우리는 보호자의 분석에 그녀의 도움이 조언 박사 클라우디아 Cremers 감사합니다. 켄 완은 HdeB 정화에 자신의 기술 지원을 인정 받고 있습니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에서 제공하는 박사 연구 친교에 의해 지원됩니다 (JCAB에) 하워드 휴즈 의학 연구소 JCAB 및 UJJ-UD에 보건 부여 RO1 GM102829 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 발현 및 주변 세포질 HdeB의 정제 참고 : HdeB는 E. 표현했다 폴리 믹신 용해시의 페리 플라 즘에서 플라스미드 pTrc- hdeB 10 및 정제를 보유하는 대장균 세포. <ol><li> E.의 야간 문화를 준비 200 μg의 / ㎖의 앰피 실린 (LB 앰프)를 포함하는 30 ml의 LB에 플라스미드 pTrc- hdeB (10)를 숨겨 대장균 세포. 0.7 OD를 600 ㎚에 도달 할 때까지 LB 앰프 네 1 L 배양 물을 접종하고 37 ℃에서 성장을 200 RPM. 그리고, HdeB의 발현을 유도하고, 30 ℃로 성장 온도를 감소 300 μM IPTG를 추가한다. </li><li> 30 ℃에서의 단백질 발현을 5 시간 후에는 4 ° C에서 5 분 동안 8000 × g으로 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 8,000 XG에서 세포를 다시 A (50 mM 트리스 / 염산, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)와 원심 분리기 버퍼 100 ㎖로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 그 후,에 resuspend80 세포 펠렛은 용액 1 ㎎ / ㎖ 폴리 믹신 설페이트를 함유하는 버퍼. 외막의 효율적인 붕괴를 들어, 부드럽게 4 ° C에서 1 시간 동안 정지를 저어. </li><li> 세포질 분획 및 세포 파편을 제거하려면, 4 ℃에서 15,000 XG에서 20 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 이 ~에 용해 HdeB를 포함하는 60 ml의 상층 액을 발생합니다. </li><li> 6 kDa의 MW 갖는 투석막을 이용하여 버퍼 B (20 mM 트리스 / 염산, 0.5 mM의 EDTA, pH를 8.0)의 150 배 부피에 대해 밤새 주변 세포질 추출물을 함유하는 상청액을 투석 차단한다. 3 kDa의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 15 ml의 단백질을 농축시킨다. 0.2 ㎛의 기공 필터를 사용하여 단백질 용액을 필터. </li><li> 2.5 ㎖ / 분의 유속으로 5 컬럼 부피의 완충액 B로 평형화 한 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼 (컬럼 부피 5 ㎖)에 단백질을 적용한다. 단백질이 컬럼에로드되면, 10 분에 대한 버퍼 B와 열을 씻어/ 분으로 2.5 ㎖의 유속. 2.5 ㎖ / 분 (6)의 유량을 50 분의 시간주기 동안 버퍼 B에서 0.5 M 염화나트륨 0 내지 선형 구배로 용출 HdeB. </li><li> 15 % SDS-PAGE를 사용하여 HdeB을 포함하는 분획을 확인합니다. 5 ㎕의 5 배 감소 SDS 로딩 버퍼 20 μl의 샘플을 섞는다. 로드 (10) 젤 위에 μL 및 트리스 - 글리신 버퍼 (14.4 g / L의 글리신, 2.9 g / L 트리스 1 g / L 황산 도데 실 나트륨, 산도 8.3)에서 실행됩니다. 브로 모 페놀 밴드가 젤 (~ 45 분)의 바닥에 가까운 마이그레이션 할 때까지 150 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 풀 모든 HdeB 함유 분획 4 L HdeB 저장 완충액에 대하여 밤새도록 4 ℃에서 투석 (50mM 트리스 / 염산, 200 mM의 염화나트륨, pH를 8.0), 및 분자량 원심 필터 유닛을 이용하여 약 300 μM로 단백질을 농축 컷 - 오프 3 kDa의의를. 흡광 계수 ε = 280 ㎚에서 15,595 M을 사용하여 280 nm에서 HdeB의 농도를 결정 -1 cm -1. 100 ㎕를 분취 및 플래시없는 준비액체 질소의 분취 량을 &#39;제. 주 : HdeB 적어도 6 개월 -70 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. 보호자 활동 분석 말 레이트 탈수소 효소를 펼쳐 열적으로 사용 (MDH) 주 : 열 상이한 pH 값에서 돼지 미토콘드리아 말산 탈수소 효소 (MDH)를 전개의 응집 그래피 HdeB의 영향을 아래와 같이 조사 하였다. 나열된 모든 단백질 농도는 단량체 농도를 참조하십시오. <ol><li> MDH를 제조 밤새 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대하여 4 ℃에서 MDH을 투석 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 100 μM로 단백질을 농축 kDa의. 