毛細血管鏡検査は、微小血管系を直接、安価に、非侵襲的に視覚化するためのアクセス可能なツールです。このプロトコルの目標は、研究者がマウスの爪床の末梢微小血管形態を視覚化するために毛細血管鏡検査を使用できるようにすることです。

ネイルフォールド毛細血管鏡検査(NFC)を使用してヒトの皮膚の微小毛細血管網をイメージングすると、重篤な全身性疾患における標的臓器系としての微小循環の重要性が強調されています。ネイルフォールド毛細血管鏡検査は、リウマチ、心臓、眼(緑内障など)、内分泌障害(高血圧や糖尿病など)など、さまざまな全身状態における末梢微小血管機能障害および異常を検出するために臨床的に適用されます。NFCは、末梢の全身性微小血管系の混乱を検出するだけでなく、薬効の評価にも有用です。しかし、NFCの臨床所見を動物の疾患モデルに変換することは困難な場合があります。動物の微小血管機能障害や異常の検出は、多くの場合、侵襲的(内視鏡的など)であり、 ex vivo (組織の死後イメージングなど)または高価で、マイクロコンピューター断層撮影や光音響イメージング技術で使用されるような特殊な機器が必要です。疾患の動物モデルにおける末梢微小血管系を画像化するための迅速で非侵襲的、かつ安価な技術を開発することは、研究費を削減し、臨床への翻訳可能性を高めるために必要です。

毛細血管鏡検査は、モルモットやマウスなどの動物モデルで爪の踵微小血管系を視覚化するために以前に使用されており、動物モデルにおける非侵襲的なイメージングツールとしての毛細血管鏡検査の能力を実証しています。この研究では、マウスの爪床に毛細血管鏡検査を適用するプロトコルを提供し、研究者がその微小血管系の形態を簡単かつ安価に評価できるようにします。一般的に使用される2つの実験室系統(SV129/S6およびC57/B6J)を使用した野生型マウスの典型的な爪床微小血管構造の代表的な画像を提供します。この方法を用いたさらなる研究は、末梢微小血管異常を有する幅広いマウス疾患モデルに爪床毛細血管鏡検査を適用するために不可欠です。

ネイルフォールド毛細血管鏡検査(NFC)を使用してヒトの末梢微小毛細血管網をイメージングすると、さまざまな全身性疾患における標的臓器系としての微小循環の重要性が浮き彫りになりました¹。毛細血管鏡検査では、顕微鏡を使用して、in vivoで爪の折り目の血管を拡大して視覚化します。そのため、リウマチ^性2,3、心臓⁴、眼(緑内障など)^5,6、内分泌疾患(高血圧や糖尿病^7,8など)など、さまざまな全身状態における末梢微小血管機能障害や異常を検出するために臨床で広く使用されている技術です).爪骨毛細血管の形態学的変化(出血、血管の曲がり角の増加、無血管領域など)は、NFCを使用して容易に検出できます。これらの形態学的異常は、過剰または欠損した微小血管リモデリングなどの病理学的過程を表している^9,10。NFCは、これらの病状を検出するための便利な診断ツールです。さらに、この手法は、薬効の評価にも有用である¹¹。

しかし、NFCの臨床結果を疾患の動物モデルに変換することは、多くの理由で困難です。動物における微小血管系の可視化は、典型的には侵襲的(例えば、内視鏡的)、 ex vivo で実施される(例えば、組織の死後イメージング)、または高価であり、マイクロコンピュータ断層撮影^法12、13、コヒーレンストモグラフィー血管造影¹⁴、および光音響イメージング技術¹⁵のような特殊な機器を必要とする.末梢微小血管の病理は、心筋梗塞¹⁶、高血圧¹⁷、アルツハイマー病¹⁸などの中枢神経系の加齢性神経変性、緑内障¹⁹などの視神経障害など、広範囲の全身および中枢神経系疾患で明らかであるため、非侵襲的で費用対効果の高い in vivo 可視化技術は非常に有益です。

