תמיכה נתקבל שוויצרי הקרן הלאומית למדע; התוכנית Sinergia שוויצרי; הפולנית-השוויצרי מחקר תוכנית (PSPB-094/2010); NCCR בביולוגיה כימיים; LipidX מן היוזמה SystemsX.ch שוויצרי, מוערכים על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (כדי ג'יי ג'י). O. מ נתמכה על ידי התחברות לטווח ארוך EMBO (ALTF-516-2012).

<ol>
	<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li><li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+Maturation,+Transport+and+Functions.">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li><li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains.">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li><li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting:+all+WASHed+up!.">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!.</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).</li><li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+bodies:+co-ordinated+progression+to+maturity.">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li><li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ESCRT+pathway.">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li><li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation.">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li><li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis.">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li><li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4,+Rab5,+and+Rab11.">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li><li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis.">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics.">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li><li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells.">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li><li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro.">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li><li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system.">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).</li><li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system.">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

אקטין ממלא תפקיד מכריע אנדוזום ממברנה dynamics4,14. בעבר דיווחנו כי אקטין התגרענות הפילמור מתרחשים על endosomes מוקדם, ויוצרים F-אקטין תיקונים קטנים או רשתות. רשתות אלה F-אקטין נדרשים לחלוטין להעברה ממברנה מעבר endosomes מוקדמת לאורך השביל השפלה. הפרעה בשלב כלשהו של תהליך הפילמור התגרענות הזה מונע אנדוזום ההבשלה ובכך תחבורה במורד לעבר המנוח endosomes andlysosomes9,11,15. בפרט, השתמשנו וזמינותו שתוארו לעיל כדי לנתח את השלבים רציפים של פלמור אקטין-F על endosomes מוקדם, כדי לאפיין את התהליך ברמה המולקולרית.
בניסויים אלה, endosomes מוקדמת עם GFP-RAB5 ויוותוויות, מטוהרת על-ידי subcellular fractionation, מודגרות במבחנה בנוכחות ציטוזול כדי לאפשר F-אקטין פלמור במבחנה. בזמן הנסיעה, תגובת הופסקה, תערובת התגובה מועברים לשקופית מיקרוסקופית לצורך ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, שימוש phalloidin כדי לתייג את F-אקטין. באמצעות אסטרטגיה זו ניסיוני, הראינו כי annexin A2 הוא צורך התגרענות של F-אקטין-endosomes מוקדם, יחד עם SPIRE1, בעוד ARP2/3 שמתווכת F-אקטין הסתעפות, כצפוי. גם הראנו כי moesin ו- cortactin נדרשים להיווצרות הרשתות F-אקטין המתווכות ECV/MVB להן ועם בגרות לאורך השביל השפלה של תאים בתרבית של9,11.
חשוב לזכור כי, למרות רמות נמוכות של RAB5 ectopically ביטוי לא תשנה את endosomes בכל מידה משמעותי10, GTPase קטן זה הוא מווסת מפתח בתחילת אנדוזום ממברנה dynamics16,17 . בניסויים מסוימים, לכן ייתכן המתאים תווית endosomes ב וזמינותו באמצעות פרוטוקולי חלופי. לדוגמה, endosomes מוקדמת ניתן בנוחות שכותרתו באמצעות המשדרים פלורסנט endocytosed, כגון עוריות פקטורי גדילה או transferrin4,14.
יש גם לציין כי קשה מבחינה טכנית כדי התמונה חוטים אקטין בודדים עם קונפוקלית קונבנציונלי. לכן, אנו להפנות למבנים F-אקטין לאורך כל הטקסט לתיאור אקטין רשתות על endosomes. כתוצאה מכך, אנו חשים כי היווצרות של רשת F-אקטין ניתן לכמת באופן מדויק יותר על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית שטח הפנים של הרשתות ולא עצמתם.
לא קל לשלול לחלוטין את האפשרות כי הפעילות התגרענות אקטין נצפתה במבחנה מתווך על ידי מבנה או אברון זה כבולים כדי RAB5 endosomes במהלך טיהור מסוימים אחרים. עם זאת, זיהום כזה מאוד לא סביר. בעוד כמה organelles לטהר במשותף על מעברי צבע בגלל מאפיינים פיזיים דומים, הם אינם נוטים להישאר מאוגדים באופן כמותי אחד לשני לאחר טיהור. יתר על כן, הפעילות התגרענות אקטין תלויה אך ורק annexin A24,14, אשר קיים, endosomes מוקדמת המכילה RAB514. בסופו של דבר, אנו מוצאים כי F-אקטין מבנים הקשורים באופן סלקטיבי RAB5 endosomes ויוו , לא יימצאו על אחרים endosomes או על אחרים ממברנות הסלולר4,14. לסיכום, פעילות התגרענות אקטין היא ככל הנראה המשויך RAB5 endosomes, שכן פעילות זו משותפת מטהרת במשותף. רגישה עם RAB5 endosomes.