참고 : MDH는 황산 암모늄 용액으로 전달 될 때 MDH의주의 투석이 필요합니다. </li><li> 집계를 제거하려면, 4 ℃에서 20,000 XG에서 20 분 동안 단백질을 원심 분리기. ε &lt;(280 nm에서 흡광도 MDH 농도를 측정서브&gt; 280 나노 미터 = 7950 M -1 cm -1). MDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 온도 조절 샘플 홀더 및 교반기가 장착 된 형광 분광 광도계에 1 ml의 석영 큐벳을 놓습니다. 설정 λ 전 / EM 350 nm이다. </li><li> 큐벳과 세트 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에 미리 예열 (43 ° C) 버퍼 D (150 mM의 인산 칼륨, 150 mM의 염화나트륨)의 적절한 볼륨을 추가 43 ° C에 큐벳 홀더의 온도. 총 부피는 1000 μL이다. </li><li> 0.5 μM의 MDH 첨가 한 후 상기 버퍼 12.5 μM HdeB (또는 대안 적으로, 버퍼 컨트롤 HdeB 저장 버퍼의 동일 부피)을 추가한다. 광산란 모니터링을 시작. MDH의 전개 충분한 수 있도록 360 초 동안 반응을 품어. </li><li> HPO 4 2 M 버퍼링 K 2의 0.16-0.34 볼륨을 추가하여 7 pH를 올리고 다시 계속또 다른 440 초 동안 광 산란 등에 이용. </li><li> 중화 이후 소정 시점에서 샤페론의 부재에 기록된다 MDH 응집의 정도를 100 %로 설정 (여기서는 MDH의 최대 광산란 관찰 하였다 500 초 후). 각각 나타낸 pH 값에서 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 HdeB의 활성을 정상화. </li></ol> 분석 초 원심 분리에 의해 HdeB-LDH 복합체 형성 3. 검출 (AUC) 주 : HdeB 단독으로 또는 열적 젖산 탈수소 효소 (LDH)를 전개로 복잡 침강 속도 실험 분석 초 원심 분리기를 사용하여 수행 하였다. <ol><li> 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대해 밤새 39 ° C에서 LDH를 투석, LDH을 제조 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 200 μM로 단백질을 집중 kDa의. 참고 : LDH의주의 투석이 LD로 필요H는 황산 암모늄 용액으로 전달된다. </li><li> 4 ° C에서 20,000 XG에 20 분 동안 집계, 원심 분리기 LDH를 제거합니다. 280 nm에서 흡광도 LDH 농도를 측정 (280 nm의 ε = 43,680 M -1 cm-1). LDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 41 ° C에서 15 분 동안 버퍼 D에 30 μM의 HdeB의 유무 (각각의 pH 4, 7)에서 3 μM의 LDH을 품어. 참고 : 완전한 집계에 높은 온도 결과에서 LDH의 배양 및 HdeB없이 보호자 효과를 관찰 할 수있다. </li><li> 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 그런 다음, 표준 분야를 포함하는 세포로로드 샘플은 1.2 cm 경로 길이와 2 채널 중앙 장식품을 형성. 초원 심 분리기에 세포를로드 전에 침전 적어도 1 시간 동안 22 ° C 평형. </li><li> 스핀 22 ° C에서 샘플을 12 시간 동안 각각의 로터에서 167,000 XG, 그리고 나오지도를 모니터링계속해서 280 nm에서의 단백질 imentation. 이미 증명 된 바와 같이 각 채널의 투과광 강도보다 오히려 흡광도를 측정 할 때, 신호 대 잡음비가 향상된다. 이는 또한 후속 데이터 피팅의 품질을 향상시킨다. </li><li> 연속 C (S) 배포 모델 (17)을 사용 SEDFIT (버전 15.01b 2015 12월)으로 데이터 분석을 수행. 방법 SEDFIT를 사용하는 설명하는 튜토리얼 참조 (18)에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 0.7에 ME (최대 엔트로피) 정규화에 대한 신뢰 수준을 설정합니다. </li></ol></li><li> SEDNTERP 19 사용하여 버퍼 밀도뿐만 아니라 점도를 계산합니다. 집계 클라이언트 단백질의 양을 추정 기준으로 pH 7로 pH를 4로 침강 LDH의 적분 값을 비교한다. 주 : 침강 분포도의 통합 SEDFIT에서 직접 수행 될 수있다. 침강 속도 데이터를 분석하는 다른 소프트웨어는 최근의 검토 (20)에서 찾을 수있다. &lt;/ 리&gt; </ol> HdeB의 존재 4. 모니터링 MDH 불 활성화 및 재 활성화 주 : pH의 펼친 MDH의 폴딩 그래피 HdeB의 영향에 MDH 중화 활성을 모니터링함으로써 측정 하였다. <ol><li> 부재 또는 25 μM의 HdeB의 존재에 37 ° C에서 1 시간 동안 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에서 버퍼 D 1 μM의 MDH을 품어. 그 후, 10 분 동안 20 ℃로 온도를 이동. 주 : MDH는 37 °의 C보다 높은 온도에서 배양했을 때 어떤 MDH의 폴딩 심지어 HdeB의 존재는 관찰되지 않았다. </li><li> 산 변성 된 MDH의 폴딩을 개시 0.5 M 인산 나트륨, pH를 8.0 0.13-0.42 양을 첨가하여 pH 7로 시료를 중화한다. </li><li> 20 ° C에서 2 시간 동안 배양 한 후, 340 nm의 구에서 NADH의 감소를 모니터함으로써 MDH 활성을 결정한다. 