자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.

다중 지역 신경 기록은 다중 두뇌 지구 사이 정밀한 기간 상호 작용을 이해하는 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 기존의 마이크로 드라이브 설계는 단일 또는 다중 영역에서 한 유형의 전극만 사용하여 단일 단위 또는 깊이 프로파일 레코딩의 수율을 제한합니다. 그것은 또한 수시로 표적 통로 및/또는 세포 모형 특정 활동을 표적으로 하는 광유전학 공구와 전극 기록을 결합하는 기능을 제한합니다. 여기에 제시된 하이브리드 마이크로드라이브 어레이는 자유롭게 마우스를 이동하여 수율을 최적화하고 마이크로드라이브 어레이의 제조 및 재사용에 대한 설명을 제시합니다. 현재 디자인은 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시에 두 개의 서로 다른 뇌 영역에 이식 된 9 개의 테트로데스와 하나의 광 실리콘 프로브를 사용합니다. 테트로데스 와 광실리콘 프로브는 뇌의 등쪽 축을 따라 독립적으로 조절할 수 있어 단위 및 진동 활동의 수율을 극대화합니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 장거리 신경 회로의 지역 또는 세포 유형 별 반응 및 기능을 조사하기 위해 광, 광유전학 적 조작을 중재하는 설정을 통합합니다. 또한, 광실리콘 프로브는 각 실험 후에 안전하게 회수및 재사용할 수 있다. 마이크로 드라이브 어레이는 3D 인쇄 부품으로 구성되어 있기 때문에 다양한 설정을 수용하기 위해 마이크로 드라이브의 디자인을 쉽게 수정할 수 있습니다. 먼저 설명된 마이크로드라이브 어레이의 설계및 광섬유를 광유전학 실험을 위한 실리콘 프로브에 부착하는 방법, 이어서 테트로드 번들의 제조 및 마우스 뇌에 어레이의 이식이 있다. 광유전학 적 자극과 결합 된 국소 필드 전위 및 단위 스파이크의 기록은 자유롭게 움직이는 마우스에서 마이크로 드라이브 어레이 시스템의 타당성을 보여줍니다.

신경 활동이 학습 및 기억과 같은 인지 과정을 어떻게 지원하는지 이해하는 것이 중요합니다. 인지 작업의 근간이 되는 신경 활동의 역학을 해명하기 위해, 마이크로드라이브 어레이^1,2,^3의도움으로 동물에게 자유롭게 움직이는 대규모 세포외 전기생리학이 진행되고 있다. ⁴. 지난 2 년 동안, 마이크로 드라이브 배열의 여러 유형은 쥐에 대한여러 뇌 영역으로 전극을 이식하기 위해 개발되었다 5,^{6,7,8 및}마우스^{9, 10개 , 11세 , 12}. 그럼에도 불구하고, 현재의 마이크로 드라이브 설계는 일반적으로 여러 프로브 유형의 사용을 허용하지 않기 때문에 연구원은 특정 이점과 한계가있는 단일 전극 유형을 선택해야합니다. 예를 들어, tetrode 배열은 등쪽 해마 CA1^1,13과같은 인구 밀도가 높은 뇌 영역에 적합하며 실리콘 프로브는 해부학 적 연결을 연구하기위한 더 나은 기하학적 프로필을 제공합니다^{14 , 15}.

테트로데스와 실리콘 프로브는 생체 내 만성 기록에 자주 사용되며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. Tetrodes는 비용 효율성 및 기계적 강성 외에도 단일 전극^16,17보다더 나은 단일 장치 절연에서 상당한 이점을 갖는 것으로 입증되었습니다. 또한 마이크로 드라이브^{8,18,19,20과}결합 할 때 단일 단위 활동의 높은 수율을 제공합니다. 신경 회로의 기능을 이해하기 위해 동시에 기록된 뉴런의 수를 늘리는 것이 필수적이다^21. 예를 들면, 많은 수의 세포는 시간 관련²² 또는 보상 코딩²³ 세포와 같은 기능적으로 이질적인 세포 모형의 작은 인구를 조사하기 위하여 필요합니다. 훨씬 더 높은 셀 번호는 스파이크 서열^13,24,25의디코딩 품질을 향상시키는 데 필요합니다.

