קפילרוסקופיה היא כלי נגיש להדמיה ישירה, זולה ולא פולשנית של מיקרו-כלי דם. מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים להשתמש בקפילרוסקופיה להדמיה של מורפולוגיה מיקרו-וסקולרית היקפית בציפורניים של עכברים.

הדמיית רשתות מיקרו-נימיות של העור בבני אדם באמצעות קפילרוסקופיה של ציפורניים (NFC) הדגישה את החשיבות של מיקרו-סירקולציה כמערכת איברי מטרה במחלות מערכתיות קריטיות. קפילרוסקופיה של ציפורניים מיושמת קלינית לאיתור הפרעות בתפקוד מיקרו-וסקולרי היקפי וחריגות במגוון מצבים מערכתיים, כולל הפרעות ראומטיות, לבביות, עיניים (למשל, גלאוקומה) ואנדוקריניות (למשל, יתר לחץ דם וסוכרת). NFC שימושי לא רק באיתור הפרעה במיקרו-כלי דם מערכתיים היקפיים אלא גם בהערכת יעילות התרופה. עם זאת, תרגום ממצאי NFC קליניים למודלים של מחלות בעלי חיים יכול להיות מאתגר. איתור הפרעות בתפקוד מיקרו-וסקולרי או חריגות בבעלי חיים הוא לרוב פולשני (למשל, אנדוסקופי), מבוצע ex vivo (למשל, הדמיה לאחר המוות של רקמות), או יקר, הדורש ציוד מיוחד כגון אלה המשמשים בטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת והדמיה פוטו-אקוסטית. פיתוח טכניקות מהירות, לא פולשניות וזולות להדמיית מיקרו-כלי דם היקפיים במודלים של מחלות בבעלי חיים מוצדק כדי להפחית את הוצאות המחקר ולהגדיל את יכולת התרגום למרפאה.

קפילרוסקופיה שימשה בעבר להמחשת המיקרו-כלי דם של הציפורניים במודלים של בעלי חיים, כולל בשרקנים ועכברים, ובכך הדגימה את היכולת של קפילרוסקופיה ככלי הדמיה לא פולשני במודלים של בעלי חיים. מחקר זה מספק פרוטוקול המיישם קפילרוסקופיה על מסמר עכבר, ומאפשר לחוקרים להעריך בקלות ובזול את המורפולוגיה של כלי הדם המיקרו-וסקולטוריים שלו. תמונות מייצגות של ארכיטקטורה מיקרו-וסקולרית טיפוסית עם מסמרים בעכברים מסוג בר המשתמשים בשני זני מעבדה נפוצים, SV129/S6 ו-C57/B6J, מסופקות. מחקרים נוספים המשתמשים בשיטה זו חיוניים ליישום קפילרוסקופיה ממוסמרת על מגוון רחב של מודלים של מחלות עכברים עם חריגות מיקרו-וסקולריות היקפיות.

הדמיית רשתות מיקרו-נימים היקפיות בבני אדם באמצעות קפילרוסקופיה של מסמרים (NFC) הדגישה את החשיבות של מיקרו-סירקולציה כמערכת איברי מטרה במגוון רחב של מחלות מערכתיות¹. קפילרוסקופיה כוללת שימוש במיקרוסקופ כדי להגדיל ולדמיין כלי דם בקפל הציפורן in vivo. ככזו, זוהי טכניקה בשימוש נרחב במרפאה לאיתור הפרעות בתפקוד מיקרו-וסקולרי היקפי וחריגות במגוון מצבים מערכתיים, כולל ראומטי ^2,3, לב⁴, עיניים (למשל, גלאוקומה)^5,6, ומחלות אנדוקריניות (למשל, יתר לחץ דם וסוכרת ^7,8). שינויים מורפולוגיים בנימי הציפורן, כולל שטפי דם, פיתול מוגבר של כלי הדם ואזורי כלי הדם, מזוהים בקלות באמצעות NFC. חריגות מורפולוגיות אלו מייצגות תהליכים פתולוגיים כגון שיפוץ מיקרו-וסקולרי מוגזם או חסר ^9,10. NFC הוא כלי אבחון שימושי לאיתור פתולוגיות אלה. בנוסף, טכניקה זו שימושית בהערכת יעילות התרופה¹¹.