毛細血管鏡検査は、モルモット²⁰やマウス²¹などの動物モデルにおける爪骨微小血管系の評価に使用されており、非侵襲的なイメージングツールとしての能力を実証しています。ここでは、爪の別の部分である爪床に毛細血管鏡検査を適用します。マウスの爪の透明性を利用して、爪床毛細血管鏡検査は、末梢微小血管系の視覚化のための新しい場所を導入します。NFCと比較して、NFCは、血球の動き^21,22をモニタリングするために特に有用であるが、ここで述べる爪床毛細血管鏡検査プロトコルは、微小血管の形態および構造のより良い観察のためのより大きな領域を提供する。私たちは、研究者が非侵襲的な末梢血管イメージングの新しい場所であるマウス爪床微小血管系の形態を簡単かつ安価に評価できるプロトコルを提供します。このプロトコルは、一般的に使用される2つの実験室株(SV129/S6およびC57/B6J)を使用した野生型マウスの典型的な爪床微小血管構造の代表的な画像を提供します。爪床毛細血管鏡検査が安価で非侵襲的な微小血管イメージングモダリティであることを示します。この探索的方法を使用したさらなる研究は、末梢微小血管異常が病理学で明らかな疾患のマウスモデルの範囲に爪床毛細血管鏡検査を適用するために不可欠です。

ここに記載されているすべての方法は、ヴァンダービルト大学医療センターおよびマサチューセッツ総合病院の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. イメージング用マウスネイルの調製

注:最適な血管の透明度と皮膚の回復のために、イメージングの前に少なくとも24時間待ちます。

1. マウスの爪床のイメージングを遮るものなくするには、毛細血管内視鏡イメージングの少なくとも24時間前にげっ歯類の足から毛皮を取り除きます(図1A)。マウスの足から毛皮を取り除くには、手順1.1.1〜1.1.6に従います。
   1. 吸入イソフルラン麻酔(2%イソフルラン中5%二酸化炭素/ 95%酸素)を使用して動物を鎮静させます。.マウスが適切に麻酔されていることを確認するには、両後足のフットパッドをつまみます。適切に麻酔をかければ、けいれん運動(ペダル引きこもり反射)はありません。反射運動がある場合は、マウスがイソフルランの下で完全に麻酔されるまでの時間を待ちます。.ペダル離脱反射を再テストして続行します。
   2. マウスに適切に麻酔をかけた後、麻酔下での角膜の乾燥を防ぐために、潤滑剤のアイジェルまたは滅菌済みの非薬用眼科用軟膏を両眼に塗布します。
   3. ノーズコーンを使用して動物を麻酔下で維持し、アプリケーターを使用して足全体にたっぷりの脱毛クリームを塗ります。 図1Bに示すように、足と爪床の領域全体を覆うように注意してください。
   4. 脱毛クリームを足に室温(RT)で2分間放置します。
   5. 脱毛クリームは、清潔なティッシュでやさしくこすりながら丁寧に洗い落とします。
   6. ぬるま湯の滅菌水で足を洗います。
      注: 図1Cに示すように、足には毛皮がなく、爪がイメージングに遮られないようにする必要があります。
   7. マウスをケージに戻して、麻酔からの安全な回復を確保します。マウスが意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。マウスが意識を取り戻したら、他の動物と一緒に元のケージに戻します。