그러나 테트로드는 피질이나 시상과 같이 공간적으로 분포된 세포를 기록하는 데 단점이 있다. 테트로데스와 는 달리, 실리콘 프로브는 로컬^{구조(14,26)}내에서 로컬 필드 전위(LFP) 및 스파이크 활동의 공간 분포 및 상호작용을 제공할 수 있다. 다중 생크 실리콘 프로브는 기록 사이트의 수를 더욱 증가시키고 단일또는 인접 구조물(27)에 걸쳐 기록을 허용한다. 그러나 이러한 어레이는 테로데스에 비해 전극 부지의 위치 지정에서 덜 유연하다. 또한, 복잡한 스파이크 정렬 알고리즘은 테트로데스^28,29,30에의해 획득된 데이터를 미러링하기 위해 인접 채널의 동작 전위정보에 대한 정보를 추출하기 위해 고밀도 프로브에 요구된다. 따라서 단일 단위의 전체 수율은 종종 테트로데스보다 적습니다. 또한 실리콘 프로브는 취약성과 높은 비용으로 인해 불리합니다. 따라서, 테트로데스 대 실리콘 프로브의 선택은 기록의 목적에 따라 달라지며, 이는 기록 사이트에서 단일 단위 또는 공간 프로파일링의 높은 수율을 얻는 것이 우선순위에 있는지의 문제이다.

신경 활동을 기록하는 것 외에도 광유전학적 조작은 특정 세포 유형 및/또는 경로가 신경 회로 기능에 어떻게 기여하는지 조사하는 신경 과학에서 더 강력한 도구 중 하나가 되었습니다^{13,31, 32,33}. 그러나 광유전학적 실험은 자극 광원^34,35,36에섬유 커넥터를 부착하기 위해 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려가 필요하다. 종종 광섬유를 연결하려면 상대적으로 큰 힘이 필요하며, 이는 뇌의 프로브의 기계적 변화로 이어질 수 있습니다. 따라서 이식형 광섬유를 기존의 마이크로드라이브 어레이에 결합하는 것은 사소한 일이 아닙니다.

위의 이유로, 연구원은 전극의 유형 선택을 최적화하거나 기록의 목적에 따라 광섬유를 이식해야합니다. 예를 들어 테트로드는 해마^1,13에서더 높은 단위 수율을 달성하기 위해 사용되며, 실리콘 프로브는 내측 내측 피질(MEC)^37과같은 피질 영역의 층상 깊이 프로파일을 조사하는 데 사용된다. 현재, 테트로데스와 실리콘 프로브의 동시 이식을 위한 마이크로드라이브는 랫트^5,11에대해 보고되었다. 그러나 마이크로 드라이브의 무게, 마우스 헤드의 제한된 공간 및 다른 프로브를 사용하기 위해 마이크로 드라이브를 설계하기위한 공간 요구 사항으로 인해 마우스에 여러 테트로데스 및 실리콘 프로브를 이식하는 것은 매우 어렵습니다. 마이크로 드라이브없이 실리콘 프로브를 이식 할 수 있지만,이 절차는 프로브의 조정을 허용하지 않으며 실리콘 프로브 회수^(12,38)의성공률을 낮춥습니다. 또한 광유전학 적 실험은 마이크로 드라이브 어레이 설계에서 추가적인 고려 사항이 필요합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 만성 기록을 위한 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여 주며, 이를 통해 독립적으로 조절 가능한 9개의 테트로데스와 1개의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있습니다. 이 마이크로 드라이브 어레이는 또한 실리콘 프로브의 광유전학 적 실험 및 회수를 용이하게합니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 텍사스 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 마이크로 드라이브 어레이 부품 의 준비

