우리는 마이클 Heymann 감사 하 고 실리콘의 생산에 대 한 프랭크 Siedler 웨이퍼, 단백질 정화와 사이먼 Kretschmer에 핵심 시설 MPI-B와 레온 해 링 턴 원고에 대 한 의견.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 설명 하는 프로토콜 평면에 MinCDE 자기 조직화의 생체 외에서 재구성 지원 지질 bilayers 및 지질 bilayer 적용 3 차원 구조, 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조의 예를 사용 하 여. 이러한 분석에서 중요 한 데이터를 얻기 위해 제어에 가장 중요 한 요소는 단백질 및 막 품질.
단백질, 단백질 품질을 보장 하기 위해 질량 SDS 페이지와 질량 분석을 사용 하 여 확인 한다. 또한, 그것은 단백질은 가용성과 하지 집계 분석 젤 여과 또는 동적 산란을 사용 하 여 확인 되어야 한다. 젤 여과 단백질의 모든 집계 분수를 제거 하려면 사용할 수 있습니다. 주의 깊은 pH 조정 및 추가 된 뉴클레오티드의 품질은 매우 중요, 단백질 비 조정 또는 부분적으로 저하 된 뉴클레오티드의 추가 주식 또는 자체 조직 분석 실험 단백질 활동, 따라서 폐지를 제거 하기에 충분 자기 조직입니다.
단백질 품질, 옆 막 품질이 가장 중요 한, 그리고 부적 절 한 막 형성은 가장 종종 결함이 자기 조직과 artefactual 표면 구조의 기원에 대 한 원인.
처음으로 프로토콜을 수행할 때 낮은 어 금 니 비율에서 Atto-655-마약 등 DiI 레이블이 지질 (0.05%)를 포함 하 여 지원된 지질 bilayers를 도움이 됩니다. 따라서 속성 및 막의 품질 수 판단 직접. FRAP를 사용 하 여 막의 유동성 평가 될 수 있다. 서 있을 것입니다 중 하나 너무 많은 소포, 아니 유체 막 또는 아무 막, 떨어져 세척 되는 경우 또한, 하나 직접는 SLB의 세척의 품질을 평가할 수 있습니다. 오픈 챔버 접근 방식은 엄격 하 게, 막 씻어 수 그리고 그러므로 또한 소포는 SLB의 표면에 고정을 제거 하. SUV 크기와 크기 분포를 사용 하 여 도움이 될 수는 청소와 화란 지원 표면 및 올바른 크기의대 수의 유체 및 균질 성 지원된 지질 bilayers는 얻기 위해 가장 중요 한 요인 동적 빛 비 산. 좁은 크기 분포에 대 한 그들을 sonicating 보다는 소포를 압출 하는 것이 좋습니다. 다른 방법 청소 coverslips, 강한 기초, 기본 세제, 또는 coverslips를 사용 하 여 직접 물으로 rinsing 후 치료 예를 들어, 응용 프로그램 및 지질 혼합물에 따라 좋은 결과 얻을 수 있습니다.
여기, 오픈 실에서 평면 지원된 지질 bilayers에 생체 외에서 재구성에 제시 된 프로토콜의 첫 번째 절반 표면 TIRF 현미경30, FRAP 같은 광학 microscopies 위한 렌더링의 이점이 있다 분석6,34, 원자 힘 현미경 검사 법26같은 표면 감지기 기술을 추적 단일 입자. 큰 균질 지역 정의 된 농도에서 더 나은 통계 수 있습니다. 또한 오픈 챔버 접근 단백질 농도 및 구성 요소 추가, 따라서 적정 단일 챔버20에 단백질 농도를 허용에 대 한 신속 하 고 간단한 추가 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 분석 결과 또한 FtsZ22,35, ZipA22 또는 공상 단백질 FtsZ YFP MTS10,35같은 다른 세균성 divisome 구성 요소를 추가 하 여 확장할 수 있습니다.
