Visualización no invasiva de la morfología microvascular del lecho ungueal en ratones mediante capilaroscopia

La capilaroscopia es una herramienta accesible para la visualización directa, económica y no invasiva de la microvasculatura. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores utilizar la capilaroscopia para la visualización de la morfología microvascular periférica en los lechos ungueales de ratones.

La obtención de imágenes de las redes microcapilares de la piel en humanos mediante capilaroscopia del pliegue ungueal (NFC) ha subrayado la importancia de la microcirculación como sistema de órganos diana en las enfermedades sistémicas críticas. La capilaroscopia del pliegue ungueal se aplica clínicamente para detectar disfunción microvascular periférica y anomalías en una variedad de afecciones sistémicas, que incluyen trastornos reumáticos, cardíacos, oculares (p. ej., glaucoma) y endocrinos (p. ej., hipertensión y diabetes mellitus). La NFC es útil no solo para detectar la alteración de la microvasculatura sistémica periférica, sino también para evaluar la eficacia de los fármacos. Sin embargo, trasladar los hallazgos clínicos de la NFC a modelos de enfermedades animales puede ser un reto. La detección de disfunciones o anomalías microvasculares en animales suele ser invasiva (p. ej., endoscópica), realizada ex vivo (p. ej., imágenes post-mortem de tejidos) o costosa, requiriendo equipos especializados como los utilizados en la tomografía microcomputarizada y las técnicas de imágenes fotoacústicas. El desarrollo de técnicas rápidas, no invasivas y baratas para obtener imágenes de la microvasculatura periférica en modelos animales de enfermedad está justificado para disminuir los gastos de investigación y aumentar la traducibilidad a la clínica.

La capilaroscopia se ha utilizado anteriormente para visualizar la microvasculatura del pliegue ungueal en modelos animales, incluidos conejillos de indias y ratones, demostrando así la capacidad de la capilaroscopia como herramienta de imagen no invasiva en modelos animales. Este estudio proporciona un protocolo que aplica la capilaroscopia a un lecho ungueal de ratón, lo que permite a los investigadores evaluar de forma fácil y económica la morfología de su microvasculatura. Se proporcionan imágenes representativas de la arquitectura microvascular típica del lecho ungueal en ratones de tipo salvaje utilizando dos cepas de laboratorio comúnmente utilizadas, SV129/S6 y C57/B6J. Los estudios adicionales que utilizan este método son esenciales para aplicar la capilaroscopia del lecho ungueal a una amplia gama de modelos de enfermedad de ratón con anomalías microvasculares periféricas.

La obtención de imágenes de redes microcapilares periféricas en humanos mediante capilaroscopia ungueal (NFC) ha puesto de manifiesto la importancia de la microcirculación como sistema de órganos diana en una amplia gama de enfermedades sistémicas¹. La capilaroscopia implica el uso de un microscopio para ampliar y visualizar los vasos en el pliegue ungueal in vivo. Como tal, es una técnica ampliamente utilizada en la clínica para detectar disfunción microvascular periférica y anomalías en una variedad de afecciones sistémicas, incluidas las enfermedades reumáticas ^2,3, cardíacas⁴, oculares (p. ej., glaucoma)^5,6 y endocrinas (p. ej., hipertensión y diabetes mellitus ^7,8). Los cambios morfológicos en los capilares del pliegue ungueal, incluidas hemorragias, aumento de la tortuosidad de los vasos y regiones avasculares, se detectan fácilmente mediante NFC. Estas alteraciones morfológicas representan procesos patológicos como el remodelado microvascular excesivo o deficiente ^9,10. La NFC es una herramienta diagnóstica útil para detectar estas patologías. Además, esta técnica es útil en la evaluación de la eficacia de los fármacos¹¹.