1. 치과 모델 수지(그림1A,B)를 사용하여 3D 프린터를 사용하여 마이크로드라이브 어레이 부품을 인쇄합니다. 개별 3D 인쇄 레이어의 두께가 50 μm 미만인지 확인하여 인쇄된 부품의 작은 구멍을 선명하고 실행 가능한 상태로 유지합니다.
   참고 : 마이크로 드라이브 어레이는 5 부분으로 구성되어 있습니다 (그림1C): (1) 마이크로 드라이브 어레이의 본체, 테트로드를위한 9 개의 마이크로 드라이브 나사와 실리콘 프로브용 나사 1 개가 포함됩니다 (그림1Ca-d). 하단에 있는 광실리콘 프로브에 대한 테트로드 번들 및 구멍의 조정은 표적 뇌 영역의 좌표에 따라 달라집니다(도1Cd); (2) 실리콘 프로브 또는 옵트로드를 부착하는 셔틀 (도1Ce); (3) 실리콘 프로브 커넥터를 고정하는 프로브 전기 커넥터 마운트 (도1Cf); (4) 광섬유 커넥터를 연결/분리할 때 이식된 광실리콘 프로브의 원치 않는 움직임을 방지하기 위해 신체의 중앙 부분에 클램프하는 섬유 페룰 홀더(도1Cg); 및 (5) 안정적인 기록을 위해 마이크로드라이브 어레이에 물리적 및 전기적차폐를 제공하는 차폐 콘(도 1Ch). 마이크로드라이브 어레이의 총 중량은 차폐 원뿔을 포함하여5.9 g이다(표 1). 인쇄된 부품에 구멍이 막힌 경우 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫습니다: 내부 구멍에 대한 #76, 테트로드 마이크로드라이브 나사의 외부 구멍에 대한 #68, 테트로드 마이크로드라이브 나사 지지대 #71, 하단의 가이드 포스트 구멍에 대한 #77 몸을.
2. 마이크로 드라이브 어레이 본체에 가이드 포스트삽입.
   1. 26-Ga 스테인레스 스틸 와이어의 두 16mm 길이를 잘라. 로터리 그라인더를 사용하여 와이어 팁을 부드럽게 선명하게 합니다.
   2. 바디의 아래쪽 구멍에 와이어를삽입합니다(그림2A). 가이드 포스트를 고정하기 위해 몸의 바닥에 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 바친다.