2. in vivo 爪床毛細血管鏡イメージング

1. 毛皮の除去後最低24時間の回復時間の後、 図2Aに示すように、キャピラロスコープ装置を温度制御された部屋(21.5〜22.5°Cに維持)に設置します。ネイルベッドイメージングの完全なセットアップには、1)イソフルラン麻酔器、2)麻酔鼻コーン、3)調整可能な動物ステージ、4)毛細血管鏡顕微鏡、5)イメージング用のビデオソフトウェアを備えたラップトップが含まれます。
2. 吸入イソフルラン麻酔(2%イソフルラン中5%二酸化炭素/ 95%酸素)を使用して動物を鎮静させます。.
   1. マウスが適切に麻酔されていることを確認するには、両後足のフットパッドをつまみます。適切に麻酔をかければ、けいれん運動(ペダル引きこもり反射)はありません。反射的な動きがある場合は、ステップ1.1.1に戻り、マウスが完全に麻酔される時間を増やします。その後、ペダル離脱反射を再テストして続行します。
   2. マウスに適切に麻酔をかけた後、麻酔中の角膜の乾燥を防ぐために、潤滑剤のアイジェルまたは滅菌済みの非薬用眼科用軟膏を両眼に塗布します。
3. 動物を鎮静剤下に置いたまま、 図2Bに示すように、後足の掌側を上にして、対物レンズの下のラボテーププラットフォームの上に置きます。
4. アプリケーターを使用して、つま先をそっと広げて顕微鏡対物レンズの下で爪を分離します。最適な血管イメージングのために、ネイルベッドが互いに離れていることを確認してください。
   注: 図2C は、ラップトップビデオソフトウェアで船舶の写真を表示する完全なイメージングセットアップを示しています。
5. まぶしさを軽減し、集中力を向上させるには、液浸油(コーン油)を足にたっぷりと塗り、爪を完全にカバーします。マウスの足の下に白いテープなどを追加して、コントラストを高め、血管床の視覚化を改善します(図3;矢印3)。
6. 後足の2番目の指の爪に焦点を合わせます。マウスでは、これが最大の爪であり、画像化が最も簡単です。マウスの爪に焦点を合わせるには、xおよびyステージアジャスター(図3;矢印4)と倍率ホイール(この装置では最大280倍)を使用します。 図 3;矢印1)。
7. 対物レンズを回してグレアの位置を減らし、爪血管ネットワークを view (図3、矢印2)。
   注意: 血管が見づらくなったり、イメージング時間が長くなったりした場合は、浸漬油をたっぷりと再塗布してください。マウスのフォントの足は後足よりも小さいです。したがって、イメージングは後足で行うことをお勧めします。
8. キャピラロスコープをユニバーサルシリアルバス(USB)接続を介してラップトップコンピューターに接続します。
9. ノートパソコンでDebutビデオソフトウェアアプリケーションを開きます。
   注意: 設定でデバイスがラップトップに正しく接続されていることを確認します。
10. ノートパソコンの画面で、キャピラロスコープで拡大されているものを視覚化し、xとyのステージアジャスターと拡大ホイールを調整してネイルベッドに焦点を合わせると、鮮明な画像が得られます。
11. 顕微鏡の焦点が合い、釘床の血管ネットワークの鮮明な画像が表示されたら、Debutまたは同様のビデオソフトウェアプログラムの 赤い録画 ボタンを押してビデオを録画します(図2C)。
12. 各ビデオを適切なプロジェクトフォルダに保存し、それに応じて各ビデオにラベルを付けます。

3.ネイルベッド画像の保存

1. ソフトウェアで釘付けビデオを開き、血管がはっきりと焦点を合わせているビデオ内のフレームを手動で選択します。
2. コンピューターの スクリーンショット ツールを使用して、爪の血管系がはっきりしているデビュービデオ画面のスクリーンショットを撮ります。画像を保存します。
3. ImageJソフトウェアでスクリーンショット画像を開くには、[ ファイル ]と [開く]をクリックします。保存先フォルダからファイルを選択します。
4. 必要に応じて、[ 画像] > [明るさ/コントラストの調整] を選択して、明るさとコントラスト>調整します。このツールは、画像のコントラストを変更して、血管の形態をより視覚化するのに役立ちます。
5. 画像が調整されたら、明るさ/コントラストツールの[設定]をクリックします。
6. [ ファイル ]、[ 名前を付けて保存]の順にクリックして、画像をTIFFファイルとして保存します。

ここで説明する毛細血管鏡検査法を使用すると、 図4Aに示すように、爪床の血管形態を簡単に画像化できます。マウスの典型的な爪床の血管系は、 図4Bで強調されているように、3つの一貫した特徴を示します:各爪床には、1)求心性血管、2)遠心性血管、および3)求心性血管と遠心性血管の両方を接続する毛細血管のネットワークがあります。爪床形態の一貫性を実証するために、 図4C にSV129/S6背景上の野生型マウスの代表的な爪床毛細血管ネットワークを、 図4D にC57/B6J背景上の野生型マウスを示します。

図1:毛細血管鏡イメージングのための爪の準備(A)爪を隠す毛皮を示す矢印が付いたマウスの足の例。(B)脱毛クリームの塗布-マウスの後足にたっぷりと塗り、足全体を覆うように注意します。(C)脱毛後のマウスの足の例;注 - 爪が毛皮に邪魔されることはなくなり、24時間でイメージングの準備が整います。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A) 爪床イメージングの完全なセットアップを示す毛細血管鏡検査装置の写真:(1)イソフルラン麻酔装置、(2)麻酔鼻円錐形、(3)調整可能な動物ステージ、(4)毛細血管鏡顕微鏡、および(5)イメージング用のビデオソフトウェアを備えたラップトップ。(B)手順のためのマウスの配置の例。マウスはノーズコーンで鎮静させ、後足は掌側を上にして対物レンズ下でイメージングします(ズームを参照)。(C)ラップトップビデオソフトウェアに船舶の写真を表示する完全なイメージングセットアップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:毛細血管鏡の調整と提案。 画質を向上させるための調整可能なオプションを示すための毛細血管鏡検査装置の写真。(1)ノブを使用してz位置を調整し、対物レンズをマウスの爪に近づけ、(2)対物レンズをひねって爪の光からのまぶしさの量を調整し、(3)白または色の実験用テープを貼ってコントラストを最大化し、血管ネットワークの表示を改善し、(4)毛細血管鏡顕微鏡のXおよびYステージ調整を使用して動物の位置決めを行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マウスの典型的な爪床血管系の形態 (A)毛細血管鏡検査によって取得されたマウスの爪床画像の例、(B)典型的な爪床の形態は、1)求心性血管、2)遠心性血管、3)要素1と2の間に存在する毛細血管ネットワークの3つの要素で構成されています。爪床の形態は、(C)SV129/S6および(D)C57/B6Jの背景にあるマウスを含む野生型マウス系統間で一貫しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