참고 : MDH는 L 말 산염에 옥 살로 아세테이트의 NADH 의존 감소를 촉매한다. <oL&gt; <li> 분석 완충액 950 μL의 (50 mM의 인산 나트륨, pH를 8.0, 1 밀리미터 옥 살로 아세테이트 및 150 μM NADH)와 인큐베이션 반응물 50 μl를 섞는다. 참고 : 분석 버퍼에 MDH의 최종 농도는 44 nM의해야합니다. </li><li> 20 ° C로 설정 펠티에 온도 제어 블록을 구비 한 분광 광도계 흡광도의 변화를 모니터한다. </li><li> pH를 7.0로 유지 된 44 nM의 기본 MDH에 MDH 활동 상대를보고합니다. </li></ol></li></ol> E.에 HdeB 과발현 5. 효과 산 스트레스에서 대장균 생존 참고 : E. 대장균 MG1655의 게놈 DNA가 발행 프로토콜 (21)을 사용하여 단리 하였다. <ol><li> E.에서 hdeB를 증폭 를 BamHI-레브 GGT의 GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA의 GTC의 AT &amp; T와 hdeB - -를 EcoRI-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C를 PCR 프라이머의 hdeB를 사용하여 대장균 MG1655 </li><li> 다음과 같이 50 μL의 PCR 반응 설정 : 10 μL 5 배 중합 효소 버퍼, 200 μM의 dNTPs, 0.5 μM 프라이머 JUD2, 0.5 μM 프라이머 JUD5, 150 ng를 게놈 DNA의 MG1655, 0.5 ㎕의 DNA 중합 효소를, DDH 2 O 50 μl를 추가합니다. </li><li> 다음과 같이 hdeB의 증폭을 수행 1 단계 : 95 ° C, 1 사이클에서 5 분; 2 단계 : 95 ° C에서 30 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C, 40 회에서 30 초; 3 단계 : 72 ° C에서 10 분. </li><li> 제한 부위 클로닝을위한 표준 방법을 이용하여 플라스미드를 EcoRI pBAD18의 I 및 I를 BamHI 부위로 PCR 단편을 생성 클론. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. 시퀀싱 (10)에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. </li><li> HdeB 또는 변형 BB7224에 빈 벡터 제어 pBAD18 (Δ rpoH) (유전자형 발현하는 플라스미드 변환 : F를 - λ - E14 - [araD139] B / r에 [6 (된 argF-락) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (SM R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: 테네시 (10) (TC S) suhX401 deoC1 아라드 + rpoH :: 관 + 16) 화학적으로 유능한 세포를 사용. 참고 :이 변형 온도를 구분합니다. </li><li> 45 초 42 ° C에서 열 충격과 이전에 도금을 한 후, 30 ° C, 200 rpm에서 세포를 배양한다. 긍정적 인 클론의 단일 콜로니 연속 아웃을 수행하고 하룻밤에 30 ° C를 품어. 50 ml의 LB 앰프에서 하룻밤 문화를 준비하고 200 rpm으로 30 ℃에서 세포를 배양. </li><li> 밤새 배양 물을 25ml의 LB 앰프로 40 배 희석하고 HdeB 단백질 발현을 유도하기 위하여 30 ° C 및 OD를 600 ㎚ 내지 200 RPM = 1.0 0.5 % 아라비 노스 (아)의 존재 하에서 박테리아 성장. </li><li> pH를 변화 실험에, LB를 사용앰프 + 아라는 0.5 OD의 600 ㎚로 세포를 희석 (여기서는의 pH 2.0, pH가 3.0, pH를 4.0) 각각의 pH 값을 조정합니다 (5) M 염산의 적절한 볼륨을 추가하여. </li><li> 표시된 시점 (하여 pH 3, 2.5 분; pH를 2, 1 분, 4의 pH, 30 분) 한 후, 5 M NaOH를 적절한 양을 첨가하여 배양을 중화. </li><li> OD 측정을 사용하여 30 ℃에서 12 시간 동안 액체 배양에서 중화 문화의 성장을 모니터링합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

