모세관 내시경 검사는 미세혈관 구조를 직접적이고 저렴하며 비침습적으로 시각화할 수 있는 접근 가능한 도구입니다. 이 프로토콜의 목표는 연구자들이 모세관 내시경을 사용하여 생쥐의 손톱층에서 말초 미세혈관 형태를 시각화할 수 있도록 하는 것입니다.

손발톱 모세관 내시경법(NFC)을 사용하여 인간 피부의 미세모세혈관 네트워크를 이미징하는 것은 중요한 전신 질환에서 표적 장기 시스템으로서 미세순환의 중요성을 강조했습니다. 손톱 모세관 내시경 검사는 류마티스, 심장, 안구(예: 녹내장) 및 내분비 장애(예: 고혈압 및 진성 당뇨병)를 포함한 다양한 전신 상태에서 말초 미세혈관 기능 장애 및 이상을 감지하기 위해 임상적으로 적용됩니다. NFC는 말초 전신 미세혈관 파괴를 감지하는 것뿐만 아니라 약물 효능을 평가하는 데에도 유용합니다. 그러나 임상 NFC 결과를 동물 질병 모델로 변환하는 것은 어려울 수 있습니다. 동물에서 미세혈관 기능 장애 또는 이상을 감지하는 것은 종종 침습적(예: 내시경)이거나, 생체 외 (예: 조직의 사후 이미징)로 수행되거나, 비용이 많이 들기 때문에 마이크로컴퓨터 단층 촬영 및 광음향 이미징 기술에 사용되는 것과 같은 특수 장비가 필요합니다. 질병의 동물 모델에서 말초 미세혈관 구조를 이미지화하기 위한 빠르고 비침습적이며 저렴한 기술을 개발하면 연구 비용을 절감하고 임상에 대한 번역 가능성을 높일 수 있습니다.

모세관 내시경 검사는 이전에 기니피그와 생쥐를 포함한 동물 모델에서 손톱 주름 미세 혈관 구조를 시각화하는 데 사용되어 동물 모델에서 비침습적 이미징 도구로서 모세관 검사의 기능을 입증했습니다. 이 연구는 못이 박힌 쥐에 모세혈관 내시경을 적용하는 프로토콜을 제공하여 연구자들이 미세 혈관 구조의 형태를 쉽고 저렴하게 평가할 수 있도록 합니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 실험실 균주인 SV129/S6 및 C57/B6J를 사용하는 야생형 마우스의 전형적인 못박힌 미세혈관 구조의 대표 이미지가 제공됩니다. 이 방법을 사용하는 추가 연구는 말초 미세혈관 이상이 있는 광범위한 마우스 질병 모델에 못박이 모세혈관 내시경을 적용하는 데 필수적입니다.

손발톱 모세혈관 내시경법(NFC)을 사용하여 인간의 말초 미세모세혈관 네트워크를 이미징하는 것은 광범위한 전신 질환에서 표적 장기 시스템으로서 미세순환의 중요성을 강조했습니다¹. 모세관 내시경 검사는 현미경을 사용하여 생체 내에서 손톱 주름의 혈관을 확대하고 시각화하는 것을 포함합니다. 이와 같이, 류마티스 ^2,3, 심장⁴, 안구(예: 녹내장)^5,6 및 내분비 질환(예: 고혈압 및 당뇨병 ^7,8)을 포함한 다양한 전신 질환에서 말초 미세혈관 기능 장애 및 이상을 감지하기 위해 임상에서 널리 사용되는 기술입니다). 출혈, 혈관 비틀림 증가, 무혈관 부위를 포함한 손발톱 모세혈관의 형태학적 변화는 NFC를 사용하여 쉽게 감지할 수 있습니다. 이러한 형태학적 이상은 과도하거나 결핍된 미세혈관 리모델링과 같은 병리학적 과정을 나타냅니다 ^9,10. NFC는 이러한 병리를 감지하는 데 유용한 진단 도구입니다. 또한, 이 기법은 약물 효능 평가에 유용하다¹¹.