ב הזה assay, הרבה כמו שאר מבחני זה לשקם תגובות ביוכימיות מורכבים אותו פקד שהדינמיקה של endosomes16 או אחרים ממברנות18 וכי מבוצעות במבחנה, חשוב להבטיח כי ההכנה של תמציות הסלולר הוא אופטימלי. צריך להיות הומוגני תאים בתנאים עדין כדי להגביל את הנזק endosomes organelles אחרים, בעיקר גרעינים ו lysosomes. בנוסף, יש לשמור אנדוזום שברים בקרח בתנאים למזער מתח osmotic, יוניים, וכן פלמור אקטין ספונטנית. ריכוזים נוספים, גבוהה יחסית של שבר אנדוזום (≥0.1 mg/mL) ו ציטוזול (≥ 3 מ"ג/מ"ל) נדרשים עבור פלמור אקטין-F נאותה על endosomes ועל זיהוי, כפי שמצוין שלבים 3.13 ו- 4.4, בהתאמה. בדומה לכך, חשוב לבצע את הבדיקה עם 1:10 יחס של אנדוזום כדי ציטוזול (חלבון: חלבון), כפי שמצוין בשלב 5.1.1. לבסוף, pipetting לאחר פלמור אקטין (קרי, כדי להוסיף כדורגלן ו phalloidin) צריך להיעשות בעדינות כדי למנוע קריסתו או שבירת הרשת אקטין.
במידת הצורך, במבחנה אקטין הפילמור וזמינותו יכול גם להתבצע ישירות במיקרוסקופ הדמיה קאמרית, לאחר הוספת rhodamine מטוהרים-אקטין לתערובת assay, להגבלת לפליטת מכני של הרשתות אקטין polymerized אל endosomes (ראה צעד 5.2.3 ו איור 2). במקרה זה, הוא הטוב ביותר להתאים את התמצית ל 26.5% (0.85 M) סוכרוז (אינדקס השבירה של 1.375), הגבלת דיפוזיה בראונית דמוי תנועה (שלב 5.2.3) וטיהרו להוציא אגרגטים אפשרי של אקטין rhodamine על ידי ultracentrifugation לפני השימוש. התצפיות ש-moesin הזה שולט היווצרות של F-אקטין רשתות על endosomes היו recapitulated באופן מלא באמצעות גירסה חלופית זו שלנו4,assay14.
גם גירסת פרוטוקול שלנו, בו מום או בבית הבליעה הדמיה, הוא אופטימלי עבור ניתוח גלובלית של F-אקטין התגרענות ו פלמור ב- endosomes. עם זאת, לא קל לעקוב אחר תהליך פלמור אקטין בזמן שימוש בגישה זו באופן חלקי, מאחר endosomes אינם משותק. כתוצאה מכך, זה לא קל לעקוב אחר הגידול של חוטים בודדים ובכך לקבוע את ההיסטוריה של הרשת אקטין. לדוגמה, זה יכול להיות קשה להפלות מ מ crosslinking F-אקטין. עם זאת, אנו בטוחים כי תנאים לפיקוח פלמור אקטין-F בזמן אמת יכול להשתפר בבית הבליעה הדמיה ולמצות את התנאים על מנת לשתק endosomes. באופן דומה, יהיה מעניין לעקוב אחר פלמור אקטין-F של ממברנות מלאכותיות באמצעות רכיבי מטוהרים. למעשה, אנחנו בעבר הראו כי F-אקטין התגרענות הפילמור יכולים להתרחש על ליפוזומים לאחר איגוד tהוא פקטור התגרענות annexin A2 על גבי ה bilayer ליפוזום11. אסטרטגיה זו יהיה שימושי לנתח עוד יותר את תפקיד ספציפי שומנים וחלבונים ב התגרענות F-אקטין את תהליך הפילמור לאפיין מינימלי הרכיבים הדרושים ליצירת רשת F-אקטין על ממברנות endosomal. לבסוף, אנו מאמינים כי אסטרטגיה זו תהיה שימושית מאוד ללמוד תהליכים אחרים תלויי-אקטין-F המתרחשות על ממברנות אנדוזום, במיוחד הגיוס והתגייסות של מכונות שטיפה/retromer.