다른 그룹 분 시스템에는 생체 외에서오픈 챔버17,,1819대신 사용 흐름-셀 재구성에 유사한 접근 방식을 갔다. 흐름 세포 특정 이점이 있다, 특히 때 완전히 동봉 된 3D 환경 필요한18흐름17,,1923 의 영향 인지 MinCDE 패턴에 막 구성23 조사, 또는 단백질 패턴 제한 조건19단백질에서 관찰 될 경우. 그럼에도 불구 하 고, 분자 농도의 로컬 제어는 더 어렵습니다. 막 단백질 구성 요소, 특히 마음에 의하여 강하게 바인딩할 그들은 먼저18,19발생. 우리의 경험에서는, 단백질은 자주 튜브, 후미, 주사기 및 다른 미세 부품 비 특정 바인딩 전시. 따라서, 지방 단백질 농도 다 입력된 농도18 를 또한19다른 사람에 의해 관찰로 입구와 출구 사이 막에 다른 단백질 패턴의 다양 한 결과 흐름 셀의 길이에 따라 달라.
프로토콜의 절반 여기, 막대 모양의 마이크로 구조 다시 지질 적용 패턴된 지원에 오픈 챔버 방식을 사용 하 여에서 생체 외에서 재구성에 제시 된 두 번째 bilayers vivo에서 단백질 동작의 단순한 모방에 대 한 허용 비록 단백질 농도 정밀 하 게 제어 버퍼 제거 손실입니다. Note는 MinDE의 파장은 대략 1 개의 크기 순서 때문에 더 큰 생체 외에서 vivo에서 막대 모양의 microcompartments는 또한 1 개의 크기 순서 더 큰 (10 x 30 µ m) 막대 모양의 대장균 보다에 대 한 셀.
전반적으로,이 프로토콜 단백질 농도, 막 속성, 버퍼 구성 등 모든 조건 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 3 차원 구조적된 지원 사용 vivo에서 복잡 한 마이크로 장비에 대 한 필요 없이 행동을 흉내 낸 공간 감 금에서 공부를 반응이 있습니다.

Spatiotemporal 패턴 자연, 다세포과 세포 수준에, 통제 세포 분열1,2morphogenesis에서 복잡 한 작업을 모두 조절에 필수적입니다. 반응 유포 시스템 이러한 패턴을 수립에 중요 한 역할 하지만 아직도 잘 이해 된다. 반응 유포 시스템 그리고 최고의 특징이 생물학적 시스템의 대표적인 사례는 지금까지 대장균 MinCDE 시스템3,,45,6,7입니다. MinCDE 시스템 대장균 미래 사단 사이트로 셀의 가운데를 확인 하기 위해 장 대 셀에 셀 극에서 진동. 이 시스템은 ATPase 마음, 광산, 및 공간 반응 매트릭스8로 막 단백질을 활성화 ATPase 기반으로 합니다. MinC는 패턴 형성 메커니즘의 일부 이지만 실제 기능 에이전트: 주요 divisome 단백질 FtsZ5,6의 억제제. MinC 마음에 바인딩하고 따라서 다음과 같이 진동, 셀에서 최대한 이며 셀 중간에 최소한의 시간 평균 단백질 농도 기온 변화도 결과로 midcell9,10에서 유해를 FtsZ 허용 . MinCDE 시스템 위치를 수송 하는 단백질 복합물11 및 플라스 미드12 와 셀을 규제에 대 한 박테리아2, spatiotemporal 조직에 중요 워커 A ATPases의 가족의 일부입니다. 부문13 와 염색체 분리14. 따라서, MinCDE 반응 확산 시스템 뿐만 아니라 원형 반응-보급 시스템 나타내지만 또한 박테리아에 spatiotemporal 조직에 대 한 그것의 관련성 때문에 관심을 끌었다 있다.