2. 광 실리콘 프로브 준비

1. 실리콘 프로브를 위해 마이크로 드라이브 나사를 준비합니다.
   참고: 실리콘 프로브용 마이크로드라이브 스크류는 맞춤형 나사(300 μm 피치)로 구성되며, 지지 튜브와L자형 튜브(그림 2B)로 구성됩니다.
   1. 마이크로 드라이브 헤드에 대한금형을 준비합니다 (그림 2C). 금형을 구성하려면 마이크로 드라이브의 3D 인쇄 플라스틱패턴을 준비합니다(그림 2Ca). 이어서, 패턴 주위에 테이프를 넣어 임시 벽을 만든 후 액체 실리콘 젤을 부어. 부드럽게 흔들어 서 기포를 제거 하 고 경화 될 때까지 기다린 다음패턴에서 실리콘 젤 금형을 제거 (그림 2Cb).
   2. 회전 식 분쇄기를 사용하여 23G 스테인레스 와이어의 18mm 및 9.5mm 길이를 잘라냅니다. 치과 아크릴의 접착력을 향상시키기 위해 회전 분쇄기로 와이어의 상단 2-3mm를 거칠게합니다.
   3. 하나의 사용자 정의 나사를 가지고 치과 아크릴과의 마찰을 줄이기 위해 실리콘 오일의 소량을 적용합니다. 와이어와 사용자 정의 나사를 금형에 설정합니다.
   4. 전선과 나사 주위의 기포를 제거하기 위해 주사기를 사용하여 금형에 치과 아크릴을 붓습니다. 기포 오염으로 인해 마이크로 드라이브가 깨지기 쉽습니다. 치과 아크릴이 완전히 경화 될 때까지 기다린 다음 금형에서 마이크로 드라이브 나사를 벗습니다. 펜치를 사용하여 60° 각도로 긴 와이어 팁의 6mm를 구부립니다.
   5. 마이크로 드라이브 나사의 품질을 확인 (예를 들어, 균열, 기포, 및 마찰) 나사를 회전합니다. 마찰이 높은 경우, 마이크로 드라이브 나사와 결합하는 맞춤형 드라이버 팁이있는 전기 나사 드라이버를 사용하여 부드러워질 때까지 나사를 회전하십시오.
   6. 마이크로 드라이브 나사를 마이크로 드라이브 어레이 본체에 설치하여 나사를 돌려 위아래로 원활하게 움직이는지 확인하십시오. 나사를 본체 구멍에 삽입할 때 나사용 나사가 자동으로 생성됩니다.
2. 셔틀을 준비합니다(그림3Aa).
   1. 날카로운 가위를 사용하여 폴리에테더케톤(PEEK) 튜브 2개를 5mm 길이로 자른다. 셔틀의 양쪽에 튜브를 정렬합니다. 에폭시를 사용하여 튜브와 셔틀을 붙입니다.
   2. 가이드 포스트에 소량의 실리콘 오일을 바하십시오. 마이크로 드라이브 어레이 본체의 가이드 포스트에 삽입하여 셔틀의 품질을 확인합니다. 과도한 마찰 없이 셔틀이 원활하게 움직이는지 확인하십시오.
3. 광도를 준비합니다(그림3Ab). 광유전학 실험이 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   1. 루비 커터를 사용하여 광섬유를 길이 21mm로 절단합니다. 섬유 팁을 갈아서 팁을 평평하고 빛나게 만듭니다.
   2. 실리콘 프로브의 전면에 광섬유를 부드럽게 놓습니다. 섬유 팁은 전극 부위 의 상단 위에 200-300 μm 위치에 배치됩니다. 투명 테이프로 섬유를 일시적으로 잡습니다.
   3. 소량의 에폭시를 사용하여 실리콘 프로브의 베이스에 광섬유를 붙입니다. 에폭시가 완전히 완치될 때까지 적어도 5시간 동안 기다립니다.
      참고: 광섬유를 전극 부위와 같은 쪽에 부착하는 것이 좋습니다. 뒷면에 섬유를 부착하면 빛이 녹음 사이트를 제대로 비추는 것을 방지할 수 있습니다.
4. 실리콘 프로브에 셔틀을 부착 (그림3Ac):실리콘 프로브의 베이스 뒤쪽에 소량의 에폭시를 적용합니다. 셔틀의 하단 부분을 실리콘 프로브의 베이스에 부착하고 에폭시의 초기 경화 시 셔틀과 실리콘 프로브 베이스 사이의 간격이 형성되지 않도록 2-3 분 동안 자세를 유지합니다. 에폭시가 완전히 완치될 때까지 적어도 5시간 동안 기다립니다.
5. 조심스럽게 현미경 (그림 3B)에서 본체의 가이드 게시물에 셔틀튜브를 삽입합니다. 이 절차 동안, 미세 핀셋으로 셔틀의 홈을 잡으하십시오.
6. 나사를 돌려 마이크로 드라이브 나사를 나사 구멍에 삽입합니다. L자형 와이어의 팁을 셔틀 헤드의 홈에 삽입하여 실리콘 프로브와 마이크로드라이브 나사를 끼쳐 넣습니다(그림3C).
7. 프로브 전기 커넥터 홀더를 마이크로드라이브 어레이본체에 부착합니다(그림 3D).
   1. #0 나사 두 개를 3.5mm 나사 길이로 자른다. 팁을 갈아서 버를 제거합니다.
   2. 프로브 커넥터 홀더를 본체에 놓습니다. 실리콘 프로브 전기 커넥터를 홀더에 넣습니다.
   3. 에폭시를 사용하여 홀더에 실리콘 프로브 커넥터를 고정하고 실리콘 프로브의 회수 절차를 허용하기 위해 마이크로 드라이브 어레이 본체에 붙이지 않도록하십시오. 나사를 삽입하여 프로브 커넥터 홀더를 고정합니다.
8. 페룰 홀더를 광실리콘 프로브 및 마이크로드라이브 어레이본체에 부착합니다(그림 3D).
   1. 나사 2개 #0 6mm 나사 길이로 자른다. 팁을 갈아서 버를 제거합니다.
   2. 2개의 #0 기계 나사 너트의 외부를 연마하여 2.5-3.0mm의 외경을 가진 작은 육수 너트를 만들어 무게와 공간을 줄입니다.
   3. 나사를 홀더의 구성 요소 A에 삽입합니다. 에폭시를 사용하여 나사 헤드를 붙입니다.
   4. 부품 A와 B에 소량의 실리콘 그리스를 적용하여 본체와의 마찰을 줄입니다. 부품 A를 본체에 삽입한 다음 역 핀셋을 사용하여 일시적으로 유지합니다.
   5. 부품 B를 부품 A의 나사에 놓습니다. 사용자 정의 너트를 나사에 나사로 나사로 연결합니다. 펜치를 사용하여 견과류를 조여 몸에 페룰 홀더를 고정하십시오.
   6. 섬유 페룰 홀더(성분 B)의 홈에 섬유 페룰을 삽입합니다. 섬유 페룰이 홀더에서 4-5mm 밖으로 달라붙는지 확인하십시오.
   7. 페룰과 홀더 홈 사이에 소량의 에폭시를 바하십시오. 에폭시가 완전히 치유될 때까지 기다렸다가 페룰이 움직이지 않는지 확인합니다. 마이크로 드라이브 나사를 돌리기 전에 너트를 풀어 셔틀과 ferrule 홀더에서 부드러운 움직임을 확인하십시오.
   8. 프로브의 작동 거리를 확인합니다. 셔틀 튜브가 가이드 포스트와 여전히 연결되어 있는 동안 ferrule-holder가 맨 위 위치에 있을 때 프로브 팁이 바디로 완전히 후퇴해야 합니다. 최대 작동 거리는 실리콘 프로브의 길이와 표적 뇌 영역의 길이에 의해 결정됩니다.
   9. 마이크로 드라이브 나사가 느슨한 경우, 지원을 위해 더 많은 스레드를 추가하기 위해 나사 주위에 치과 아크릴의 소량을 적용합니다. 경화되면 나사를 회전하여 압박감과 안정성을 확인합니다.