그러나 임상 NFC 결과를 질병의 동물 모델로 변환하는 것은 여러 가지 이유로 어렵습니다. 동물의 미세혈관 구조를 시각화하는 것은 일반적으로 침습적(예: 내시경), 생체 외(예: 조직의 사후 이미징)하거나 비용이 많이 들기 때문에 마이크로컴퓨터 단층 촬영(microcomputed tomography) ^12,13, 일관성 단층 촬영 혈관 조영술^(coherence tomography angiography) 14 및 광음향 이미징 기법^{(photoacoustic imaging techniques)15}과 같은 특수 장비가 필요합니다. 말초 미세혈관 병리학은 심근경색¹⁶, 고혈압¹⁷, 알츠하이머병¹⁸과 같은 중추신경계의 노화 관련 신경퇴행, 녹내장¹⁹과 같은 시신경병증을 포함한 광범위한 전신 및 중추신경계 질환에서 명백하기 때문에 비침습적이고 비용 효율적인 생체 내 시각화 기법이 매우 유용합니다.

모세관 내시경 검사는 기니피그²⁰ 및 생쥐²¹을 포함한 동물 모델에서 손톱 주름 미세 혈관 구조를 평가하는 데 사용되어 비침습적 이미징 도구로서의 기능을 입증했습니다. 여기에서는 모세관 내시경 검사를 손톱의 다른 부분인 손톱에 적용합니다. 쥐 손톱의 투명도를 활용하여 못박기 모세혈관 내시경은 말초 미세혈관 구조를 시각화할 수 있는 새로운 위치를 소개합니다. 혈구 움직임을 모니터링하는데 특히 유용한 NFC와 비교하여,^21,22, 여기에 기술된 못박힌 모세혈관 내시경 프로토콜은 미세혈관 형태 및 구조를 더 잘 관찰할 수 있는 더 넓은 영역을 제공한다. 당사는 연구자들이 비침습적 말초 혈관 이미징을 위한 새로운 위치인 쥐 못박힌 미세혈관 구조의 형태를 쉽고 저렴하게 평가할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 두 가지 실험실 균주(SV129/S6 및 C57/B6J)를 사용하여 야생형 마우스에서 전형적인 못박힌 미세혈관 구조의 대표적인 이미지를 제공합니다. 우리는 손톱 모세관 내시경이 저렴하고 비침습적인 미세혈관 이미징 방식임을 보여줍니다. 이 탐색적 방법을 사용하는 추가 연구는 병리학에서 말초 미세혈관 이상이 명백한 질병의 광범위한 마우스 모델에 못박기 모세혈관 내시경을 적용하는 데 필수적입니다.

여기에 설명된 모든 방법은 밴더빌트 대학 의료 센터와 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 이미징을 위한 마우스 손톱 준비

참고: 최적의 혈관 투명도와 피부 회복을 위해 이미징 최소 24시간을 허용하십시오.

1. 쥐 손톱 바닥의 방해받지 않는 이미징을 가능하게 하려면 모세관 내시경 이미징 최소 24시간 전에 설치류 발에서 털을 제거하십시오(그림 1A). 마우스 발에서 털을 제거하려면 1.1.1-1.1.6 단계를 따르십시오.
   1. 흡입 이소플루란 마취제(5% 이산화탄소/95% 산소에 2% 이소플루란)를 사용하여 동물을 진정시킵니다. 마우스가 양쪽 뒷발에 있는 발 패드를 꼬집어 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 적절하게 마취되면 경련 동작(페달 철수 반사)이 없어야 합니다. 반사 운동이 있는 경우 마우스가 이소플루란에서 더 많은 시간을 완전히 마취되도록 합니다. 페달 철수 반사를 다시 테스트하고 계속하십시오.
   2. 마우스가 적절하게 마취된 후 윤활제 안젤 또는 멸균 비약용 안과 연고를 양쪽 눈에 바르면 마취 상태에서 각막이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다.
   3. 콧방울을 사용하여 동물을 마취 상태로 유지하고 애플리케이터를 사용하여 발 전체에 충분한 양의 제모 크림을 바르십시오. 그림 1B와 같이 발과 못이 박힌 부분 전체를 덮도록 주의하십시오.
   4. 제모 크림을 발에 묻혀 실온(RT)에서 2분간 둡니다.
   5. 제모 크림을 깨끗한 티슈로 부드럽게 문질러 조심스럽게 닦아냅니다.
   6. 미지근하고 살균된 물로 발을 씻으십시오.
      알림: 그림 1C와 같이 발에는 이미징을 위해 방해받지 않는 털과 손톱이 없어야 합니다.
   7. 마취로부터 안전하게 회복할 수 있도록 마우스를 케이지로 되돌립니다. 마우스가 의식을 되찾을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 쥐가 의식을 되찾으면 다른 동물들과 함께 원래 우리로 되돌립니다.