<html> 활성화 및 HdeB의 샤페론 기능의 메커니즘을 연구하기 위해, HdeB 다량이 발현되고 정제 될 수있다. 발현 벡터 시스템의 숫자는이 연구에 사용 하였다 둘 PTRC 또는 pBAD 벡터를 포함하는 목적 단백질의 높은 수준의 생산에 사용할 수있다. 발기인은 E.에 대해 쉽게 접근 할 수 있습니다 대장균 RNA 중합 효소 및 E.에서 HdeB의 이렇게 강하게 상향 조절 허용 식 대장균 균주. 이 측면은 rpoH 결핍 균주가 사용 된 산 스트레스 조건 하에서 HdeB의 생체 과발현 연구에 특히 적합하다. 이 균주는 보호자의 대부분을 부족하고, 따라서 높은 온도, 낮은 pH 및 산화 스트레스 (15)을 포함하는 다양한 스트레스, 대한 더 민감하다. 대안으로, 생존 목적 유전자 결여 변이주에서 수행 될 수있다 여기에서 제시된 것과 유사한 연구. t &quot;&gt; 임의 샤페론 활성에 대한 실험 설계 또는 폴딩 분석은 클라이언트 유형 클라이언트 단백질의 농도 및 버퍼 상태에 관해서 모두 신중하게 고려되어야한다. 예컨대 전형적인 샤페론 분석 모델 클라이언트 단백질에서 시트 레이트 신타 제, 루시 페라 제 또는 말산 탈수소 우레아 또는 구아니딘 HCl을 고농도 변성과 응집 23,13을 유도 변성제 프리 버퍼로 희석된다. 샤페론의 존재 하에서 측정은 단백질 응집을 방지하는 정도를 알 수있다. 대안으로, 클라이언트는 열적으로 펼쳐진 단백질 응집은 두 경우 모두에서, 광 산란 측정은 단백질 응집을위한 리드로서 사용된다. 모니터링된다. 액티브 샤페론함으로써 광 산란 신호 (6)의 감소를 초래 클라이언트 단백질을 전개의 응집을 방지한다. 둘 이러한 실험 셋업 낮은 pH 항온 처리와 결합 될 수있다. 또 몰 평가에특정 클라이언트 단백질의 응집을 방지하는 능력을 모니터링함으로써 ecular 샤페론 활성을 비 압박 상태로 복귀 할 때 클라이언트 폴딩에서 샤페론의 영향이 24을 시험 할 수있다. 클라이언트 단백질들의 활성화 및 비활성화에 대한 정량적 판독로서 사용될 수 효소 활성을 보유 할 때 특히 간단하다. 보호자 매개 폴딩이 자연스럽게 ATP 의존적 인 과정이지만, 같은 HdeA, HdeB 및 스파이 등 주변 세포질 보호자는 페리 플라 즘 9,25 에너지의 부족과 일치하는 ATP 독립적 인 방식으로 폴딩 클라이언트를 촉진하는 것으로 나타났다. 이러한 HdeB 같은 산 보호 보호자의 pH 최적의 공부 인해 여러 가지 이유에 도전 : 같은 시트 레이트 합성 효소 심지어 잘 구축 된 보호자 클라이언트 단백질의 (ⅰ) 집계 행동이 산성 pH에서 차이가; 및 (ii) 만 약간 버퍼 시스템은 2-5 사이의 pH 범위에서 작동하고있는 수이관심있는 보호자와 클라이언트 모두 단백질 표. 우리는이 산성 pH 조건 하에서 비 이상적인 완충 시스템 것을 알고 있지만, 포스페이트 버퍼를 사용하기로 결정했다. 그러나, 인산 완충액, 산 활성화 샤페론 9,22로 HdeA의 특성을 잘 맞는 것으로 밝혀졌다. 집계 측정 온도 또는 버퍼 내용의 변경으로 매우 민감하다. 위양성 결과를 제거하기 위해, 우리는 따라서 항상 클라이언트의 집계에 보호자 저장 버퍼의 영향 (그림 1, 버퍼 제어)을 테스트하는 것이 좋습니다. 때때로 클라이언트 단백질의 응집은 심지어 가장 샤페론은 응집 공정과 경쟁 할 수 없을 수도 너무 빨리 일어난다. 이는 최적의 분석 조건을 찾기 위해 예비 시험을 수행하는 것이 필수적이다. 이러한 상황에 대한 좋은 예는&gt; 42 ° C의 온도에서 LDH의 배양이 너무 빨리 여기서 우리의 초 원심 분리 실험에 주어진 경우에도 그HdeB의 과잉의 존재는 LDH의 응집을 방지하지 않습니다. 또한, 샤페론 / 코 - 샤페론 비율 또는 보호자 / 클라이언트 비가 23 신중히 결정해야한다. 예비 실험에서 1 그것은 HdeB의 보호자 활동을위한 최적의 pH로 pH를 4 식별에 도움을주었습니다 : 50의 MDH 비율 : 우리는 상당히 높은 HdeB를 사용하기 시작했다. 가장 효과적인 비율로 1 : 25 식별, pH를 4에서 1 : 1과 50 : 1 사이의 MDH 비율 : 우리는 다음 HdeB 분석을 계속했다. 반면, HdeA 10로 MDH 응집을 억제 : 1 보호자 : 클라이언트 비율 6,9,10,22합니다. 클라이언트 비율 완전히 MDH 응집을 억제하기에 충분했다 : 따라서, 우리는 HdeA가 HdeB에 비해 낮은 보호자로서 MDH 응집을 억제하는데 더 효과적이라고 결론 지었다. 단백질 응집의 샤페론 - 매개 억제을 조사하는 또 다른 방법은 스핀 - 다운 분석법 클라이언트 응집체를 원심 분리에 의해 제거하고, SDS PAGE에 의해 정량화 된을 포함한다. 이 방법은 m 적합생체 내 단백질 응집에 샤페론의 영향을 onitoring. 하나가 과발현 또는 관심의 보호자 부족 돌연변이 균주는 단백질 전개 스트레스 조건에 노출되어있다. 이어서, 세포는 용해되고, 용해 및 응집 분획을 분리하고 15,16,26 정량화된다. 클라이언트 - 샤페론 복합체의 검출을 위해, 우리는 분석적 초 원심 분리에 적용 하였다. 두 단백질은 280 nm에서 흡수로는 실험 설정에 따라이 직접 복잡한 바인드 된 HdeB의 양 및 LDH 단량체를 정량화 할 수없는 것을 주목해야한다. 원한다면, 클라이언트 샤페론 복합체의 화학량 별도로 그 여진 최대 가시 범위 내에 발색단과 클라이언트 샤페론 단백질을 라벨링에 의해 결정될 수있다. 대안 적으로, 착물 내의 보호자에게 클라이언트의 화학량 론은 정량적 인 웨스턴 블롯 결합 천연 PAGE를 이용하여 결정될 수있다. </P&gt; 여기에 제시된 프로토콜에 따라, 우리는 두 분자 보호자, HdeA 및 HdeB 9,10,22을 특성화 할 수 있었다. 일반적으로, 이러한 분석은 또한 시험 관내 및 생체 내에서 단백질 폴딩의 분자 샤페론의 잠재적 인 억제제의 역할을 조사하기 위해 이용 될 수 또는 산 스트레스 클라이언트 응집을 방지하는 능력에 대해 합성 샤페론을 테스트하기 위해 적용될 수있다. 또한, 여기에 제시된 프로토콜은 활성화 메커니즘으로 되거하기 위해 점 돌연변이 및 / 또는 산 - 활성화 된 샤페론의 절단 변이체 분석에 사용될 수있다.