Sin embargo, trasladar los hallazgos clínicos de la NFC a modelos animales de enfermedad es un reto por muchas razones. La visualización de la microvasculatura en animales suele ser invasiva (p. ej., endoscópica), realizada ex vivo (p. ej., imágenes post-mortem de tejidos) o costosa, requiriendo equipos especializados como tomografía microcomputarizada^12,13, angiografía por tomografía de coherencia¹⁴ y técnicas de imagen fotoacústica¹⁵. Dado que la patología microvascular periférica es evidente en una amplia gama de enfermedades sistémicas y del sistema nervioso central, como el infarto de miocardio¹⁶, la hipertensión¹⁷, las neurodegeneraciones del sistema nervioso central relacionadas con la edad, como la enfermedad de Alzheimer¹⁸, y las neuropatías ópticas, como el glaucoma¹⁹, una técnica de visualización in vivo no invasiva y rentable es muy beneficiosa.

La capilaroscopia se ha utilizado para evaluar la microvasculatura del pliegue ungueal en modelos animales, incluyendo cobayas²⁰ y ratones²¹, demostrando así su capacidad como herramienta de imagen no invasiva. Aquí, aplicamos la capilaroscopia a una parte diferente de la uña, el lecho ungueal. Aprovechando la transparencia de la uña del ratón, la capilaroscopia del lecho ungueal introduce una nueva localización para la visualización de la microvasculatura periférica. En comparación con la NFC, que es particularmente útil para monitorear el movimiento de las células sanguíneas^21,22, el protocolo de capilaroscopia del lecho ungueal descrito aquí proporciona un área mayor para una mejor observación de la morfología y estructura microvascular. Proporcionamos un protocolo que permite a los investigadores evaluar de forma fácil y económica la morfología de la microvasculatura del lecho ungueal de ratón, que es una ubicación novedosa para la obtención de imágenes vasculares periféricas no invasivas. Este protocolo proporciona imágenes representativas de la arquitectura microvascular típica del lecho ungueal en ratones de tipo salvaje utilizando dos cepas de laboratorio comúnmente utilizadas (SV129/S6 y C57/B6J). Demostramos que la capilaroscopia del lecho ungueal es una modalidad de imagen microvascular barata y no invasiva. Serán esenciales otros estudios que utilicen este método exploratorio para aplicar la capilaroscopia del lecho ungueal a una amplia gama de modelos murinos de enfermedad en los que las anomalías microvasculares periféricas son evidentes en la patología.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt y el Hospital General de Massachusetts.

1. Preparación de las uñas del ratón para la obtención de imágenes

NOTA: Para una claridad óptima de los vasos y la recuperación de la piel, espere al menos 24 horas antes de la toma de imágenes.

1. Para permitir la obtención de imágenes sin obstrucciones de los lechos ungueales de los ratones, retire el pelo de las patas de los roedores al menos 24 horas antes de la obtención de imágenes por capilaroscopia (Figura 1A). Para quitar el pelo de las patas del ratón, siga los pasos 1.1.1-1.1.6.
   1. Sedar al animal con anestesia inhalada con isoflurano (2% de isoflurano en 5% de dióxido de carbono/95% de oxígeno). Confirme que el ratón está adecuadamente anestesiado pellizcando la almohadilla del pie en ambas patas traseras. Si se anestesia adecuadamente, no debe haber movimientos bruscos (reflejo de retirada del pedal). Si hay un movimiento reflejo, permita que el ratón pase más tiempo bajo isoflurano para que se anestesie por completo. Vuelva a probar el reflejo de retirada del pedal y continúe.
   2. Después de que el ratón esté debidamente anestesiado, aplique un gel lubricante para los ojos o un ungüento oftálmico estéril no medicado en ambos ojos para evitar que la córnea se seque mientras está bajo anestesia.
   3. Manteniendo al animal bajo anestesia con un cono nasal, aplique una cantidad generosa de crema depilatoria en toda la pata con un aplicador. Tenga cuidado de cubrir toda el área de la pata y el lecho ungueal, como se muestra en la Figura 1B.
   4. Dejar la crema depilatoria en la pata durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
   5. Limpie cuidadosamente la crema depilatoria frotándola suavemente con un pañuelo limpio.
   6. Lave la pata con agua tibia y estéril.
      NOTA: Las patas deben estar libres de pelo y las uñas sin obstrucciones para la toma de imágenes, como se muestra en la Figura 1C.
   7. Regrese el ratón a su jaula para garantizar una recuperación segura de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia. Una vez que el ratón haya recuperado la conciencia, devuélvelo a la jaula original con la compañía de otros animales.