2. 생체 내 못을 박은 모세혈관 이미징

1. 털 제거 후 최소 24시간의 회복 시간이 지나면 그림 2A와 같이 온도 조절실(21.5-22.5°C 유지)에 모세관 내시경 장비를 설정합니다. 못박힌 이미징을 위한 전체 설정에는 1) 이소플루란 마취 장비, 2) 마취 노즈 콘, 3) 조정 가능한 동물 스테이지, 4) 모세관 현미경 및 5) 이미징용 비디오 소프트웨어가 있는 노트북이 포함됩니다.
2. 흡입 이소플루란 마취제(5% 이산화탄소/95% 산소에 2% 이소플루란)를 사용하여 동물을 진정시킵니다.
   1. 마우스가 양쪽 뒷발에 있는 발 패드를 꼬집어 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 적절하게 마취되면 경련 동작(페달 철수 반사)이 없어야 합니다. 반사 움직임이 있는 경우 1.1.1단계로 돌아가서 마우스가 완전히 마취될 때까지 더 많은 시간을 기다립니다. 그런 다음 페달 철수 반사를 다시 테스트하고 계속하십시오.
   2. 마우스가 적절하게 마취된 후 윤활제 안젤 또는 멸균 비약용 안과 연고를 양쪽 눈에 바르면 마취 중 각막이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다.
3. 동물을 진정제 상태로 유지하면서 그림 2B, 확대/축소와 같이 뒷발 볼라 쪽을 대물렌즈 아래의 실험실 테이프 플랫폼 위에 놓습니다.
4. 애플리케이터를 사용하여 현미경 대물렌즈 아래의 손톱을 분리하기 위해 발가락을 부드럽게 벌립니다. 최적의 혈관 이미징을 위해 발톱 베드가 서로 분리되어 있는지 확인하십시오.
   참고: 그림 2C 는 노트북 비디오 소프트웨어의 선박 사진을 보여주는 전체 이미징 설정을 보여줍니다.
5. 눈부심을 줄이고 집중력을 향상시키려면 이머젼 오일(옥수수 오일)을 발에 넉넉하게 바르고 손톱을 완벽하게 덮을 수 있습니다. 마우스 발 아래에 흰색 테이프 또는 이와 유사한 것을 추가하여 대비를 높이고 혈관 바닥의 시각화를 개선합니다(그림 3, 화살표 3).
6. 뒷발의 두 번째 손가락에 있는 못에 초점을 맞춥니다. 생쥐의 경우 가장 큰 손톱이며 이미지화하기 가장 쉽습니다. 마우스 손톱의 초점을 맞추려면 x 및 y 스테이지 조절기(그림 3, 화살표 4)와 확대 휠(이 기기에서 최대 280배; 그림 3; 화살표 1).
7. 대물렌즈를 돌려 눈부심의 위치를 줄여 손톱 혈관 네트워크를 시야에 가져옵니다(그림 3, 화살표 2).
   참고: 혈관이 잘 보이지 않거나 이미징 시간이 길어지면 이멀젼 오일을 넉넉하게 다시 도포하십시오. 생쥐의 폰트 발은 뒷발보다 작습니다. 따라서 뒷발로 이미징을 수행하는 것이 좋습니다.
8. USB(Universal Serial Bus) 연결을 통해 모세관시경을 랩톱 컴퓨터에 연결합니다.
9. 노트북에서 Debut 비디오 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다.
   참고: 설정에서 장치가 랩톱에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.
10. 노트북 화면에서 모세관 스코프로 확대되는 것을 시각화하고 x 및 y 스테이지 조절기와 확대 휠을 조정하여 못에 초점을 맞추어 선명한 이미지를 얻습니다.
11. 현미경에 초점을 맞추고 못을 박은 혈관 네트워크의 선명한 이미지가 보이면 Debut 또는 유사한 비디오 소프트웨어 프로그램의 빨간색 녹화 버튼을 눌러 비디오를 녹화합니다(그림 2C).
12. 각 비디오를 적절한 프로젝트 폴더에 저장하고 그에 따라 각 비디오에 레이블을 지정합니다.