MinCDE 시스템에는 vivo에서 의 상세한 기능 연구는 복잡 한, 단백질 및 유전자 삭제의 조작 일반적으로 세포 분열 결함 발생. 또한, 막 구성 또는 vivo에서 cytosol의 속성을 변경 하는 것은 매우 도전적인15,16. 시스템 및 요소에 영향을 미치는 변경 경우 세포 분열으로 같은 필수적인 기능에 방해 되는 셀의 복잡 한 환경에서 더욱 그렇게 해석 하는 하드 있다. 우리와 다른 그러므로 아닙니다 생체 외에서 재구성 접근, 시스템의 핵심 구성 요소에 감소: 마음, 에너지 원으로 ATP와 반응 매트릭스6,17, 로 지원된 지질 bilayer 내 18.이 상향식 접근 방식을 자세히 복잡 하지 않고 살아있는 세포의 자기 조직화의 메커니즘을 수 있습니다. 여행 표면 단백질 양식 파도6 와 다른 종류 패턴17,19 이러한 조건 하에서 파장으로는 비보에보다 큰 크기에 대 한 일반적으로 이기는 하지만. 개방 챔버를 사용 하 여 용이 하 게 정밀 하 게 제어할 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면: 단백질 농도6, 단백질 속성20, 막 구성10, 버퍼 구성, 및 ATP 농도 6, 뿐만 아니라 대리인21 와 다른 divisome 단백질22를 크롤 링 하는 등 다른 요인의 추가. 비교에서는, 흐름 셀18,,1923 에 MinCDE 시스템의 생체 외에서 재구성 프로브 흐름17,23, 단백질의 영향을 사용할 수 있습니다. 제한 조건19, 막 구성19 와 단백질 패턴에 풀 3D 감18 하지만 단백질/구성 요소 농도 및 순차적 구성 요소 또한 훨씬 더 복잡 한 컨트롤을 렌더링 합니다.
우리는 하나 어떻게 기하학적 경계 영향 패턴 형성21, 최근에 현상을 프로브 수 있습니다 평면 지질 bilayers의 지원 또한 모방이 오픈 챔버를 사용 하 여, 또한 조사 되어 vivo에서 박테리아를 사용 하 여 마이크로 구조7으로 성형. 우리 또한이 분석 결과 내에서 어떻게 정의 된 돌연변이 조사 시스템20의 영향을 패턴 형성 고용. 또한, 동일한 기본적인 분석 결과 형식 빛, 분석 결과에 아조 가교 된 광산 펩 티 드를 소개 하 고 TIRF 현미경24이미징 패턴 형성을 제어 하는 방법은 조사 하 고용 하고있다.
우리는, MinDE 패턴을 복제 하기 위해 형성 관찰 vivo에 는 체 외에서 시스템, 감 금 했다 키 발견. MinDE 극-극 진동 및 단백질 그라데이션 형성 의 재구성을 허용 지원된 지질 bilayer와 입은 MinDE에서 생체 외에서 (10 x 30 µ m)의 더 큰 파장을 조정 하는 크기와 막대 모양의 microcompartments를 사용 하 여 10,25. 이 분석 결과에 지원된 지질 bilayers는 위에 열려 있는 막대 모양 microcompartments의 몇 백 복제본을 포함 하는 꽃무늬 PDMS 기판에 입금 됩니다. 이것에 의해, 반응 챔버를 오픈에서 설정할 수 있습니다 그리고 이후에 버퍼 microcompartments, 그로 인하여 수감 작은 볼륨에 대 한 반응의 가장자리를 인하 됩니다. 이러한 구획 한쪽에 어 버퍼 인터페이스 있고 따라서 막 풀 3D 감 변하지 않습니다, 비록 단백질 역학 유사 진동10,25 vivo에서 . 풀 3D 감 금에 비해 매우 유사 하 게 보여 주는 결과18, 오픈 마이크로 구조 분석 결과 비교적 간단 하 고 쉽게 처리 하 고 또한 하지 전문된 마이크로 장비를 갖춘 실험실에 의해 수행할 수 있습니다 및 클린 룸 시설입니다.