미생물 병원체가 산에 의한 단백질 전개 상황을 경험하는 일반적인 자연 환경은 그 산성 pH 식중독 병원균 1에 대한 효과적인 장벽 역할을하는 포유류 위 (pH 범위 1-4)입니다. 아미노산 측쇄 양성자로 인한 단백질 응집 펼쳐지는 생물학적 과정, 손상 세포 구조에 영향을 미치며, 결국 세포 사멸 1,2-시킨다. 박테리아 페리 플라 즘의 pH 의한 다공질 외측 막을 통한 양성자의 자유로운 확산을 거의 즉시 환경 pH를 평형화하기 때문에, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질과 내막 단백질 산 스트레스 조건 3 하에서 가장 취약한 세포 성분이다. 빠른 산 - 매개 손상에 대한 자신의 주변 세포질 프로테옴을 보호하기 위해, 그람 음성 세균은 산 활성화 주변 세포질 보호자 HdeA 및 HdeB을 사용한다. HdeA는 조건 흐트러 보호자입니다 <sup&gt; 4,5 : 중성 pH에서 HdeA가 접혀, 보호자 - 비활성 이합체로 존재한다. pH가 3 이하의 pH 변화에 따라, HdeA의 보호자 기능은 신속 6,7 활성화됩니다. HdeA의 활성화는 단량체 6-8의 전개 깊은 구조 단량체로는 해리를 포함하여 변경 및 부분이 필요합니다. 활성화되면, HdeA은 산성 조건 하에서 전개 단백질에 결합한다. 그것은 효과적으로 낮은 pH에서 배양하는 동안뿐만 아니라 pH를 중화에 모두 자신의 응집을 방지 할 수 있습니다. pH가 7.0 반환에, HdeA는 ATP 독립적 인 방식으로 자사의 클라이언트 단백질의 접힘을 용이하게하고 이량 체, 샤페론 비활성 형태 9로 다시 변환합니다. 마찬가지로, 동성 보호자 HdeB은 샤페론 비활성화되어 pH가 7.0에서. HdeA 달리, HdeB의 보호자 활동, pH가 4.0에서 HdeB 여전히 크게 접힌 10 이량되고있는 조건을 겉보기 최대에 도달한다. 또한, 상기 pH를 저하 CAUSHdeB의 비활성화 말이지. 이러한 결과는 광범위한 유사성에도 불구하고 HdeA HdeB은 그들의 보호 샤페론 기능 넓은 pH 범위를 커버 할 수 있도록 기능을 활성화 모드들이 다르다는 것을 제시한다. E.의 내산성에 관여 한 또 다른 보호자 대장균은 중립 상태가 복원 될 때까지 펼쳐진 클라이언트 단백질을 안정화 나타나는 세포질 Hsp31이다. Hsp31의 작용의 정확한 모드는, 그러나, 12 수수께끼 남아있다. 살모넬라와 같은 다른 장내 유해 세균이 hdeAB 오페론이 부족한 점을 감안, 다른 아직 미확인 주변 세포질 보호자가이 박테리아 (11)의 내산성에 관여하는 것을있을 수 있습니다 가능성이 높다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 열 관내 및 HdeB에서의 pH 의존성 샤페론 활성을 모니터링 할 수 있도록 다른 샤페론을 조사하기 위해 적용 할 수있다Hsp31 등. 대안 적으로, hdeAB의 발현을 조절하는 전사 인자의 복잡한 네트워크는 잠재적으로 생체 내 응력 분석에 의해 조사 할 수있다. 생체 내에서 단백질의 샤페론 기능을 특성화하기 위해 상이한 실험 설정을 적용 할 수있다. 하나의 경로는 단백질 전개 응력 조건을 적용 표현형 중 관심의 유전자를 과발현 또는 유전자의 삭제를 수행하는 변이주를 특징 화하는 것이다. 프로테오믹스 연구가 보호자가 존재하면 응력 조건 집합을 더 이상 어떤 단백질들을 식별하기 위해 수행 될 수도 있고, 특정 효소의 샤페론의 영향 효소 분석법 14-16을 사용하여 응력 조건에서 측정 할 수있다. 이 연구에서 우리는 모든 주요 E.의 발현을 제어 RpoH 열 충격 시그마 인자 (32)이 부족 rpoH 삭제 변형에 HdeB를 과발현하기로 결정했습니다 콜라이 샤페론 및 삭제는 SENS 증가하는 것으로 알려져단백질 (15)을 전개 발생할 환경 스트레스 조건 itivity. HdeB의 생체 샤페론 활성은 Δ rpoH 균주의 pH 민감성을 억제하는 능력을 모니터하여 측정 하였다. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 시험 관내에서뿐만 아니라 생체 내 환경에서 산 활성화 샤페론 활성을 특성화하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