2. Imágenes de capilaroscopia del lecho ungueal in vivo

1. Después de un tiempo mínimo de recuperación de 24 horas después de la eliminación del pelaje, configure el equipo de capilaroscopia en una sala con temperatura controlada (mantenida entre 21,5 y 22,5 °C), como se muestra en la Figura 2A. La configuración completa para la obtención de imágenes del lecho ungueal incluye 1) un equipo de anestesia con isoflurano, 2) un cono nasal de anestesia, 3) una platina animal ajustable, 4) un microscopio capilaroscopio y 5) una computadora portátil con software de video para la obtención de imágenes.
2. Sedar al animal con anestesia inhalada con isoflurano (2% de isoflurano en 5% de dióxido de carbono/95% de oxígeno).
   1. Confirme que el ratón está adecuadamente anestesiado pellizcando la almohadilla del pie en ambas patas traseras. Si se anestesia adecuadamente, no debe haber movimientos bruscos (reflejo de retirada del pedal). Si hay un movimiento reflejo, regrese al paso 1.1.1 y permita que el mouse tenga más tiempo para estar completamente anestesiado. A continuación, vuelve a probar el reflejo de retirada del pedal y continúa.
   2. Después de que el ratón esté correctamente anestesiado, aplique un gel lubricante para los ojos o un ungüento oftálmico estéril no medicado en ambos ojos para evitar que la córnea se seque durante la anestesia.
3. Manteniendo al animal bajo sedación, coloque la pata trasera con el lado volar hacia arriba en la parte superior de la plataforma de cinta de laboratorio debajo del objetivo, como se muestra en la Figura 2B, zoom.
4. Extienda los dedos de los pies suavemente para separar las uñas bajo el objetivo del microscopio con un aplicador. Asegúrese de que los lechos ungueales estén separados entre sí para obtener imágenes óptimas de los vasos.
   NOTA: La Figura 2C muestra la configuración completa de imágenes que muestra la imagen de la embarcación en el software de video de la computadora portátil.
5. Para reducir el deslumbramiento y mejorar el enfoque, aplique generosamente aceite de inmersión (aceite de maíz) en la pata, asegurando una cobertura completa de las uñas. Agregue cinta blanca o similar debajo de la pata del ratón para mejorar el contraste y mejorar la visualización del lecho del vaso (Figura 3; flecha 3).
6. Concéntrese en la uña en el segundo dedo de la pata trasera; En ratones, esta es la uña más grande y más fácil de visualizar. Para enfocar la uña del ratón, utilice los ajustadores de etapa x e y (Figura 3; flecha 4) y la rueda de aumento (hasta 280x en este instrumento; Figura 3; flecha 1).
7. Gire el objetivo para reducir la posición del deslumbramiento y dejar a la vista la red de recipientes del clavo (Figura 3; flecha 2).
   NOTA: Si los vasos se vuelven difíciles de ver o el tiempo de toma de imágenes se prolonga, vuelva a aplicar generosamente el aceite de inmersión. Las patas de los ratones son más pequeñas que las traseras; Por lo tanto, se recomienda que las imágenes se realicen en las patas traseras.
8. Conecte el capilaroscopio a un ordenador portátil a través de una conexión de bus serie universal (USB).
9. Abra la aplicación de software de video Debut en la computadora portátil.
   NOTA: Verifique que el dispositivo esté conectado correctamente a la computadora portátil en la configuración.
10. En la pantalla de la computadora portátil, visualice lo que se está magnificando con el capilaroscopio y concéntrese en el lecho ungueal ajustando los ajustadores de etapa x e y y la rueda de aumento para obtener una imagen clara.
11. Una vez que el microscopio esté enfocado y se vea una imagen clara de la red de vasos en el lecho ungueal, grabe un video presionando el botón rojo de grabación en Debut o un programa de software de video similar (Figura 2C).
12. Guarde cada video en la carpeta del proyecto correspondiente y etiquete cada video en consecuencia.

