تنظير الشعيرات الدموية هو أداة يمكن الوصول إليها للتصور المباشر وغير المكلف وغير الجراحي للأوعية الدموية الدقيقة. الهدف من هذا البروتوكول هو تمكين الباحثين من استخدام تنظير الشعيرات الدموية لتصور مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية في أظافر الفئران.

أكد تصوير شبكات الشعيرات الدموية الدقيقة للجلد لدى البشر باستخدام تنظير الشعيرات الدموية (NFC) على أهمية دوران الأوعية الدقيقة كنظام عضو مستهدف في الأمراض الجهازية الحرجة. يتم تطبيق تنظير الشعيرات الدموية سريريا للكشف عن الخلل الوظيفي والتشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة الطرفية في مجموعة من الحالات الجهازية ، بما في ذلك اضطرابات الروماتيزم والقلب والعينية (مثل الجلوكوما) والغدد الصماء (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم وداء السكري). NFC مفيد ليس فقط في الكشف عن اضطراب الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية المحيطية ولكن أيضا في تقييم فعالية الدواء. ومع ذلك ، فإن ترجمة نتائج NFC السريرية إلى نماذج الأمراض الحيوانية قد يكون أمرا صعبا. غالبا ما يكون الكشف عن الخلل الوظيفي أو التشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة في غازيا (على سبيل المثال ، بالمنظار) ، أو يتم إجراؤه خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، التصوير بعد الوفاة للأنسجة) ، أو مكلف ، ويتطلب معدات متخصصة مثل تلك المستخدمة في التصوير المقطعي الدقيق وتقنيات التصوير الضوئي الصوتي. هناك ما يبرر تطوير تقنيات سريعة وغير جراحية وغير مكلفة لتصوير الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية في النماذج الحيوانية للأمراض لتقليل نفقات البحث وزيادة قابلية الترجمة إلى العيادة.

تم استخدام تنظير الشعيرات الدموية سابقا لتصور الأوعية الدموية الدقيقة في النماذج الحيوانية ، بما في ذلك خنازير غينيا والفئران ، مما يدل على قدرة تنظير الشعيرات الدموية كأداة تصوير غير جراحية في النماذج الحيوانية. توفر هذه الدراسة بروتوكولا يطبق تنظير الشعيرات الدموية على فأر مسمر ، مما يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة بسهولة وبتكلفة زهيدة. يتم توفير صور تمثيلية لبنية الأوعية الدموية الدقيقة النموذجية في الفئران البرية باستخدام سلالتين معمليتين شائعتين الاستخدام ، SV129 / S6 و C57 / B6J. تعد الدراسات الإضافية باستخدام هذه الطريقة ضرورية لتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على مجموعة واسعة من نماذج أمراض الفئران مع تشوهات الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية.

سلط تصوير شبكات الشعيرات الدموية الدقيقة المحيطية في البشر باستخدام تنظير الشعيرات الدموية العصبية (NFC) الضوء على أهمية دوران الأوعية الدقيقة كنظام عضو مستهدف في مجموعة واسعة من الأمراض الجهازية¹. يتضمن التنظير الشعري استخدام مجهر لتكبير وتصور الأوعية في طية الظفر في الجسم الحي. على هذا النحو ، فهي تقنية تستخدم على نطاق واسع في العيادة للكشف عن الخلل الوظيفي والتشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة الطرفية في مجموعة من الحالات الجهازية ، بما في ذلك الروماتيزم^2،3 ، والقلب⁴ ، والعينية (على سبيل المثال ، الجلوكوما) ^5،6 ، وأمراض الغدد الصماء (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم والسكري^7،8). يتم اكتشاف التغيرات المورفولوجية في الشعيرات الدموية في أظافر ، بما في ذلك النزيف ، وزيادة التواء الأوعية الدموية ، والمناطق اللاوعائية ، بسهولة باستخدام NFC. تمثل هذه التشوهات المورفولوجية عمليات مرضية مثل إعادة تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة المفرطة أو الناقصة^9،10. NFC هي أداة تشخيصية مفيدة للكشف عن هذه الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، هذه التقنية مفيدة في تقييم فعالية الدواء¹¹.