3. 못 박힌 이미지 저장

1. 소프트웨어에서 못이 박힌 비디오를 열고 비디오에서 선박에 초점이 잘 맞춰진 프레임을 수동으로 선택합니다.
2. 컴퓨터의 스크린샷 도구를 사용하여 손톱의 선명한 혈관 구조를 보여주는 데뷔 비디오 화면의 스크린샷을 찍습니다. 이미지를 저장합니다.
3. 파일 및 열기를 클릭하여 ImageJ 소프트웨어에서 스크린샷 이미지를 엽니다. 대상 폴더에서 파일을 선택합니다.
4. 필요한 경우 이미지(Image) > 밝기/대비 조정(Adjust > Brightness/Contrast)을 선택하여 밝기와 대비를 조정합니다. 이 도구는 이미지의 대비를 변경하여 혈관 형태를 더 잘 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
5. 이미지가 조정되면 밝기/대비 도구에서 설정을 클릭합니다.
6. File(파일)을 클릭한 다음 Save as(다른 이름으로 저장)를 클릭하여 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.

여기에 설명된 모세혈관 내시경 방법을 사용하면 그림 4A와 같이 못박힌 혈관 형태를 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 쥐의 전형적인 못박힌 혈관 구조는 그림 4B에서 강조된 바와 같이 세 가지 일관된 특징을 나타냅니다: 각 못은 1) 구심성 혈관, 2) 원심성 혈관, 3) 구심성 혈관과 원심성 혈관을 모두 연결하는 모세혈관 네트워크를 가지고 있습니다. 못박힌 형태의 일관성을 입증하기 위해 그림 4C 에서는 SV129/S6 배경의 야생형 마우스의 대표적인 못박힌 모세관 네트워크를 보여주고, 그림 4D 에서는 C57/B6J 배경의 야생형 마우스를 보여줍니다.

그림 1: 모세혈관 내시경 이미징을 위한 손발톱 준비. (A) 손톱을 가리는 털을 보여주는 화살표가 있는 마우스 발의 예. (B) 제모 크림 도포 - 마우스 뒷발에 넉넉하게 바르고 발 전체를 덮도록 주의합니다. (C) 제모 후 마우스 발의 예; 참고 - 손톱은 더 이상 털로 가려지지 않으며 24시간 내에 이미징할 준비가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 모세관 내시경 설정. (A) 못박기 이미징을 위한 완전한 설정을 보여주는 모세관 투시경 장비 사진: (1) 이소플루란 마취 장비, (2) 마취 노즈 콘, (3) 조정 가능한 동물 스테이지, (4) 모세관 현미경 및 (5) 이미징용 비디오 소프트웨어가 있는 노트북. (B) 절차를 위한 마우스 배치의 예; 마우스는 노즈 콘에 의해 진정 상태를 유지하고 뒷발은 대물렌즈 아래의 이미징을 위해 볼이 위로 향하게 놓습니다(확대/축소 참조). (C) 노트북 비디오 소프트웨어에 선박 사진을 보여주는 완전한 이미징 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 모세관경 조정 및 제안 사항. 이미지 품질을 개선하기 위해 조정 가능한 옵션을 보여주기 위해 모세관 투시경 장비의 사진. (1) 손잡이를 사용하여 z 위치를 조정하여 대물렌즈를 마우스 손톱 쪽으로 가져오고, (2) 대물렌즈를 비틀어 손톱에 닿는 빛의 눈부심 정도를 조정하고, (3) 더 나은 혈관 네트워크 보기를 위해 대비를 최대화하기 위해 흰색 또는 유색 실험실 테이프를 적용하고, (4) 동물 위치를 위해 모세관 현미경 x 및 y 스테이지 조정을 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마우스의 전형적인 못박힌 혈관 형태. (A) 모세혈관검사로 획득한 쥐 못박힌 이미지의 예 및 (B) 일반적인 못박힌 형태는 1) 구심성 혈관, 2) 원심성 혈관, 3) 요소 1과 2 사이에 존재하는 모세관 네트워크의 세 가지 요소로 구성됩니다. 손톱 형태는 (C) SV129/S6 및 (D) C57/B6J 배경의 마우스를 포함한 야생형 마우스 균주 간에 일관되게 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