עם זאת, תרגום ממצאי NFC קליניים למודלים של מחלות בבעלי חיים הוא מאתגר מסיבות רבות. הדמיה של מיקרו-כלי דם בבעלי חיים היא בדרך כלל פולשנית (למשל, אנדוסקופית), מבוצעת ex vivo (למשל, הדמיה לאחר המוות של רקמות), או יקרה, ודורשת ציוד מיוחד כגון טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת^12,13, אנגיוגרפיה טומוגרפיה קוהרנטית¹⁴ וטכניקות הדמיה פוטו-אקוסטית¹⁵. מכיוון שפתולוגיה מיקרו-וסקולרית היקפית ניכרת במגוון רחב של מחלות מערכתיות ומערכת העצבים המרכזית, כולל אוטם שריר הלב¹⁶, יתר לחץ דם¹⁷, ניוון עצבי הקשור לגיל של מערכת העצבים המרכזית כגון מחלת אלצהיימר¹⁸, ונוירופתיות אופטיות כגון גלאוקומה¹⁹, טכניקת הדמיה לא פולשנית וחסכונית in vivo מועילה מאוד.

קפילרוסקופיה שימשה להערכת המיקרו-כלי דם של הציפורניים במודלים של בעלי חיים, כולל שרקנים²⁰ ועכברים²¹, ובכך הדגימה את יכולתה ככלי הדמיה לא פולשני. כאן, אנו מיישמים קפילרוסקופיה על חלק אחר של הציפורן, הציפורן. תוך רתימת השקיפות של ציפורן העכבר, קפילרוסקופיה ממוסמרת מציגה מיקום חדש להדמיה של מיקרו-כלי דם היקפיים. בהשוואה ל-NFC, שהוא שימושי במיוחד לניטור תנועת תאי דם^21,22, פרוטוקול הקפילרוסקופיה הממוסמר המתואר כאן מספק שטח גדול יותר לתצפית טובה יותר על המורפולוגיה והמבנה של כלי הדם המיקרו-וסקולריים. אנו מספקים פרוטוקול המאפשר לחוקרים להעריך בקלות ובזול את המורפולוגיה של מיקרו-כלי דם ממוסמרים בעכבר, המהווה מיקום חדש להדמיית כלי דם היקפיים לא פולשנית. פרוטוקול זה מספק תמונות מייצגות של ארכיטקטורה מיקרו-וסקולרית טיפוסית עם מסמרים בעכברים מסוג בר באמצעות שני זני מעבדה נפוצים (SV129/S6 ו-C57/B6J). אנו מראים כי קפילרוסקופיה ממוסמרת היא שיטת הדמיה מיקרו-וסקולרית זולה ולא פולשנית. מחקרים נוספים המשתמשים בשיטת גישוש זו יהיו חיוניים ליישום קפילרוסקופיה ממוסמרת על מגוון רחב של מודלים עכבריים של מחלות בהן ניכרות חריגות מיקרו-וסקולריות היקפיות בפתולוגיה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס.

1. הכנת ציפורני עכבר להדמיה

הערה: לבהירות מיטבית של כלי הדם ולהתאוששות העור, יש להמתין לפחות 24 שעות לפני ההדמיה.

1. כדי לאפשר הדמיה ללא הפרעה של ציפורני עכברים, הסירו את הפרווה מכפות המכרסמים לפחות 24 שעות לפני הדמיית קפילרוסקופיה (איור 1A). כדי להסיר פרווה מכפות העכבר, בצע את השלבים 1.1.1-1.1.6.
   1. הרדימו את בעל החיים באמצעות הרדמה איזופלורן בשאיפה (2% איזופלורן ב-5% פחמן דו חמצני / 95% חמצן). ודא שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה של כרית כף הרגל בשתי כפות הרגליים האחוריות. אם מורדמים כראוי, לא אמורה להיות תנועת טלטול (רפלקס נסיגת דוושה). אם יש תנועת רפלקס, אפשר לעכבר יותר זמן תחת איזופלורן להיות מורדם לחלוטין. בדוק שוב את רפלקס נסיגת הדוושה והמשך.
   2. לאחר הרדמה נכונה של העכבר, יש למרוח ג'ל עיניים סיכה או משחת עיניים סטרילית שאינה תרופתית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית בזמן ההרדמה.
   3. שמירה על בעל החיים בהרדמה באמצעות חרוט אף, מרחו כמות נדיבה של קרם להסרת שיער על כל הכפה בעזרת אפליקטור. הקפידו לכסות את כל אזורי הכפות והציפורניים, כפי שמוצג באיור 1B.
   4. יש להשאיר קרם להסרת שיער על הכפה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   5. יש לנקות בזהירות את הקרם להסרת שיער על ידי שפשוף עדין עם ממחטה נקייה.
   6. שטפו את הכפה במים פושרים וסטריליים.
      הערה: הכפות צריכות להיות נקיות מפרווה וציפורניים ללא הפרעה להדמיה, כפי שמוצג באיור 1C.
   7. החזר את העכבר לכלוב שלו כדי להבטיח התאוששות בטוחה מההרדמה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה. לאחר שהעכבר חזר להכרה, החזירו אותו לכלוב המקורי בחברת בעלי חיים אחרים.