ومع ذلك ، فإن ترجمة نتائج NFC السريرية إلى نماذج حيوانية للمرض يمثل تحديا لأسباب عديدة. عادة ما يكون تصور الأوعية الدموية الدقيقة في غازيا (على سبيل المثال ، بالمنظار) ، ويتم إجراؤه خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، تصوير الأنسجة بعد الوفاة) ، أو مكلف ، ويتطلب معدات متخصصة مثل التصوير المقطعي المحوسب^12،13 ، وتصوير الأوعية الدموية بالتصوير المقطعي المتماسك¹⁴ ، وتقنيات التصوير الضوئي^{الصوتي 15}. نظرا لأن أمراض الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية واضحة في مجموعة واسعة من أمراض الجهاز العصبي الجهازي والمركزي ، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب¹⁶ ، وارتفاع ضغط^{الدم 17} ، والانحطاط العصبي المرتبط بالعمر في الجهاز العصبي المركزي مثل مرض الزهايمر¹⁸ ، والاعتلالات العصبية البصرية مثل الجلوكوما¹⁹ ، فإن تقنية التصور غير الغازية والفعالة من حيث التكلفة في الجسم الحي مفيدة للغاية.

تم استخدام تنظير الشعيرات الدموية لتقييم الأوعية الدموية الدقيقة في النماذج الحيوانية ، بما في ذلك خنازير غينيا²⁰ والفئران²¹ ، مما يدل على قدرته كأداة تصوير غير جراحية. هنا ، نقوم بتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على جزء مختلف من الظفر ، المسمار. من خلال تسخير شفافية مسمار الفأر ، يقدم تنظير الشعيرات الدموية المسامير موقعا جديدا لتصور الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية. بالمقارنة مع NFC ، وهو مفيد بشكل خاص لمراقبة حركة خلايا الدم^21،22 ، يوفر بروتوكول تنظير الشعيرات الدموية المصغر الموصوف هنا مساحة أكبر لمراقبة أفضل لمورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة وهيكلها. نحن نقدم بروتوكولا يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة ذات المسمار بالفئران بسهولة وبتكلفة زهيدة ، وهو موقع جديد لتصوير الأوعية الدموية المحيطية غير الغازية. يوفر هذا البروتوكول صورا تمثيلية لبنية الأوعية الدموية الدقيقة النموذجية في الفئران البرية باستخدام سلالتين معمليتين شائعتين الاستخدام (SV129 / S6 و C57 / B6J). نظهر أن تنظير الشعيرات الدموية المسمورة هو طريقة تصوير الأوعية الدموية الدقيقة غير المكلفة وغير الغازية. ستكون الدراسات الإضافية باستخدام هذه الطريقة الاستكشافية ضرورية لتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على مجموعة واسعة من نماذج الفئران للأمراض حيث تكون تشوهات الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية واضحة في علم الأمراض.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في المركز الطبي بجامعة فاندربيلت ومستشفى ماساتشوستس العام.

1. تحضير أظافر الفئران للتصوير

ملاحظة: للحصول على صفاء مثالي للأوعية واستعادة الجلد ، اتركيه لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير.

1. لتمكين التصوير دون عائق لأظافر الفئران ، قم بإزالة الفراء من أقدام القوارض قبل 24 ساعة على الأقل من تصوير تنظير الشعيرات الدموية (الشكل 1 أ). لإزالة الفراء من أقدام الفأر ، اتبع الخطوات 1.1.1-1.1.6.
   1. تخدير باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين). تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية ، اترك الفأر مزيدا من الوقت تحت الأيزوفلوران ليصبح مخدرا بالكامل. أعد اختبار منعكس سحب الدواسة واستمر.
   2. بعد تخدير الفأر بشكل صحيح ، ضع جل العين المزلق أو مرهم العين المعقم غير الطبي على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
   3. الحفاظ على تحت التخدير باستخدام مخروط الأنف ، ضع كمية وفيرة من كريم إزالة الشعر على المخلب بالكامل باستخدام قضيب. احرص على تغطية المخلب بالكامل ومناطق التثبيت ، كما هو موضح في الشكل 1 ب.
   4. اتركي كريم إزالة الشعر على المخلب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
   5. نظف كريم إزالة الشعر بعناية عن طريق فركه برفق بمنديل نظيف.
   6. اغسل المخلب بالماء الفاتر والمعقم.
      ملاحظة: يجب أن تكون الكفوف خالية من الفراء والأظافر دون عائق للتصوير ، كما هو موضح في الشكل 1 ج.
   7. أعد الفأر إلى قفصه لضمان الشفاء الآمن من التخدير. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه. بمجرد أن يستعيد الفأر وعيه ، أعده إلى القفص الأصلي بصحبة أخرى.

