 다시 주문, 10mm, 희석 되었고 96 잘 접시에 이동. 다시 테스트 분석 결과 대 한 내부 24 웰 스만 사용 되었다 (이 프로토콜의 현재 버전 사용 했 내부 32 우물 다시 테스트 화면에 대 한 프로토콜 섹션에 설명 된 대로) 화합물 6 부정적인 제어 분석 결과 플레이트와 3 중에서 다시 테스트 했다 DMSO 용 매로 처리. 한 부정적인 컨트롤 플레이트 총 생존 (그림 1A)에 대 한 주기적으로 득점 했다. 모든 플레이트 득점 했다 완전히 제어 동물의 약 95% 죽은 때, (치료 모든 생활과 죽은 벌레 계산 했다).
다시 테스트 결과에서 안타를 호출 하는 커트 오프 부정적인 컨트롤 + 2 표준 편차 (SD)의 평균 백분율 살아있는 점수에서 만들어졌다. 테스트 웰 스에 대 한 % (득점의 시간)에서 살아 평균 점수는 각 음에 대 한 세 가지 복제에서 살아 백분율 점수를 평균 하 여 계산 했다. 이 특정 분석 결과 대 한 부정적인 제어 우물의 평균 백분율 살아 점수 48 우물 (triplicate 부정적인 컨트롤 플레이트 2 세트) 3 복제의 평균으로 계산 했다. 다시 테스트 화학 세트에서 안타를 호출 하는 데 사용 하는 SD 48 부정적인 제어를 통해 SD % 살아있는 점수를 평균 했다. 이 전략을 사용 하 여,이 연구 발견의 179, 다시 테스트 화학 물질의 32%의 총 양성 시연 (그림 1B) 테스트 다시 도서관에서 57 안타. 부정적인 제어 및 테스트 웰 스에 대 한 평균된 % 살아있는 점수의 binning 테스트 웰 스 제어 웰 스 (그림 1C) 실적이 표시 됩니다.
후보 스크린: 작은 규모 스크린 위에서 설명한 재 시험을 유사한 방식으로 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 139 화합물과 후보 화면에서 결과 설명합니다. 이 후보는 장 수를 촉진 가능성이 구조로 조립 했다. 이 화면에 대 한 우리는 두 개의 다른 복용량 (50 µ M, 100 µ M)에서 테스트 판의 5 복제 수행. 또한, 우리가 포함 하는 두 개의 다른 복용량; 단일 긍정적인 컨트롤 (NP1) 접시 8 부정적인 컨트롤 플레이트, 사용 50 µ M, 100 µ M
부정적인 통제 격판덮개는 동물의 ~ 90% 죽 었 때까지 감시 되었다. 그 당시, 웰 스는 모든 제어 웰 스, 그리고 살아있는 벌레를 포함 하는 테스트 웰 스에서 라이브 하 고 죽은 벌레를 계산 하 여 득점 했다. 득점의 시간에서 살아 % 각 우물에 대 한 평균된 % 살아있는 점수를 계산에 사용 되었다. 부정적인 컨트롤 32 웰 스 8 복제에서 % 살아있는 점수를 했다. 긍정적인 컨트롤에 대 한 각 복용량에 대 한 4 복제에 걸쳐 평균 4 잘 점수 있었다. 조회 수는 평균 보다 큰 한 평균된 백분율 살아 점수와 웰 스에 대 한 전화를 했다 부정적인 제어 % 살아 점수 + 2 sd. 이 컷오프 후보 화면에서 14 안타와 모든 부정적인 제어 웰 스 제외. 그 구분 또한 긍정적인 컨트롤의 모든 포함 100 µ M와 긍정적인 컨트롤의 50%에서 치료 하는 우물 50 µ M에서 치료. 이러한 결과 제시 여기 범주화 50 µ M (그림 2A) 및 100 µ M (그림 2B) 테스트 화면에 대 한 백분율 살아있는 점수를 평균 했다.