박테리아 흔히 pH의 변화, 온도, 산화 환원 상태, 노광 또는 기계적 힘 등의 환경 변화에 노출된다. 이러한 조건 중 많은 셀 전개 단백질 원인 유기체의 생존에 불리한 영향을 미친다. 무관 스트레스 특정 분자 샤페론의 그룹이 스트레스 조건의 생존에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 완전히 접혀 및 보호자 - 비활성 스트레스 전에,이 단백질은 빠르게 전개 및 특정 스트레스 조건에서 chaperone 단백질을 활성화하는 동안. 일단 이들 조건 무질서 샤페론 다른 응집 경향 많은 단백질에 결합 활성, 그 응집을 방지하고, 직접 또는 간접적으로 비 응력 조건에 따라 반환 폴딩 단백질을 용이하게한다. 자신의 활성화 및 클라이언트 인식의 메커니즘에 대한 자세한 이해를 얻기위한 기본 접근 방식은 정화 및 subsequen을 포함시험관 샤페론 분석에서 사용하는 이들 단백질의 t 특성화. 생체 스트레스 분석에 후속 독립적으로 시험 관내 결과에서 얻어진 확인할 절대적으로 필수적이다. 이 프로토콜은 E.의 샤프론 활성을 특성화하기 위해 시험 관내 및 생체 내 방법에 대해 설명 콜라이 HdeB, 산 - 활성화 된 샤페론. 광산란 측정은 시험 관내에서, 설정된 모델 클라이언트 단백질 MDH의 산 - 유도 된 응집을 방지하기 HdeB 용량 편리한 판독을 사용 하였다. 분석 초 원심 분리 실험은 아닌 스트레스 조건에 자신의 복귀에 따라 클라이언트 단백질의 운명에 빛을 창고에, HdeB 및 클라이언트 단백질 LDH 사이의 복합체 형성을 나타 내기 위해 적용되었다. 클라이언트 단백질의 효소 활성 분석법을 pH 유도 클라이언트 비활성화 및 활성화에 HdeB의 효과를 모니터링하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 생존 연구 과정 제어하는 ​​데 사용 된생체 내에서 HdeB의 보호자 기능의 영향을 r에.

HdeA 및 HdeB는 E. 상동 있습니다 산 스트레스 조건 (10)에 대해 주변 세포질 단백질을 보호하는 것으로 알려져 대장균 단백질. 우리의 작업은 산 분자 보호자 활성화로 HdeA 유사은 HdeB 또한 기능 것으로 나타났습니다. 그러나, 여전히 잠재적 살균하지만 HdeA 6,9,10,22의 pH 최적보다 상당히 더 높은 pH에서 HdeA, HdeB 기능 대조적이다. 체외 HdeB의 샤페론 활성의 최적 pH를 조사 네이티브 MDH는 HdeB의 유무에 표시된 pH를 예열 된 (43 ℃로) 완충액으로 희석 하였다. 인큐베이션 360 초 후, 배양 반응물을 중화시켰다. 이 중화은 43 ° C를 9에서 MDH의 집계를 트리거합니다. 대표적인 결과 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 때문에 MDH의 응집 중화시 급격히 증가 시킨다는 것을 보여준다 (도 1, BL각 pH에서 ACK 라인). HdeB의 존재하에 광 산란 신호는 크게 HdeB는 MDH (도 1, 4의 pH와 산도 5)의 응집을 방지 함을 나타내는 pH가 4 또는 5의 pH로 중화시에 감소된다. 대조적으로, 그러나, pH가 2 pH를 3 내지 중화시 MDH 빠르게 HdeB의 샤페론 활성을위한 최적 pH가 있음을 나타내는 HdeB (도 1, pH가 2하여 pH 3)의 유무에 관계없이 동일한 정도로 집계 HdeB 저장 버퍼 (4)의 pH 내지 5의 pH 4에서 HdeB의 존재 MDH의 감소 된 광 산란 신호는 샤페론 기능에 기인 것을 나타내는 MDH 응집 (도 1, 버퍼 제어)에 아무런 영향을 미치지 않았다. HdeA는 pH가 2-3에서의 단량체 및 펼친 형태의 활성 샤페론하지만, 또는 pH를 4 ~ 10 위의 어떠한 활동을 보여줍니다하지 않습니다. 이러한 결과는 HdeB는 pH를 4 (10)의 주위에 최적의 보호자 활성을 갖는 것이 좋습니다. <img al<html> t = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 :. 산성 pH에서 HdeB의 보호자 활동 0.5 μM MDH는 43 ° C에서 부재 또는 360 초 동안 12.5 μM HdeB의 존재에 표시된 pH에서 미리 예열 버퍼 D에서 배양 하였다. 샘플의 pH는 다음 0.16-0.34 볼륨이 M 버퍼링 K 첨가 2 HPO 4 그래피 (별표로 표시됨) pH 7로 상승시키고, MDH 응집은 350 nm에서 모니터링 광산란에 의해 추가로 440 초 동안 측정했다 중성 pH (파란색 배경). 그림은 원래 생물 화학 저널에 발표 된 달 등. (10) .This 조사에서 수정됩니다. 달 JU, Koldewey P, 연어 L, 호로비츠 S, Bardwell JC, 박테리아에 산 보호 보호자와 같은 야콥 미국 HdeB 기능을 제공합니다. J BIOL 화학. 2015, 290 (1) : 65-75. 도이 : 10.1074 / jbc.M114.612986. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회.S / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 다른 클라이언트 단백질과 같은 형태 HdeB 안정한 착물, 3 μM의 LDH 열적 다른 pH 조건에서 존재 또는 30 μM의 HdeB의 부재하에 41 ℃에서 전개되었는지 해결한다. 