2. في الجسم الحي تصوير تنظير الشعيرات الدموية

1. بعد ما لا يقل عن 24 ساعة من وقت التعافي بعد إزالة الفراء ، قم بإعداد معدات تنظير الشعيرات الدموية في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (يتم الاحتفاظ بها بين 21.5-22.5 درجة مئوية) ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. يتضمن الإعداد الكامل للتصوير المسامير 1) معدات تخدير الأيزوفلوران ، 2) مخروط أنف التخدير ، 3) مرحلة حيوانية قابلة للتعديل ، 4) مجهر تنظير الشعيرات الدموية ، و 5) جهاز كمبيوتر محمول مزود ببرنامج فيديو للتصوير.
2. تخدير باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين).
   1. تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية ، فارجع إلى الخطوة 1.1.1 واترك الماوس مزيدا من الوقت للتخدير الكامل. ثم أعد اختبار منعكس سحب الدواسة واستمر.
   2. بعد تخدير الفأر بشكل صحيح ، ضع جل العين المزلق أو مرهم العين المعقم غير الطبي على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
3. للحفاظ على تحت التخدير ، ضع جانب الأخمص الخلفي لأعلى أعلى منصة شريط المختبر أسفل الهدف ، كما هو موضح في الشكل 2 ب ، التكبير.
4. انشر أصابع القدم برفق لفصل الأظافر تحت هدف المجهر باستخدام قضيب. تأكد من فصل أسطح المسامير عن بعضها البعض للحصول على تصوير الأمثل للأوعية.
   ملاحظة: يوضح الشكل 2C إعداد التصوير الكامل الذي يعرض صورة السفينة على برنامج فيديو الكمبيوتر المحمول.
5. لتقليل الوهج وتحسين التركيز ، ضع زيت الغمر (زيت الذرة) بسخاء على المخلب ، مما يضمن تغطية كاملة للأظافر. أضف شريطا أبيض أو ما شابه ذلك أسفل مخلب الماوس لتحسين التباين وتحسين تصور قاع الوعاء (الشكل 3 ؛ السهم 3).
6. ركز على الظفر الموجود على الرقم الثاني من المخلب الخلفي. في الفئران ، هذا هو أكبر مسمار وأسهل في التصوير. لتركيز مسمار الماوس ، استخدم أدوات ضبط المرحلة x و y (الشكل 3 ؛ السهم 4) وعجلة التكبير (حتى 280x على هذه الأداة ؛ الشكل 3 ؛ السهم 1).
7. قم بتحويل الهدف لتقليل وضع الوهج لعرض شبكة أوعية الأظافر (الشكل 3 ؛ السهم 2).
   ملاحظة: إذا أصبح من الصعب رؤية الأوعية أو تم تمديد وقت التصوير ، فأعد وضع زيت الغمر بسخاء. الكفوف الخطية للفئران أصغر من الكفوف الخلفية. وبالتالي ، يوصى بإجراء التصوير على الكفوف الخلفية.
8. قم بتوصيل منظار الشعيرات الدموية بجهاز كمبيوتر محمول عبر اتصال ناقل تسلسلي عالمي (USB).
9. افتح تطبيق برنامج الفيديو الأول على الكمبيوتر المحمول.
   ملاحظة: تحقق من توصيل الجهاز بشكل صحيح بالكمبيوتر المحمول في الإعدادات.
10. على شاشة الكمبيوتر المحمول ، تصور ما يتم تكبيره بواسطة منظار الشعيرات الدموية وركز على المسمار عن طريق ضبط أدوات ضبط المراحل x و y وعجلة التكبير للحصول على صورة واضحة.
11. بمجرد تركيز المجهر ورؤية صورة واضحة لشبكة الأوعية الدموية في الغطاء المسمير ، قم بتسجيل مقطع فيديو بالضغط على زر التسجيل الأحمر في Debut أو برنامج فيديو مشابه (الشكل 2C).
12. احفظ كل مقطع فيديو في مجلد المشروع المناسب وقم بتسمية كل مقطع فيديو وفقا لذلك.