要約すると、研究者がマウス爪床微小血管系の形態を簡単かつ安価に評価できるプロトコルを提供します。これは、非侵襲的な末梢血管イメージングのための新しい場所です。モルモット²⁰およびマウス²¹で使用されるNFC法と同様に、ここで説明するプロトコルの主な強みは、疾患のマウスモデルにおける末梢微小血管系の迅速かつ非侵襲的な評価を可能にすることである。これは、リウマチ性疾患^2,3や高血圧や糖尿病^7,8などの内分泌疾患などの末梢血管異常を伴う研究に特に有用である可能性があります。

マウスの爪の透明性を利用して、爪床毛細血管鏡検査は、末梢微小血管系の視覚化のための新しい場所を導入します。NFCと比較して、NFCは、血球の動き^21,22をモニタリングするために特に有用であるが、ここで述べる爪床毛細血管鏡検査プロトコルは、微小血管の形態および構造のより良い観察のためのより大きな領域を提供する。

最適なイメージングを確保するために、イメージングのために爪を準備する手順に注意を払うことをお勧めします。効果的な脱毛は、ネイルベッドイメージングを成功させるために不可欠です。髪の毛が爪を覆い隠すと、イメージングの失敗につながります。また、イメージングの少なくとも24時間前に脱毛を完了することをお勧めします。これは、脱毛手順による刺激を解決できるようにするためです。この方法を使用する際に発生する可能性のあるばらつきを制限するために、後足の2番目の数字はサイズが大きいため、イメージングに使用することをお勧めします。これにより、動物間の一貫性も保たれます。さらに、浸漬油をたっぷりと塗布することで、小さな釘床毛細血管ネットワークの解像度を向上させることができます。最後に、イメージングの前に爪の下に適切な色の実験用テープを貼ると、血管の視覚化のコントラストも向上します。

肉眼的釘床血管形態の解決におけるこの技術の有効性にもかかわらず、ここで概説されているように、この技術にはいくつかの制限があります。イメージングインターフェースの性質と血管のサイズにより、このプロトコルを使用して血流または血球速度の分解能を得ることはできません。血管の画像キャプチャを最適化するさらなる研究により、将来的には自動画像解析アプローチが可能になり、末梢微小血管の特徴をさらに特徴付けるのに役立つ可能性があります。第二に、記載されているプロトコルは、爪床画像をキャプチャするためにマウスの麻酔を必要とします。麻酔は、長時間(65分後)にわたって微小血管の形態を変化させます²³。この方法を使用すると、麻酔下での時間はかなり短くなりますが、研究者は、一貫性を確保し、収集されたデータのばらつきを減らすために、マウスからマウスへの手順を完了するのにかかる時間に注意する必要があります。

末梢血管イメージングは、しばしば侵襲的で高価です^12,13;しかし、ここで説明するプロトコルは、これらの制限を克服し、末梢血管の形態を迅速、安価、かつ容易に可視化することを可能にします。結論として、このプロトコルに記載されている探索的方法は、末梢血管疾患のモデルにおけるマウスの爪床の形態学的異常を特徴付けることを目的とした将来の研究で実装される可能性があります。

この仕事とは無関係に、パスクアーレ博士はTwenty Twentyの有給コンサルタントでした。この仕事とは関係ありませんが、Clara Cousins は Cartography Biosciences の有給コンサルタントです。他の著者は何も開示していません。

この作業は、Lauren K. Warehamに授与された無制限の部門資金によって資金提供されました。パスクアーレ博士は、緑内障財団(NYC)と、Research to Prevent Blindness(NYC)からの無制限のチャレンジ助成金によってサポートされています。