3. Guardar imágenes del lecho ungueal

1. Abra el video del lecho de clavos en el software y elija manualmente un fotograma en el video donde las embarcaciones estén claramente enfocadas.
2. Usando la herramienta Captura de pantalla en la computadora, tome una captura de pantalla de la pantalla de video debut que muestra una vasculatura clara en la uña. Guarde la imagen.
3. Abra la imagen de captura de pantalla en el software ImageJ haciendo clic en Archivo y Abrir; Seleccione el archivo de su carpeta de destino.
4. Si es necesario, ajuste el brillo y el contraste seleccionando Imagen > Ajustar > brillo/contraste. Esta herramienta puede ayudar a alterar el contraste de las imágenes para visualizar mejor la morfología de los vasos.
5. Una vez que se haya ajustado la imagen, haga clic en Establecer en la herramienta Brillo/Contraste .
6. Guarde la imagen como un archivo TIFF haciendo clic en Archivo y luego en Guardar como.

Utilizando el método de capilaroscopia descrito aquí, se puede obtener fácilmente una imagen de la morfología vascular del lecho ungueal, como se muestra en la Figura 4A. La vasculatura típica del lecho ungueal en un ratón exhibe tres características consistentes, como se destaca en la Figura 4B: cada lecho ungueal tiene 1) un vaso aferente, 2) un vaso eferente y 3) una red de capilares que conectan los vasos aferentes y eferentes. Para demostrar la consistencia de la morfología del lecho ungueal, mostramos en la Figura 4C una red capilar representativa del lecho ungueal en un ratón de tipo salvaje sobre un fondo SV129/S6 y en la Figura 4D un ratón de tipo salvaje sobre un fondo C57/B6J.

Figura 1: Preparación de las uñas para la obtención de imágenes por capilaroscopia. (A) Ejemplo de pata de ratón con flechas que ilustran el pelaje que oscurece las uñas. (B) Aplicación de crema depilatoria: aplique generosamente sobre la pata trasera del ratón, teniendo cuidado de cubrir toda la pata. (C) Ejemplo pata de ratón después de la depilación; Nota: las uñas ya no están obstruidas por el pelo y están listas para la toma de imágenes en 24 horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración de la capilaroscopia. (A) Fotografía del equipo de capilaroscopia que muestra la configuración completa para la obtención de imágenes del lecho ungueal: (1) equipo de anestesia con isoflurano, (2) cono de nariz de anestesia, (3) platina animal ajustable, (4) microscopio capilaroscopio y (5) computadora portátil con software de video para imágenes. (B) Ejemplo de colocación del ratón para el procedimiento; El ratón se mantiene bajo sedación por el cono de la nariz, y la pata trasera se coloca con el lado volar hacia arriba para obtener imágenes bajo el objetivo (ver zoom). (C) Configuración completa de imágenes que muestra la imagen de la embarcación en el software de video de la computadora portátil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ajuste del capilaroscopio y sugerencias. Fotografía del equipo de capilaroscopia para ilustrar las opciones ajustables para mejorar la calidad de la imagen. (1) Use la perilla para ajustar la posición z para llevar el objetivo hacia la uña del mouse, (2) gire el objetivo para ajustar la cantidad de resplandor de la luz en las uñas, (3) aplique cinta de laboratorio blanca o de color para maximizar el contraste para una mejor visualización de la red de vasos, (4) utilice el ajuste de la etapa x e y del microscopio capilaroscopio para el posicionamiento de los animales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Morfología típica de la vasculatura del lecho ungueal en ratones. (A) Ejemplo de imagen del lecho ungueal de ratón adquirida por capilaroscopia y (B) la morfología típica del lecho ungueal consta de tres elementos: 1) un vaso aferente, 2) un vaso eferente y 3) una red capilar que existe entre los elementos 1 y 2. La morfología del lecho ungueal permanece constante entre las cepas de ratones de tipo salvaje, incluidos los ratones con un fondo (C) SV129/S6 y (D) C57/B6J. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En resumen, proporcionamos un protocolo que permite a los investigadores evaluar de forma fácil y económica la morfología de la microvasculatura del lecho ungueal de ratón, una nueva localización para la obtención de imágenes vasculares periféricas no invasivas. Al igual que los métodos NFC utilizados en cobayas²⁰ y ratones²¹, la principal fortaleza del protocolo descrito aquí es que permite una evaluación rápida y no invasiva de la microvasculatura periférica en modelos murinos de enfermedad. Esto podría ser particularmente útil para estudios que involucran anormalidades vasculares periféricas, como enfermedades reumáticas ^2,3 y enfermedades endocrinas como hipertensión y diabetes mellitus ^7,8.