3. حفظ الصور المسمرة

1. افتح الفيديو المسامير في البرنامج واختر يدويا إطارا في الفيديو حيث تكون الأوعية في تركيز واضح.
2. باستخدام أداة لقطة الشاشة على الكمبيوتر ، التقط لقطة شاشة لشاشة الفيديو الأولى التي تظهر الأوعية الدموية الواضحة في الظفر. حفظ الصورة.
3. افتح صورة لقطة الشاشة في برنامج ImageJ بالنقر فوق ملف وفتح ؛ حدد الملف من المجلد الوجهة الخاص به.
4. إذا لزم الأمر، اضبط السطوع والتباين عن طريق تحديد > Image > Adjust Brightness/Contrast. يمكن أن تساعد هذه الأداة في تغيير تباين الصور لتصور مورفولوجيا الوعاء بشكل أفضل.
5. بمجرد ضبط الصورة، انقر فوق Set في أداة Brightness/Contrast .
6. احفظ الصورة كملف TIFF بالنقر فوق ملف ثم حفظ باسم.

باستخدام طريقة تنظير الشعيرات الدموية الموضحة هنا ، يمكن تصوير مورفولوجيا الأوعية الدموية المسامير بسهولة ، كما هو موضح في الشكل 4 أ. تظهر الأوعية الدموية النموذجية المسامير في الفأر ثلاث ميزات متسقة ، كما هو موضح في الشكل 4 ب: كل مسمار يحتوي على 1) وعاء وارد ، 2) وعاء صادر ، و 3) شبكة من الشعيرات الدموية التي تربط كل من الأوعية الواردة والصادرة. لإثبات اتساق مورفولوجيا مسمر ، نعرض في الشكل 4C شبكة شعرية تمثيلية مسمرة في فأر من النوع البري على خلفية SV129 / S6 وفي الشكل 4D فأر من النوع البري على خلفية C57 / B6J.

الشكل 1: تحضير الأظافر لتصوير تنظير الشعيرات الدموية. (أ) مثال على مخلب الفأر مع سهام توضح الأظافر التي تحجب الفراء. (ب) تطبيق كريم إزالة الشعر - ضعيه بسخاء على مخلب الفأر الخلفي ، مع الحرص على تغطية المخلب بالكامل. (ج) مثال مخلب الفأر بعد إزالة الشعر ؛ ملاحظة - لم يعد الفراء يعيق الأظافر وتكون جاهزة للتصوير في غضون 24 ساعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد تنظير الشعيرات الدموية. (أ) صورة لمعدات تنظير الشعيرات الدموية توضح الإعداد الكامل للتصوير بالأظافر: (1) معدات تخدير الأيزوفلوران ، (2) مخروط الأنف للتخدير ، (3) مرحلة القابلة للتعديل ، (4) مجهر تنظير الشعيرات الدموية ، و (5) كمبيوتر محمول مزود ببرنامج فيديو للتصوير. (ب) مثال على وضع الماوس للإجراء؛ يتم الاحتفاظ بالفأر تحت التخدير بواسطة مخروط الأنف ، ويتم وضع القدم الخلفية جنبا إلى جنب لأعلى للتصوير تحت الهدف (انظر التكبير). (ج) إعداد تصوير كامل يظهر صورة السفينة على برنامج فيديو الكمبيوتر المحمول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تعديل واقتراحات المنظار الشعري. صورة لمعدات تنظير الشعيرات الدموية لتوضيح الخيارات القابلة للتعديل لتحسين جودة الصورة. (1) استخدم المقبض لضبط الموضع z لجلب الهدف نحو مسمار الماوس ، (2) قم بلف الهدف لضبط مقدار الوهج من الضوء على الأظافر ، (3) قم بتطبيق شريط مختبر أبيض أو ملون لزيادة التباين لتحسين عرض شبكة السفينة ، (4) استخدم مجهر تنظير الشعيرات الدموية x و Y لضبط وضع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مورفولوجيا الأوعية الدموية النموذجية في الفئران. (أ) مثال على صورة مسمار الفئران المكتسبة عن طريق تنظير الشعيرات الدموية و (ب) يتكون التشكل النموذجي المسمار من ثلاثة عناصر: 1) وعاء وارد ، 2) وعاء صادر ، و 3) شبكة شعرية موجودة بين العنصرين 1 و 2. يظل مورفولوجيا المسمار متسقا بين سلالات الفئران البرية ، بما في ذلك الفئران الموجودة على خلفية (C) SV129 / S6 و (D) C57 / B6J. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

باختصار ، نقدم بروتوكولا يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة ذات المسمار بالفئران بسهولة وبتكلفة زهيدة ، وهو موقع جديد لتصوير الأوعية الدموية المحيطية غير الغازية. مثل طرق NFC المستخدمة في خنازير غينيا²⁰ والفئران²¹ ، فإن القوة الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا هي أنه يسمح بإجراء تقييم سريع وغير جراحي للأوعية الدموية الدقيقة المحيطية في نماذج الفئران للمرض. قد يكون هذا مفيدا بشكل خاص للدراسات التي تنطوي على تشوهات الأوعية الدموية الطرفية ، مثل الأمراض الروماتيزمية^2،3 وأمراض الغدد الصماء بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري^7،8.