요약하면, 우리는 연구자들이 비침습적 말초 혈관 이미징을 위한 새로운 위치인 쥐 못박힌 미세혈관 구조의 형태를 쉽고 저렴하게 평가할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 기니피그⁽²⁰) 및 마우스(²¹)에 사용된 NFC 방법과 마찬가지로, 여기에 설명된 프로토콜의 주요 강점은 질병의 마우스 모델에서 말초 미세혈관 구조의 빠르고 비침습적인 평가를 가능하게 한다는 것입니다. 이는 류마티스 질환 ^2,3 및 고혈압 및 당뇨병 ^7,8을 포함한 내분비 질환과 같은 말초 혈관 이상과 관련된 연구에 특히 유용할 수 있습니다.

쥐 손톱의 투명도를 활용하여 못박기 모세혈관 내시경은 말초 미세혈관 구조를 시각화할 수 있는 새로운 위치를 소개합니다. 혈구 움직임을 모니터링하는데 특히 유용한 NFC와 비교하여,^21,22, 여기에 기술된 못박힌 모세혈관 내시경 프로토콜은 미세혈관 형태 및 구조를 더 잘 관찰할 수 있는 더 넓은 영역을 제공한다.

최적의 이미징을 보장하려면 이미징을 위해 손톱을 준비하는 단계에 주의를 기울이는 것이 좋습니다. 효과적인 제모는 성공적인 못 박힌 이미징에 필수적입니다. 머리카락이 손톱을 가리면 이미징 실패로 이어질 수 있습니다. 또한 이미징 최소 24시간 전에 제모를 완료하는 것이 좋습니다. 이것은 제모 절차로 인한 자극을 해결할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 이 방법을 사용할 때 발생할 수 있는 변동성을 제한하려면 뒷발의 두 번째 손가락이 더 크기 때문에 이미징에 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 또한 동물 간의 일관성을 유지합니다. 또한, 이멀젼 오일을 넉넉하게 사용하면 작은 못이 박힌 모세관 네트워크의 해상도를 향상시키는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, 이미징 전에 손톱 아래에 적절한 색상의 실험실 테이프를 바르면 혈관 시각화를 위한 대비가 향상됩니다.

총 못이 박힌 혈관 형태를 해결하는 데 이 기술의 효능에도 불구하고 여기에 설명된 바와 같이 이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이미징 인터페이스의 특성과 혈관의 크기로 인해 이 프로토콜을 사용하여 혈류 또는 혈구 속도를 해결할 수 없습니다. 혈관 이미지 캡처를 최적화하는 추가 작업을 통해 향후 자동화된 이미지 분석 접근 방식이 가능해질 수 있으며, 이는 주변 미세혈관 특징을 추가로 특성화하는 데 유용할 것입니다. 둘째, 설명된 프로토콜은 못이 박힌 이미지를 캡처하기 위해 마우스의 마취를 요구합니다. 마취는 장기간(65분 후)에 걸쳐 미세혈관 형태를 변화시킵니다²³. 이 방법을 사용하면 마취 시간이 상당히 짧아지지만, 연구원들은 일관성을 보장하고 수집된 데이터의 변동성을 줄이기 위해 마우스에서 마우스로 절차를 완료하는 데 걸리는 시간을 염두에 두어야 합니다.

말초 혈관 영상은 종종 침습적이고 비용이 많이 듭니다^12,13; 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 이러한 한계를 극복하여 말초 혈관 형태를 빠르고 저렴하며 쉽게 시각화할 수 있도록 도와줍니다. 결론적으로, 이 프로토콜에 설명된 탐색적 방법은 말초 혈관 질환 모델에서 못 박힌 마우스의 형태학적 이상을 특성화하는 것을 목표로 하는 향후 연구에서 구현될 수 있습니다.

이 업무와 무관하게, 파스콸레 박사는 트웬티 트웬티(Twenty Twenty)의 유급 컨설턴트였다. 이 작업과 무관하게, 클라라 커즌스(Clara Cousins)는 Cartography Biosciences의 유급 컨설턴트입니다. 다른 저자는 공개할 내용이 없습니다.

이 작업은 Lauren K. Wareham에게 수여된 무제한 부서 기금으로 자금을 지원받았습니다. Pasquale 박사는 녹내장 재단(NYC)과 실명 예방 연구(NYC)의 무제한 챌린지 보조금의 지원을 받고 있습니다.