התאים האיקריוטים גבוה יותר, חלבונים ושומנים הם הפנימו לתוך מוקדם endosomes איפה המיון מתבצע. כמה חלבונים ושומנים, שנועד להיות reutilized, שולבו צינורי מחוזות endosomes מוקדמת, ואז מועברים קרום פלזמה או טרנס-גולג'י רשת (TGN)1,2. לעומת זאת, חלבונים ושומנים אחרים ארוזים באופן סלקטיבי לתוך מחוזות endosomes מוקדמת כי התערוכה מראה multivesicular. אזורים אלה הרחב, על ניתוק ממברנות endosomal מוקדם, בסופו של דבר בוגרת לתוך שלפוחית המוביל endosomal חינם או גופים multivesicular (ECV/MVBs), אשר אחראים על תובלת המטענים לעבר המנוח endosomes1, 2.
אקטין ממלא תפקיד מכריע בתהליך שיפוץ ממברנה המשויכים להן אנדוזום והיכולת מיון endosomal. חלבון מיון לאורך המסלולים מיחזור קרום פלזמה או את TGN תלוי את retromer קומפלקס החלבונים הקשורים. מכונות מיון זה נראה להיות מצמידים את היווצרות של מיחזור בקוריאנית באמצעות האינטראקציות של retromer מתחם עם צרעה והצלקת homologue (שטיפה) מורכב, מסועף אקטין3,4,5 . לעומת זאת, מולקולות המיועדים השפלה, במיוחד הפעלת קולטנים איתות, מסודרים לתוך שלפוחית intraluminal (ILVs) על ידי endosomal מיון מתחמי הדרושים עבור תחבורה (ESCRT)2,6, 7. בעוד תפקיד אפשרי של אקטין בתהליך מיון תלוי-ESCRT אינו ידוע, F-אקטין ממלא תפקיד חשוב להן של ECV/MVBs, תחבורה מעבר endosomes המוקדמות. בפרט, מצאנו כי annexin A2 נקשר מועשרת כולסטרול אזורים של אנדוזום מוקדם, ויחד עם spire1, nucleates פלמור אקטין-F. היווצרות של הרשת אקטין מסועף מובחנים endosomes דורשת את הפעילות הסתעפות של החלבון אקטין הקשורות (ARP) 2/3 מורכבים, כמו גם את moesin חלבון ERM ו-8,9cortactin חלבון מחייב אקטין.
כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות. Assay הזה שימש בעבר כדי לחקור את התפקיד של annexin A2 ב- F-אקטין התגרענות ואת moesin ואת cortactin על היווצרות endosomal אקטין רשתות8,9. עם זה פרוטוקול במבחנה , הסדרה מורכבת של התגובות המתרחשות על endosomes במהלך פלמור אקטין הופכים לבצע ניתוח הביוכימי והמולקולרי של השלבים רציפים של התהליך, לרבות התגרענות אקטין, ליניארי פלמור, מסעף ו crosslinking.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1287">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:477px;">NaCl</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71380</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>196770010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424370025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesiun acetate tetrahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017101001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10253286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236624001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehide</td>
			<td>Polysciences. Inc</td>
			<td>380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 555 phalloidin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actin rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton. Inc</td>
			<td>APHR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DABCO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 0.22um</td>
			<td>Millex&#160;</td>
			<td>SL6V033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Round 10cm dishes for cell culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>569/3 40569003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-ml polypropylen tube&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hypodermic Needle 22G Black 30mm&#160;</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro glass slides&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>2406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18X18-mm glass coverslip</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1000/1818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200-&#956;l yellow tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1000-&#956;l Blue Graduated Tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5-ml test tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C 311-04-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18-mm diameter round coverslip&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1001/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19&#160;mm)&#160;</td>
			<td>In vitro Scientific</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>79729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>TL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>335649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>346936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fugene HD transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:145px;">E2311</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent A</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent B</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent S</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Meter 691</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NIH, Bethesda MD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

פונקציות רבות אנדוזום מוקדם, במיוחד מטען החלבון ומיון ממברנה דפורמציה, תלויים כתמים של חוטים F-אקטין קצרים nucleated על גבי קרום endosomal. הקמנו מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה גנטי וביוכימי מניפולציות. שברים Endosomal מוכנות על ידי ציפה במעברי צבע סוכרוז מתאי לבטא את החלבון endosomal מוקדם GFP-RAB5. שברים cytosolic מוכנות של קבוצות נפרדות של תאים. הן endosomal והן cytosolic שברים ניתן לאחסן קפוא חנקן נוזלי, במידת הצורך. ב וזמינותו, endosomal ואת cytosolic שברים מעורבים, התערובת מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים המתאימים (למשל, יונית כוח, להפחית את הסביבה). בזמן הנסיעה, תערובת התגובה הוא קבוע, F-אקטין מתגלה עם phalloidin. התגרענות אקטין, הפילמור מכן נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. כאן, אנחנו מדווחים כי assay זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של הגורמים המעורבים או אקטין התגרענות על הקרום, או התארכות עוקבות, מ., או crosslinking של F-אקטין חוטים.