من خلال تسخير شفافية مسمار الفأر ، يقدم تنظير الشعيرات الدموية المسامير موقعا جديدا لتصور الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية. بالمقارنة مع NFC ، وهو مفيد بشكل خاص لمراقبة حركة خلايا الدم^21،22 ، يوفر بروتوكول تنظير الشعيرات الدموية المصغر الموصوف هنا مساحة أكبر لمراقبة أفضل لمورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة وهيكلها.

لضمان التصوير الأمثل ، نوصي بالاهتمام بالخطوات التي تحضر الظفر للتصوير. إزالة الشعر الفعالة أمر ضروري لتصوير الأظافر الناجح. سيؤدي حجب الشعر إلى فشل التصوير. نوصي أيضا بإكمال إزالة الشعر قبل 24 ساعة على الأقل من التصوير. هذا للسماح بحل أي تهيج من إجراء إزالة الشعر. للحد من التباين الذي قد يحدث في استخدام هذه الطريقة ، نوصي باستخدام الرقم الثاني من المخلب الخلفي للتصوير نظرا لحجمه الأكبر. هذا أيضا يحافظ على الاتساق بين. علاوة على ذلك ، يساعد التطبيق السخي لزيت الغمر على تحسين دقة الشبكات الشعرية الصغيرة ذات المسمار. أخيرا ، يؤدي تطبيق شريط المختبر الملون بشكل مناسب أسفل الظفر قبل التصوير أيضا إلى تحسين التباين لتصور الأوعية.

على الرغم من فعالية هذه التقنية في حل مورفولوجيا الأوعية الدموية الإجمالية ، إلا أن هناك بعض القيود على هذه التقنية كما هو موضح هنا. نظرا لطبيعة واجهة التصوير وحجم الأوعية الدموية ، لا يمكن حل تدفق الدم أو سرعة خلايا الدم باستخدام هذا البروتوكول. قد يؤدي العمل الإضافي لتحسين التقاط صور السفينة إلى تمكين نهج تحليل الصور الآلي في المستقبل ، والتي ستكون ذات قيمة في زيادة توصيف ميزات الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية. ثانيا ، يتطلب البروتوكول الموصوف تخدير الفئران لالتقاط صور مسمرة. يغير التخدير مورفولوجيا الأوعية الدقيقة على مدى فترات طويلة من الزمن (بعد 65 دقيقة)²³. على الرغم من أن الوقت تحت التخدير أقصر بكثير باستخدام هذه الطريقة ، يجب على الباحثين أن يضعوا في اعتبارهم الوقت المستغرق لإكمال الإجراء من الماوس إلى الفأر لضمان الاتساق وتقليل التباين في البيانات التي تم جمعها.

غالبا ما يكون تصوير الأوعية الطرفية غازيا ومكلفا^12،13. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموصوف هنا يساعد في التغلب على هذه القيود للسماح بتصور مورفولوجيا الأوعية الطرفية بسرعة وبتكلفة زهيدة وسهولة. في الختام ، يمكن تنفيذ الطريقة الاستكشافية الموصوفة في هذا البروتوكول في الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى توصيف التشوهات المورفولوجية في الفأر المسمر في نماذج أمراض الأوعية الدموية الطرفية.

لا علاقة له بهذا العمل ، كان الدكتور باسكوال مستشارا مدفوع الأجر ل Twenty Twenty. لا علاقة لها بهذا العمل ، كلارا كوزينز هي مستشارة مدفوعة الأجر لشركة Cartography Biosciences. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال الإدارات غير المقيدة الممنوحة إلى Lauren K. Wareham. يتم دعم الدكتور باسكوال من قبل مؤسسة الجلوكوما (NYC) وبمنحة تحدي غير مقيدة من Research to Prevention Blindness (NYC).