2. הדמיית קפילרוסקופיה ממוסמרת in vivo

1. לאחר זמן התאוששות מינימלי של 24 שעות לאחר הסרת הפרווה, הגדר את ציוד הקפילרוסקופיה בחדר מבוקר טמפרטורה (נשמר בין 21.5-22.5 מעלות צלזיוס), כפי שמוצג באיור 2A. המערך השלם להדמיה במסמר כולל 1) ציוד הרדמה איזופלורן, 2) חרוט אף להרדמה, 3) שלב בעל חיים מתכוונן, 4) מיקרוסקופ קפילרוסקופיה ו-5) מחשב נייד עם תוכנת וידאו להדמיה.
2. הרדימו את בעל החיים באמצעות הרדמה איזופלורן בשאיפה (2% איזופלורן ב-5% פחמן דו חמצני / 95% חמצן).
   1. ודא שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה של כרית כף הרגל בשתי כפות הרגליים האחוריות. אם מורדמים כראוי, לא אמורה להיות תנועת טלטול (רפלקס נסיגת דוושה). אם יש תנועת רפלקס, חזור לשלב 1.1.1 ואפשר לעכבר יותר זמן להיות בהרדמה מלאה. לאחר מכן, בדוק שוב את רפלקס נסיגת הדוושה והמשך.
   2. לאחר הרדמה נכונה של העכבר, יש למרוח ג'ל עיניים סיכה או משחת עיניים סטרילית שאינה תרופתית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית בזמן ההרדמה.
3. שמירה על החיה תחת טשטוש, מקם את הצד האחורי של הכף האחורית כלפי מעלה על גבי פלטפורמת סרט המעבדה מתחת למטרה, כפי שמוצג באיור 2B, זום.
4. מורחים את אצבעות הרגליים בעדינות כדי להפריד ציפורניים מתחת למיקרוסקופ באמצעות אפליקטור. ודא שהציפורניים מופרדות זו מזו להדמיה אופטימלית של כלי הדם.
   הערה: איור 2C מציג את מערך ההדמיה המלא המציג את תמונת כלי השיט בתוכנת וידאו למחשב נייד.
5. כדי להפחית סנוור ולשפר את הריכוז, יש למרוח בנדיבות שמן טבילה (שמן תירס) על הכף, כדי להבטיח כיסוי מלא של הציפורניים. הוסף סרט לבן או דומה מתחת לכף העכבר כדי לשפר את הניגודיות ולשפר את ההדמיה של מיטת הכלי (איור 3; חץ 3).
6. התמקדו בציפורן בספרה השנייה של הכפה האחורית; בעכברים, זו המסמרת הגדולה ביותר והכי קלה לצילום. כדי למקד את מסמר העכבר, השתמש במכווני השלב x ו-y (איור 3; חץ 4) ובגלגל ההגדלה (עד פי 280 במכשיר זה; איור 3; חץ 1).
7. סובב את המטרה כדי להפחית את מיקום הסנוור כדי להביא את רשת כלי הציפורן לתצוגה (איור 3; חץ 2).
   הערה: אם קשה לראות כלים או שזמן ההדמיה מתארך, יש למרוח מחדש בנדיבות את שמן הטבילה. כפות גופן של עכברים קטנות יותר מהכפות האחוריות; לפיכך, מומלץ לבצע הדמיה על כפות אחוריות.
8. חבר את הקפילרוסקופ למחשב נייד באמצעות חיבור אפיק טורי אוניברסלי (USB).
9. פתח את יישום תוכנת הווידיאו הראשון במחשב הנייד.
   הערה: ודא שההתקן מחובר כהלכה למחשב הנייד בהגדרות.
10. על מסך המחשב הנייד, דמיין מה מוגדל על ידי הקפילרוסקופ והתמקד במסמר על ידי כוונון מכווני השלב x ו-y וגלגל ההגדלה כדי לקבל תמונה ברורה.
11. ברגע שהמיקרוסקופ ממוקד ורואים תמונה ברורה של רשת כלי הדם במסמר, הקליטו סרטון על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה האדום ב-Debut או בתוכנת וידאו דומה (איור 2C).
12. שמור כל סרטון בתיקיית הפרויקט המתאימה ותייג כל סרטון בהתאם.