분석 초 원심 분리에 의해 이들 샘플 침강 동작 분석은 22 ℃에서 수행 하였다. LDH 및 HdeB는 pH가 7, 41 ° C에서 함께 배양 하였을 때, LDH 단독 사량 (120 kDa의 분자량) 남아 HdeB은 다이머 남았다. 이러한 결과는 단백질의 pH 7에서 안정적인 복합체를 형성하지 않는 것으로 나타났다 및 LDH는 41 ° C (그림 2, 녹색 선)에서 20 분 배양시 올리고머의 모든 돌이킬 수없는 변화를 받아야하지 않습니다. 마찬가지로, HdeB을 나타내는 41 ° C와 pH가 4.0에서 배양시 이량 남아 그 낮은 pH 배양HdeB도 열 충격 조건 (그림 2, 레드 라인)에서의 올리고머 상태에 영향을주지 않습니다으로. LDH 제 검사 (우측 상단 모서리에 기재된도 2)에 기록되기 전에 LDH의 40 %가 침강한다는 사실에 의해 나타낸 바와 같이 급속하게 응집 HdeB의 부재 하에서 pH를 4 및 41 ° C에서 배양 할 때. 나머지 LDH는 단량체 (그림 2, 파란색 선)으로 주로 침전 나타났다. 대조적으로, pH가 4 및 41 ° C에서 LDH와 HdeB 항온 134 kDa의 분자량을 가진 새로운 종을 형성하는 두 단백질 공동 침전 (HdeB-LDH의 C)의 큰 비율을 일으켰다. 이 종은 가능성이 HdeB의 이량 체 및 열 전개 LDH 사이의 복잡한을 나타냅니다. 또한 HdeB의 존재하에 종래 침강에 유의 LDH 응집 우리 관내 응집 측정과 일관성있는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 HdeB에서 샤페론 활성을 나타낸다는 것을 보여준다pH가 4.0에서 이량 체 형태. 이것은 그 단량체 형태로 활성 샤페론된다 HdeA, 완전히 대조적이다. 이 pH를 4, pH가 7 사이의 구조적 재 배열을받을 수 있습니다 HdeB의 매우 동적 인 특성은 HdeB의 보호자 기능 (10)의 활성화 가능성이 충분하다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig2.jpg" /> 그림 2 :. 분석 초 원심 분리하여 pH를 4에서 HdeB와 펼친 LDH 사이의 복합체 형성의 검출 3 μM의 LDH는 버퍼 D 15 분 (150 mM의 KHPO 4, 150 mM의 염화나트륨)의 10 몰 과량 HdeB의 존재하에 배양 하였다 pH가 7 (녹색 선) 중 하나에서 41 °의 C 또는 pH를 4 (검은 선)에서. 비교를 위해, LDH 형 (청색 선) 또는 단독 HdeB (적색 라인) LDH 4. 분석 초 원심 침강 속도 HdeB의 화학량 론을 결정하는 데 사용 된 pH에서 41 ° C에서 15 분 동안 항온 처리하고, 그 복합체는 HdeB 사이에 형성 및 DIF에서 LDHferent pH 조건. (오른쪽 상단 모서리에 명시된 바와 같이)의 pH 4에서와 HdeB의 부재에서 배양 할 때 첫 번째 스캔 이전에 집계 그 ~ 40 % LDH을합니다. 침강 계수 분포도를 나타낸 것이다 (C (S)) 프로그램을 사용하여 분석 SEDFIT. 편지는 각각 LDH 또는 HdeB의 각각의 올리고머 상태를 나타냅니다 HdeB D, HdeB 이량 체를; LDH의 M, LDH 단량체 LDH T, LDH 량체; HdeB-LDH C, HdeB-LDH 복합체. 그림 달 등. (10)에서 수정됩니다. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 달 JU, Koldewey P, 연어 L, 호로비츠 S, Bardwell JC, 박테리아에 산 보호 보호자와 같은 야콥 미국 HdeB 기능을 제공합니다. J BIOL 화학. 2015, 290 (1) : 65-75. 도이 : 10.1074 / jbc.M114.612986. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig2large.jpg" target="_blank">버전 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 시온. HdeB 중화시 클라이언트 단백질의 접힘을 지원하는지 여부를 테스트하려면, pH의 변성 MDH의 폴딩에 HdeB의 영향을 분석 하였다. 열 변성 된 MDH가 HdeB 유무 상이한 pH 값에서 배양 하였다. 낮은 pH 항온 처리 한 후, pH는 (어느 것이 MDH의 폴딩을 시작)으로 중화시키고, MDH 활성은 2 시간 후에 결정되었다. 