כדי לקבל תובנות לגבי היווצרות של F-אקטין תיקונים הקרומים אנדוזום מוקדם, עקבנו פרוטוקול המתוארים באיור2. בקצרה, התאים היו transfected עם GFP-RAB5, ואז endosomes מוקדם הוכנו על ידי subcellular fractionation. אלה endosomes מוקדם מטוהרים היו מודגרות עם ציטוזול על מנת לספק אקטין עצמה, כמו גם גורמים אחרים שייתכן ומעורבים התגובה. בסוף תקופת הדגירה, התגובה נעצר על ידי קיבוע של התערובת. לאחר מכן, מדגם היה אסף, שהופקדו על שקופית מיקרוסקופיים. לבסוף, F-אקטין נחשף עם phalloidin (איור 3 א). התגרענות של F-אקטין על גבי ממברנות endosomal מוקדם, כמו גם את תהליך הפילמור הבאים התרחש במהירות. אכן, F-אקטין יכולים כבר ניתן לאבחן על endosomes בתוך 1 דקות לאחר תחילת התגובה (איור 3 א).  מבנים אלה אקטין, שהיו בתחילה קצר, הפך במהירות יותר, מסועף, מקושרים אחד לשני שמוביל להיווצרות רשת שזור של אקטין חוטים (איור 3 א), ככל הנראה משקף דינמיקה אקטין לא מאוזן במבחנה. התגרענות דומה וקצבי הפילמור נצפו כאשר וזמינותו בוצע עם מטוהרים אקטין התווית על-ידי rhodamine בנוסף ציטוזול תא. זה נעשה במנות תת כך מבנים יכול לדימות ישירות, בהעדר כל ההפרעות (איור 3B). ב וזמינותו המתוארים כאן, endosomes מוקדמת nucleate de novo פלמור אקטין באופן סלקטיבי. אכן, פלמור אקטין לא התרחשה כאשר התגובה במבחנה בוצע בהיעדרו של endosomes או ציטוזול. ניתן לפיכך להסיק שמקדם כי מוקדם endosomes להחזיק את היכולת הבסיסית תומכת התגרענות עוקבות פלמור אקטין-חוטים-9,-11.
כדי לנתח את הכמות של אקטין polymerized מן endosomes, תמונות רכשה במועדים שונים נותחו באמצעות CellProfiler (איור 4A). הכמות של אקטין polymerized לכל אנדוזום נמדדה כאזור של אקטין המקיפים של אנדוזום מוקדם יחיד. הקצב פלמור אקטין היה גבוה יותר בתחילת התהליך, פחתה עם הזמן (איור 4B).  הרשת אקטין ניתן לנתח בפירוט רב יותר בנקודות זמן מוקדם לאחר תחילת התגובה. בנקודות אלו בתחילת הזמן-, מבנים המכילים אקטין בודדים יכול להיות עדיין ניתן להבחין אחד מהשני. על מנת להעריך מורכבות הארגון של רשתות אקטין, נספר מספר חוטים אקטין שמקורם כל אנדוזום (קרי, ראשי חוטים). באופן דומה, נמנו מספר חוטים אקטין שמקורם העיקרי חוטים (קרי, חוטים משני), כמו גם המספר של כל חוטים אחרים של אקטין זה יכול להיות מזוהה בהרשתות, אשר מקורן אינו endosomes ( כלומר, חוטים אחרים) (איור 4C-E. ברגע חוטים אקטין שנקשרו, פרמטרים אחרים, כגון אורך חוטים אקטין בודדים ומספר endosomes מחובר על חוטים אקטין אותו, יכול להיות בקלות לחשב (איור 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig1.jpg"> 
איור 1: שלב החדות Micrograph של Homogenate הלה תא. לאחר המגון, התמצית היה רכוב בין שקופית מיקרוסקופיים של coverslip. לפרסום, נלכדו micrographs עם יעד X 100 לאחר טבילה שמן. לבדיקה שגרתית, עם זאת, תמצית תא היה מדמיין תחת 20 X או מטרה X 40 ללא שמן טבילה. שתי דוגמאות ההגדלה גבוהה נוף של homogenate מוצגים (A-B). גרעינים (סטאר) מופיעים מבנים עגולים בצבע אפור כהה בצבע, ללא שאריות תא המצורפת. חצים הצבע גרגרי האופיינית של בגדלים, צורה, טבלתי, אשר משתחררים על התא המגון ומתייחסים אליהם חומרים תאיים (קרי: organelles). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig2.jpg"> 