여기, 우리 현재 MinCDE 패턴 형성에 지질 bilayers에서 지원 체 외에서 광학 현미경에 의해 그리고, 미성년자의 모든 구성 요소와 쉽게 액세스 제어 허용 하는 오픈 챔버를 사용 하 여 재구성 하는 실험 프로토콜 수정, 표면 조사 기법26에 대 한 적응도. 평면 지원된 지질 bilayers 옆 우리는 또한 단백질 감 수 어떻게 표시 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에 간단한 패턴된 지원된 지질 bilayers를 사용 하 여 얻을. 이 분석 실험, 비록 MinCDE 시스템에 최적화 된 옮겨질 수 있다 또한 FtsZ27 등 최소한의 걸 피28막과 유사한 방식으로 상호 작용 하는 다른 단백질 시스템.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

셀의 기본 spatiotemporal 조직의 여러 측면 반응 유포 형식 시스템에 의해 규율 됩니다. 이러한 시스템의 재구성 생체 외에서 가능 하지 않을 것 이라고 그들의 기본 메커니즘의 상세한 연구에 대 한 허용 vivo에서. 여기, 우리는 생체 외에서 의 대장균, 셀 중간에는 세포 분열 심장 MinCDE 시스템의 재구성에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 분석 결과 구성 요소만 자기 조직에 필요한 즉 막, 두 단백질 마음 및 광산 및 ATP의 형태로 에너지를 공급 하도록 설계 되었습니다. 우리는 그러므로 지원된 지질 bilayer 형성 되는 coverslip에 오픈 반응 챔버를 조작. 챔버의 오픈 디자인 지질 bilayer의 최적의 준비 및 대량 콘텐츠 제어 조작에 대 한 수 있습니다. 두 단백질, 마음 및 광산,으로 ATP, 다음 막 위에 대량 볼륨에 추가 됩니다. 영상은 디자인 지원 confocal, 넓은 필드와 비슷하게 TIRF 현미경으로 많은 광학 microscopies에 의해 가능 하다. 프로토콜의 변이에서 지질 bilayer는 셀 모양의 PDMS 마이크로 구조, 유리 대신에 패턴된 지원에 형성 된다. 이 구획의 가장자리에 대량 해결책을 낮추는 작은 구획에는 반응의 포함 하 고 vivo에서 진동 동작의 흉내 낸 수 있는 경계를 제공 합니다. 함께 찍은, 우리 설명 MinCDE 시스템 모두와 함께 공간 감 금 없이 다시 구성할 프로토콜 연구원은 정확 하 게 농도 범위 등 다른 요인의 추가 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 제어할 수 있도록 또는 단백질, 그리고 체계적으로 비교적 간단한 실험 설치 프로그램에서 시스템의 복잡성을 증가.

단백질 정화 우리의 프로토콜에 따라 적절 한 순도의 분 단백질 항복 한다. 참고로, 그림 1 붙일 마음, 광산, 그리고 MinC 이라는 마음의 SDS 페이지 이미지를 제공 합니다. 꽃무늬 비 지원된 지질 bilayers에 MinDE 자기 조직 분석 결과 수행 하는 절차의 각 단계는 그림 2에 설명 되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 표면 파를 여행 하는 일반 MinDE 챔버 (그림 3)에 걸쳐 관찰할 수 있습니다. 파장은 챔버 내에서 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적 패턴 유사. 챔버의 가장자리 형태 UV 접착제에는 유리에 보다 다른 특성을가지고 것 막 표면 ( 그림 3C참조)으로 양적 비교를 위해 사용할 수 없습니다. (그림 3B) 전파 방향에 따라 강도 그려서 여행 표면 파를 분석할 수 있습니다. 마음 형광 파의 앞 가장자리에서 오히려 빨리 정점 다음 후행 가장자리에서 급격히 감소, 동안 광산 형광 마음 물결의 시작부터 거의 선형으로 증가 하 고 후행 가장자리에 마음 후 최대에 도달 어디 그것 6현저 하 게 떨어져 떨어진다.