3. שמירת תמונות ממוסמרות

1. פתח את הסרטון הממוסמר בתוכנה ובחר ידנית מסגרת בסרטון שבה כלי השיט נמצאים בפוקוס ברור.
2. באמצעות כלי צילום המסך במחשב, צלם צילום מסך של מסך הווידאו הראשון המציג כלי דם ברורים בציפורן. שמור תמונה.
3. פתח את תמונת צילום המסך בתוכנת ImageJ על ידי לחיצה על קובץ ופתח; בחר את הקובץ מתיקיית היעד שלו.
4. במידת הצורך, כוונן את הבהירות והניגודיות על-ידי בחירה באפשרות Image > Adjust > Brightness/Contrast. כלי זה יכול לעזור לשנות את הניגודיות של התמונות כדי לדמיין טוב יותר את המורפולוגיה של כלי הדם.
5. לאחר התאמת התמונה, לחץ על קבע בכלי בהירות/ניגודיות .
6. שמור את התמונה כקובץ TIFF על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על שמור בשם.

באמצעות שיטת הקפילרוסקופיה המתוארת כאן, ניתן לדמות בקלות מורפולוגיה של כלי דם ממוסמרים, כפי שמוצג באיור 4A. כלי דם ממוסמרים טיפוסיים בעכבר מציגים שלושה מאפיינים עקביים, כפי שמודגש באיור 4B: לכל ממוסמר יש 1) כלי אפרנטי, 2) כלי נשפך, ו-3) רשת של נימים המחברים בין כלי הדם הנכנסים והזורמים. כדי להדגים את העקביות של מורפולוגיה ממוסמרת, אנו מראים באיור 4C רשת נימית מייצגת ממוסמרת בעכבר מסוג פרא על רקע SV129/S6 ובאיור 4D עכבר מסוג פרא על רקע C57/B6J.

איור 1: הכנת ציפורניים עבור דימות קפילרוסקופיה. (A) דוגמה לכף עכבר עם חיצים שממחישים פרווה שמסתירה ציפורניים. (B) מריחת קרם להסרת שיער - יש למרוח בנדיבות על כף הרגל האחורית של העכבר, תוך הקפדה על כיסוי כל הכפה. (ג) דוגמה לכף עכבר לאחר הסרת שיער; הערה - הציפורניים כבר אינן חסומות על ידי פרווה והן מוכנות להדמיה תוך 24 שעות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערך קפילרוסקופיה. (A) תצלום של ציוד קפילרוסקופיה המציג מערך שלם להדמיה ממוסמרת: (1) ציוד הרדמה איזופלורן, (2) חרוט אף הרדמה, (3) שלב בעלי חיים מתכוונן, (4) מיקרוסקופ קפילרוסקופיה, ו-(5) מחשב נייד עם תוכנת וידאו להדמיה. (ב) דוגמה למיקום עכבר לפרוצדורה; העכבר מוחזק תחת הרגעה על ידי חרוט האף, וכף הרגל האחורית ממוקמת עם הצד האחורי כלפי מעלה להדמיה תחת אובייקטיבציה (ראה זום). (ג) מערך הדמיה מלא המציג את תמונת כלי השיט בתוכנת וידאו של מחשב נייד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: התאמה והצעות של קפילרוסקופ. צילום של ציוד קפילרוסקופיה להמחשת אפשרויות מתכווננות לשיפור איכות התמונה. (1) השתמש בכפתור כדי לכוונן את מיקום z כדי להביא את המטרה לעבר מסמר העכבר, (2) סובב את המטרה כדי להתאים את כמות הסנוור מהאור על הציפורניים, (3) החל סרט מעבדה לבן או צבעוני כדי למקסם את הניגודיות לרשת כלי דם טובה יותר view, (4) השתמש במיקרוסקופ קפילרוסקופיה x ו-y התאמת שלב למיקום בעלי חיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מורפולוגיה טיפוסית של כלי דם ממוסמרים בעכברים. (A) דוגמה לתמונה ממוסמרת של עכבר שנרכשה על ידי קפילרוסקופיה ו-(B) מורפולוגיה טיפוסית של ממוסמרים מורכבת משלושה אלמנטים: 1) כלי אפרנטי, 2) כלי נשפך ו-3) רשת נימית הקיימת בין אלמנטים 1 ו-2. מורפולוגיה ממוסמרת נותרה עקבית בין זני עכברים מסוג בר, כולל עכברים על רקע (C) SV129/S6 ו-(D) C57/B6J. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר לחוקרים להעריך בקלות ובזול את המורפולוגיה של מיקרו-כלי דם ממוסמרים בעכברים, מיקום חדש להדמיית כלי דם היקפיים לא פולשנית. בדומה לשיטות NFC המשמשות בשרקנים²⁰ ובעכברים²¹, החוזק העיקרי של הפרוטוקול המתואר כאן הוא שהוא מאפשר הערכה מהירה ולא פולשנית של מיקרו-כלי דם היקפיים במודלים של מחלות בעכברים. זה יכול להיות שימושי במיוחד עבור מחקרים הכוללים הפרעות בכלי הדם ההיקפיים, כגון מחלות ראומטיות ^2,3 ומחלות אנדוקריניות כולל יתר לחץ דם וסוכרת ^7,8.