마지막으로, 모든 접시 늦은 시간이 시점에서 한 번에 대응 다시 득점 했다 부정적인 컨트롤의 99% 보다 큰 치료 동물 죽 었다고. 그 결과 긍정적인 통제 우물까지 밖 수행 부정적인 제어 및 시험 우물 (그림 2C) 표시. 동안 테스트 웰 스 부정적인 컨트롤 보다 약간 더 나은 했다. 이 후자의 결과 테스트 웰 스의 많은 제어 치료 (표 1), 따라서이 간단한 해석 혼동 상대적인 독성을 전시에 등장 하는 표시에 의해 편 파. 이것은 이후 후보 라이브러리 C. 선 충에서 알 수 없는 생물학 활동 화학 물질의 진정한 화면 다시 테스트 화면 했다 독성 화합물에 대 한 본질적으로 사전 검사 동안에, 예상 될 것 이었다. 이 기본 화면 수명 길어 화합물에 대 한 이후, 크게 독성 화학 물질 해야 하지 다시 테스트에 설정 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> 그림 1 : 대표 결과 높은 처리량 화면 하 고 다시 테스트 (A) Survivorship 다시 테스트 분석 결과에 사용 된 대표적인 부정적인 컨트롤 플레이트에서 곡선. 이 곡선 분석 결과의 18 일 동안 4 번이이 시험에 사용 되는 24 스에서 모든 라이브 및 죽은 벌레를 점수에서 건설 되었다. 성년의 날 18, 컨트롤 ~ 5% 생존을 평가 했다 그리고 모든 제어 테스트 및 플레이트 또한 득점 후 했다. (B) 테이블 화면 및 재 시험의 결과 요약. (C) Binning 다시 테스트 화면에서 제어 및 테스트 조건에 대 한 웰 스 평균 백분율 살아 점수. 컨트롤에 대 한 점수는 48 우물에서 각 구성 3 복제의 평균. 테스트 결과 179 우물에서 각 구성 3 복제에서 평균된 점수. 그림 1 은 이전 게시1에서 재생 된다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> 그림 2 : 대표 후보 화면에서 결과 (A) Binning 50 µ M 후보 화면에서 결과의. 139 테스트 잘 결과 5 복제에서 평균된 백분율 살아있는 점수를 나타냅니다. 8 복제에서 평균된 백분율 살아 점수 32 부정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. 4 복제 (16 총 50 µ M에 포함 NP1 우물)에서 평균된 백분율 살아 점수 4 긍정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. (B) 100 µ M 후보 화면에서 결과의 Binning. 모두는 (A)에서 같이 테스트 웰 스와 긍정적인 컨트롤 100 μ M 농도에서 치료. 같은 부정적인 컨트롤 플레이트는 모두 (A 와 B)에 표시 됩니다. (C) 대표는 상대적으로 극단적인 늦은 시간에 접시를 다시 점수에서 결과. 그냥이 시간 시점에서 주요 텍스트 및 표 1에 설명 된 대로 테스트 웰 스에 대 한 편견을 라이브 벌레와 우물의 %를 차지 하는 경우 긍정적인 컨트롤은 극적으로 모든 다른 사람 보다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">평균된 백분율 살아 점수의 binning</td>
		</tr>
<tr>
<td>그룹화 된 점수</td>
			<td>모든 죽은 (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>다시 테스트</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) 제어</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (50µM)의</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>후보 스크린</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) 제어</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+)의 # 제어 (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+)의 # 제어 (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (50µM)의</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 테스트 웰 스 (100µM)의</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 대표 binning 다른 화면에서 결과 여기 두 화면 (다시 테스트 및 후보)에서 평균된 백분율 살아 점수의 binning 선물이. 다시 테스트 화면에서 피크는 부정적인 컨트롤과 유사 하 게 테스트 다시 오른쪽에 극적으로 부정적인 제어를 능가 (수명이 긴) 사이드 테이블의. 이 다시 테스트 집합에 여러 개의 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다. 후보 화면에서 우리는 피크는 모든 죽은 카테고리에는 또한 테이블의 오른쪽에서 명백한 신호를 참조 하십시오. 이 후보 세트에서 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다 하지만 또한 중요 한 독성 화합물에 대 한 후보 집합 중의 존재를 나타냅니다.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.6K 조회수.  The Buck Institute for Research on Aging. 여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

비디오: A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...