단백질 품질 옆 지원된 지질 bilayers의 품질이 MinCDE의 일반 자기 조직에 대 한 가장 중요 합니다. 한 손으로 막 너무 지나치게 씻어 또는 기본 표면 청소 되었고 따라서 너무 강하게 충전, 구멍 형성할 수 있습니다 멤브레인 (그림 6A, 상단). 다른 한편으로 막 제대로 세척 되지 또는 기본 표면 청소/hydrophilized 하지 않습니다, 경우 소포 막에 붙어 것입니다 또는 막 유동성 위험 해질 것 이다 (그림 6A, 하단). 비록 하지으로 명백한 레이블이 지질 통해 직접 막 관찰 하는 경우 이러한 문제 수 또한 검출 될 마음 형광 신호에서 패턴은 일반 고는 맥시 마에 형광 균일 하지만 "구멍"를 포함 하거나 그림 6A의 중간 패널에 표시 된 밝은 명소.
막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에서 MinDE 자기 조직에 대 한 절차는 그림 4에 요약 됩니다. 몇 가지 프로토콜 단계 필요가 없습니다 반복 될 것으로 단백질과 지질을 다시 사용할 수 있습니다. 처럼 비 패턴이 기판에 기판 청소 (플라즈마-청소)에 의해 hydrophilized, 지원된 지질 bilayer는 PDMS에 형성 되 고 자기 조직 분석 결과 200 µ L의 볼륨에 설정 되어. 적절 한 막 형성 하고있다 MinDE 자체 막에 구성 확인에 실은 몇 군데. 적절 한 막 형성 되었습니다, MinDE 양식 일반 개별 마이크로 구조 사이 PDMS의 표면에 표면 파를 여행 하 고 또한 자체 구성 마이크로 구조는의 밑에 파도 자유롭게 할 수 있는 전체를 통해 이동 막으로 덮인 표면 (그림 5A). 버퍼 제거 후, 구획 사이 표면 해야 보여주지 전파 MinDE 패턴 (그림 5B), 그것은 완전히 건조 되어야 합니다. MinDE 패턴은 여전히 이동, 더 많은 버퍼를 제거 해야 합니다. 막 입은 PDMS와 상위 인터페이스 (그림 5C), 있는 그들은 자기 조직에 공기 단백질은 이제 막대 모양 microcompartments에 국한 됩니다. 이러한 조건 하에서 두 가지 단백질 그림 5D와 같이 극-극 진동 수행할 수 있습니다. 마음과 나의 일부분은 항상 막 도약, 또한 버퍼 제거 하는 동안 버퍼 제거 후 농도 없습니다 입력 농도 비교. 이 효과 농도 또한 다 같은 coverslip에 개별 마이크로 구조 사이 그들은 버퍼 제거 하기 전에 패턴의 위치에 따라. 실리콘 웨이퍼 생산 또는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 조형 분석 (그림 6B)에 대 한 사용할 수 없는 불완전 한 마이크로 구조에서 발생할 수 있습니다. 또한, 버퍼 때문 제거 마이크로 구조 그리고 과정에서 건조 수 있습니다 따라서, 추가 분석 (그림 6B)에서 제외 해야 합니다. 결과적으로 한 챔버에 마이크로 구조의 일부 분 일 뿐인 원하는 극-극 진동 보여줍니다. 단백질은 마이크로 구조 역학을 분석 하는 kymograph는 전체 구조 (그림 5E) 선택 여 얻어질 수 있다. 때 MinCDE 극-극에서 흔들 리 다, MinC와 마음 구획 (그림 5F) 중간 구획에서 최대 농도와 최소 농도 시간 평균 농도 그라데이션 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> 그림 1: 단백질 담긴의 최종 제품을 보여주는 SDS 페이지. 그의 마음 (33.3 kDa), 그의 eGFP 마음 (60.1 kDa), 그의 mRuby3 마음 (59.9 kDa), 그의 광산 (13.9 kDa)와 그의 MinC (28.3 kDa) 순서로 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> 그림 2: 개별 단계와 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers (1-6 단계)에 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 점선된 상자 청소를 위해 사용할 수 있습니다 이러한 두 가지 옵션 중 하나를 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> 그림 3: confocal 현미경 검사 법에 의해 MinDE 분석 결과의 이미징. A) 일반 분 나선형, 어떤 파 전파 속도, 강도 플롯 및 속도 측정을 얻을 수 있습니다. 사용 농도: 0.6 µ M (30 %eGFP-마음), 마음이 1.8 µ M 그의-광산 (30% 그의-광산-Alexa647) B) 지역에 대 한 예제에서는 정규화 된 강도 음모 a에서 표시 C) 전체 시험 챔버의 개요 (눈금 막대: 1mm로 동일한 단백질 농도 위). 뿐만 아니라 대상 패턴을 관찰할 수 있다 어느 방향으로 돌고 나선. 확대 지역 웨이브 패턴 UV 접착제에 다 하는 방법을 보여 줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> 그림 4: 개별 단계와 막대 모양의 마이크로 구조 (단계 1-5, 7, 8)에서 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 회색 상자 단계 제품을 다시 사용할 수 있는 프로토콜에서 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers에 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> 그림 5: MinDE에 대 한 결과 대표적인 패턴 막대 모양의 PDMS microcompartments에 형성. A) MinDE 표면 파도 여행 형성 PDMS의 표면에 자체 구성 (1 µ M 마음 (30 %EGFP-마음), 2 µ M 내와 2.5 m m ATP). B) 단백질 자체 조직에서 microcompartments 사이의 평면 표면에 중지 후 버퍼는 마이크로 구조의 높이를 낮 췄 다. C) 1 개의 막대 모양 microcompartment의 도식. D) MinDE 극-극 진동 버퍼 제거 후의 대표 이미지. E) D에 표시 된 강조 표시 된 줄을 따라 진동의 Kymograph). F) 이미지와 프로필 D에 표시 된 시계열의 평균 형광 강도의) 명확 하 게 보여주는 microcompartment 기둥에 최대한 고 구획 중에서 최소한의 단백질 그라데이션. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> 그림 6: 부정적인 실험 결과의 예. A) 차선 소포 준비 및 지질 구성 소포 튀어나와 이어질 동안 지나치게 씻어 막 구멍, 축적. 두 센터 패널 모두 문제 하 고 어떻게 그들이 분 진동 관찰의 조합을 표시 합니다. 막 0.05%로 표시 했다 Atto655-마약. (바 규모: 50 µ m) B) 상단 패널: 밖으로 건조 microcompartments 너무 많은 버퍼 제거 하거나 버퍼 시간 동안 증발 하는 때 발생할 수 있습니다. 하단 패널: 불완전 한 구획 웨이퍼 생산 또는 PDMS 성형 동안 형성 될 수 있다. (바 규모: 30 µ m) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: 그의 마음에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: 그의 EGFP 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 3: 그의 mRuby3 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 4: 그의 광산에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 5: 그의 MinC에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 6: 막대 모양 microcompartments의 실리콘 웨이퍼에 대 한 CAD 파일입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.0K 조회수.  Max Planck Institute of Biochemistry. 우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an enormous amount of spectra, setting challenges for quality control of the mass spectrometry spectra. To reduce the false positives, false discovery rate (FDR) quality control is necessary. Recently, we developed a software for FDR control of untargeted metabolome identification that is based on a Target-Decoy strategy named XY-Meta. Here, we demonstrated a complete analysis pipeline that integrates XY-Meta and metaX together. This protocol shows how to use XY-meta to generate a decoy database from an existing reference database and perform FDR control using the Target-Decoy strategy for large-scale metabolome identification on an open-access dataset. The differential analysis and metabolites annotation were performed after running metaX for metabolites peaks detection and quantitation. In order to help more researchers, we also developed a user-friendly cloud-based analysis platform for these analyses, without the need for bioinformatics skills or any computer languages.

We constructed an untargeted metabolomic workflow that integrated XY-Meta and metaX together. In this protocol, we displayed how to use XY-Meta to generate a decoy spectral library from open access spectra reference, and then performed FDR control and used the metaX to quantitate the metabolites after identifying the metabolomics spectra.

FDR 제어 기반 비표적 메타볼로임에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...