Aprovechando la transparencia de la uña del ratón, la capilaroscopia del lecho ungueal introduce una nueva localización para la visualización de la microvasculatura periférica. En comparación con la NFC, que es particularmente útil para monitorear el movimiento de las células sanguíneas^21,22, el protocolo de capilaroscopia del lecho ungueal descrito aquí proporciona un área mayor para una mejor observación de la morfología y estructura microvascular.

Para garantizar una imagen óptima, recomendamos prestar atención a los pasos que preparan la uña para la obtención de imágenes. La depilación efectiva es imprescindible para el éxito de las imágenes del lecho ungueal; El cabello que oscurece la uña provocará una falla en la imagen. También recomendamos que la depilación se complete al menos 24 horas antes de la toma de imágenes; Esto es para permitir que se resuelva cualquier irritación del procedimiento de depilación. Para limitar la variabilidad que puede ocurrir en el uso de este método, recomendamos que se use el segundo dedo de la pata trasera para obtener imágenes debido a su mayor tamaño. Esto también mantiene la consistencia entre los animales. Además, la generosa aplicación de aceite de inmersión ayuda a mejorar la resolución de las pequeñas redes capilares de lecho ungueal. Por último, la aplicación de cinta de laboratorio del color adecuado debajo de la uña antes de la obtención de imágenes también mejora el contraste para la visualización de los vasos.

A pesar de la eficacia de la técnica para resolver la morfología macroscópica de los vasos del lecho ungueal, existen algunas limitaciones de la técnica, como se describe aquí. Debido a la naturaleza de la interfaz de imagen y al tamaño de los vasos, la resolución del flujo sanguíneo o la velocidad de las células sanguíneas no es posible con este protocolo. El trabajo adicional en la optimización de la captura de imágenes de vasos puede permitir enfoques automatizados de análisis de imágenes en el futuro, lo que sería valioso para caracterizar aún más las características microvasculares periféricas. En segundo lugar, el protocolo descrito requiere la anestesia de ratones para capturar imágenes del lecho ungueal. La anestesia cambia la morfología de los microvasos durante largos períodos de tiempo (después de 65 min)²³. Aunque el tiempo bajo anestesia es considerablemente más corto con este método, los investigadores deben tener en cuenta el tiempo que se tarda en completar el procedimiento de ratón a ratón para garantizar la coherencia y reducir la variabilidad en los datos recopilados.

La imagen de los vasos periféricos suele ser invasiva y costosa^12,13; Sin embargo, el protocolo descrito aquí ayuda a superar estas limitaciones para permitir la visualización de la morfología de los vasos periféricos de forma rápida, económica y sencilla. En conclusión, el método exploratorio descrito en este protocolo podría ser implementado en futuros estudios que tengan como objetivo caracterizar las anomalías morfológicas en el lecho ungueal del ratón en modelos de enfermedad vascular periférica.

Independientemente de este trabajo, el Dr. Pasquale fue un consultor remunerado de Twenty Twenty. Sin relación con este trabajo, Clara Cousins es consultora remunerada de Cartography Biosciences. Los otros autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue financiado por fondos departamentales sin restricciones otorgados a Lauren K. Wareham. El Dr. Pasquale cuenta con el apoyo de la Fundación del Glaucoma (NYC) y por una subvención de desafío sin restricciones de Research to Prevent Blindness (NYC).