도 3에 도시 된 바와 같이, MDH의 상당한 활성화가 HdeB의 존재 하에서 pH를 4로 중화에 달성되었다. HdeB는 낮은 pH 배양 결석 때 어떤 MDH 활성은 결정되지 않았다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig3.jpg" /> 도 3 : HdeB 산의 폴딩이 효소 활성 상태 MDH 변성 용이 1 μM의 MDH는 부재 또는 P 37 ° C에서 1 시간 동안 지시 된 pH에서 버퍼 D 배양 하였다.25 μM HdeB의 resence. 샘플을 0.5 M 나트륨이 첨가 HPO 4로 pH 7로 중화되기 전에 그 다음, 온도를 10 분 동안 20 ° C까지 이동 하였다. 분취 량은 20 ° C에서 배양 2 시간 후 촬영 및 MDH 활동에 대해 분석 하였다. 부재 (흰색 막대) 또는 HdeB의 존재 (검은 색 막대)에서 중화시 MDH 활동이 표시됩니다. 적어도 3 개의 독립적 인 측정 유래의 표준 편차를 나타낸다. 그림 달 등. (10)에서 수정됩니다. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 달 JU, Koldewey P, 연어 L, 호로비츠 S, Bardwell JC, 박테리아에 산 보호 보호자와 같은 야콥 미국 HdeB 기능을 제공합니다. J BIOL 화학. 2015, 290 (1) : 65-75. 도이 : 10.1074 / jbc.M114.612986. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig3large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림. 우리의 시험 관내 데이터는 HdeB는 pH를 4에서 다른 모델 클라이언트 단백질을 결합 자신의 응집을 방지하고 한 번 중성 pH 조건이 복원됩니다 폴딩 클라이언트를 용이 것으로 나타났습니다. 생체 내에서 HdeB의 영향을 조사하기 위해, pH에 의존하는 생존 분석은 온도에 민감한 rpoH 삭제 균주를 사용하여 수행 하였다. 이 균주는 대부분의 보호자가 부족하기 때문에 상승 된 온도, 낮은 pH 또는 산화 스트레스 (15)에 더 민감하다. 중성 pH 조건 하에서 HdeB 과발현은 빈 벡터 pBAD18 (도 4 미처리)을 품고 대조 균주에 비교적 잘 성장 균주의 성장 속도에 영향을 보이지 않았다. 대조적으로, 우리는 자신의 능력에 명확한 차이를 발견 낮은 pH의 누에서 재현성 향상 복구를 보여주는 HdeB 과발현 변형으로 pH 3 pH를 4 치료시 성장을 재개제어 균주보다 tment. 우리의 생체 데이터와 대조적으로, 그러나 HdeB의 존재도 pH에서 이량 향해 HdeB의 올리고머 화 상태라도 이동할 수 이것은 셀 HdeB의 높은 농도에 기인 할 수있는 pH를 3으로 상당히 보호 효과를 가지고 세포가 어디 pH를 4 9,10,22에서 배양 할 때 유의 살인은 관찰되지 않았다 동안 pH를 2 또는 pH 3으로 세포를 이동하는 것은 매우 빠르고 매우 독성으로 이어진 3. 참고. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54527/54527fig4.jpg" /> 그림 4 : HdeB는 E.를 보호 산성 pH에 대해 대장균. HdeB (적색 원)을 30 ° C에서 0.5 % 아라비 노스의 존재하에 BB7224 (Δ rpoH)에서 과발현시켰다. 빈 벡터 pBAD18을 품고 BB7224 세포 제어 (검은 색 원)을 사용 하였다. 왼쪽 패널은 모두 일의 성장을 보여줍니다30 ° C에서 비는 pH가 7 세포는 2.5 분의 pH 3 (왼쪽 패널) 또는 30 분에서에서 5 M 염산을 추가하여 표시 pH로 이동하고, pH를 2 (오른쪽 패널)에서 1 분 동안 배양 하였다 pH를 4 (오른쪽 패널을 낮출). 이어서, 배양 물을 5 M NaOH를 적절한 양을 첨가하여 중화시키고, 성장은 30 ℃에서 액상 매체를 모니터링 하였다. 그림 달 등. (10)에서 수정됩니다. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. 달 JU, Koldewey P, 연어 L, 호로비츠 S, Bardwell JC, 박테리아에 산 보호 보호자와 같은 야콥 미국 HdeB 기능을 제공합니다. J BIOL 화학. 2015, 290 (1) : 65-75. 도이 : 10.1074 / jbc.M114.612986. 저작권 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54527/54527fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K 조회수.  University of Michigan.  이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다. 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

의 pH에 ​​의존 활동의 검출

의 pH에 의존 활동의 검출