איור 2: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. תיאור סכמטי של הפרוטוקולים הנמצאים בשימוש כדי להכין תמציות endosomal (א) ואת ציטוזול תמציות (B) וכדי לפקח פלמור אקטין endosomes במבחנה (C). תגובת שיקוע (SN), מאגר המגון (HB), תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית), הגרעין גלולה (NP) ו paraformaldehyde (PFA). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig3.jpg"> 
איור 3: התגרענות, פלמור של F-אקטין ב מוקדם Endosomes במבחנה. Endosomes (א) מכל הלה תאים לביטוי GFP-Rab5 (ירוק), הלה ציטוזול הוכנו בנפרד. ב וזמינותו, endosomes מוקדמת (אייתה) היו מעורבבים עם ציטוזול ולאחר התערובת, נדגרה על הצביעו פעמים. התערובת היה קבוע, המסומנת phalloidin (אדום) לתווית F-אקטין, ואז נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית. ברים: 10 מיקרומטר (החלונית העליונה), 5 מיקרומטר (פאנל התחתונה). (B) אייתה מכל הלה תאים המבטאים GFP-Rab5 (ירוק), הלה ציטוזול הוכנו בנפרד. תמציות תא אלו היו מודגרות עם מטוהרים rhodamine-אקטין (אדום) עבור הצביעו פעמים בתאי מיקרוסקופ, נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) הניסוי בוצע כמו A. ציטוזול הלה (ללא אייתה), הלה endosomes (ירוק) המסומנת GFP-Rab5 (ללא ציטוזול) היו מודגרות בנפרד (לוחות הימנית והאמצעית) או ביחד (לוח נכון) במשך 30 דקות, קבוע, המסומנת phalloidin (אדום) לתווית F-אקטין, נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55829/55829fig4.jpg"> 
איור 4: ניתוח של הרשת אקטין. זרימת עבודה של ניתוח CellProfiler (א). (B) מספר אקטין polymerized היו לכמת באופן יחסי מספר endosomes באמצעות התוכנה CellProfiler. הנתונים הם s.e.m. ± החציוני (n = 3). הנתונים הם אמצעי ± ש (n = 3). 5 דקות לעומת 15 דקות (ns P= 0.0736), 5 דקות לעומת 30 דקות (* P = 0.0195), ו- 15 דקות לעומת 30 דקות (ns P = 0.3129). (ג)Endosomes מוקדם (אייתה) מטוהרים מתאי הלה לבטא ציטוזול GFP-Rab5 והלה הוכנו בנפרד, וזמינותו התבצע כמו דמות 2A. דוגמאות תוקנו לאחר 7 דקות. הלוח האמצעי מציג את micrograph אותו, עם החפיפה של שרידי מבנים F-אקטין שצויר באמצעות תוסף NeuronJ13 של התוכנה ImageJ. בחלונית ' נכון ' מציג רק את העקבות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. ייצוג (D) F-אקטין מבנה רצף המספור בשימוש כימות עם תוכנת ImageJ. כימות (E) של המספר של אקטין חוטים, כפי שמוגדר ב- C-D. הנתונים הם אמצעי ± ש (n = 3). ראשי סניפים לעומת ענפים משניים (ns P = 0.5262), ענפים משניים לעומת ענפים אחרים (ns P = 0.6815), ראשי סניפים לעומת ענפים אחרים (ns P = 0.2254). (F) האורך של F-אקטין מבנים ואת המספר של EEs לכל מבנה אקטין מוצגות דוגמאות של פרמטרים אחרים מאשר ניתן לנתח עם כימות המוגדרים ב- C-D. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55829/55829fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes at JoVE.com

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Views.  University of Geneva. פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

Video: In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.