תוך רתימת השקיפות של ציפורן העכבר, קפילרוסקופיה ממוסמרת מציגה מיקום חדש להדמיה של מיקרו-כלי דם היקפיים. בהשוואה ל-NFC, שהוא שימושי במיוחד לניטור תנועת תאי דם^21,22, פרוטוקול הקפילרוסקופיה הממוסמר המתואר כאן מספק שטח גדול יותר לתצפית טובה יותר על המורפולוגיה והמבנה של כלי הדם המיקרו-וסקולריים.

כדי להבטיח הדמיה אופטימלית, אנו ממליצים לשים לב לשלבים המכינים את הציפורן להדמיה. הסרת שיער יעילה היא הכרחית להדמיה מוצלחת של ציפורניים; שיער המסתיר את הציפורן יוביל לכשל בהדמיה. אנו ממליצים גם להשלים את הסרת השיער לפחות 24 שעות לפני ההדמיה; זאת כדי לאפשר לכל גירוי מהליך הסרת השיער להיפתר. כדי להגביל את השונות שעלולה להתרחש בשימוש בשיטה זו, אנו ממליצים להשתמש בספרה השנייה של הכף האחורית להדמיה בשל גודלה הגדול יותר. זה גם שומר על עקביות בין בעלי חיים. יתר על כן, המריחה הנדיבה של שמן טבילה עוזרת לשפר את הרזולוציה של רשתות הנימים הקטנות עם המסמרים. לבסוף, מריחת סרט מעבדה בצבע מתאים מתחת לציפורן לפני ההדמיה משפרת גם את הניגודיות להדמיה של כלי הדם.

למרות היעילות של הטכניקה בפתרון מורפולוגיה של כלי דם ממוסמרים גסים, ישנן כמה מגבלות לטכניקה כפי שמתואר כאן. בשל אופי ממשק ההדמיה וגודל כלי הדם, רזולוציה של זרימת הדם או מהירות תאי הדם אינה אפשרית באמצעות פרוטוקול זה. עבודה נוספת על אופטימיזציה של לכידת תמונות כלי דם עשויה לאפשר גישות ניתוח תמונה אוטומטיות בעתיד, שיהיו בעלות ערך באפיון נוסף של תכונות מיקרו-וסקולריות היקפיות. שנית, הפרוטוקול המתואר דורש הרדמה של עכברים כדי לצלם תמונות ממוסמרות. הרדמה משנה את המורפולוגיה של כלי הדם לאורך תקופות זמן ארוכות (לאחר 65 דקות)²³. למרות שזמן ההרדמה קצר משמעותית בשיטה זו, החוקרים צריכים להיות מודעים לזמן שלוקח להשלים את ההליך מעכבר לעכבר כדי להבטיח עקביות ולהפחית את השונות בנתונים שנאספו.

הדמיית כלי דם היקפיים היא לרוב פולשנית ויקרה^12,13; עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן עוזר להתגבר על מגבלות אלה כדי לאפשר הדמיה של מורפולוגיה של כלי דם היקפיים במהירות, בזול ובקלות. לסיכום, שיטת הגישוש המתוארת בפרוטוקול זה יכולה להיות מיושמת במחקרים עתידיים שמטרתם לאפיין חריגות מורפולוגיות במסמר העכבר במודלים של מחלות כלי דם היקפיים.

ללא קשר לעבודה זו, ד"ר פסקואלה היה יועץ בתשלום ל-Twenty Twenty. ללא קשר לעבודה זו, קלרה קאזינס היא יועצת בתשלום ל-Cartography Biosciences. לכותבים האחרים אין מה לחשוף.

עבודה זו מומנה על ידי כספים מחלקתיים בלתי מוגבלים שהוענקו ללורן ק. וורהאם. ד"ר פסקואלה נתמך על ידי קרן הגלאוקומה (ניו יורק) ועל ידי מענק אתגר בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון (ניו יורק).