3. 테트로드 준비

참고: 이 절차는 이전에 게시된문서 8,^19,20,39와유사합니다.

1. 테트로드를 위해 마이크로 드라이브 나사를 준비합니다. tetrode용 마이크로 드라이브는 맞춤형 나사와 23G 튜빙(그림2B)으로구성됩니다. 이 절차는 섹션 2.1과 유사합니다.
2. 내부에 5.5 mil 와이어가있는 30G 스테인레스 스틸 튜브 번들을 만듭니다. 이 경우 총 9개의 30G 튜브(8개의 레코딩 테트로데스 및 1개의 기준 전극)를 사용하였다.
3. 드라이브 본체 의 바닥에서 30G 번들을 스레드하고 본체에 20G 얇은 벽 튜브로 고정하십시오. 회전 분쇄기로 번들의 바닥을 다듬어 팁을 고르게 만들고 플러시합니다. 30G 튜브가 본체에서 약 0.5mm 튀어나오게 되도록 로터리 그라인더로 30G 튜브의 상단 부분을 다듬습니다.
4. 5.5 mil 폴리이미드 절연 튜브를 30G 튜브에 적재하십시오. 테트로드 와이어를 준비하고 32채널 전기 인터페이스 보드(EIB)에 로드합니다. 최종 정밀 절단 전에 임피던스 테스터와의 전기 연결을 확인하십시오.
5. 골드 도금 솔루션으로 250-350kΩ으로 낮은 전극 팁 임피던스. 슈퍼 접착제로 모든 테트로데스를 수정하십시오.
6. 밀봉 및 윤활을 위한 미네랄 오일로 폴리이미드 튜브와 테트로드 사이의 과도한 간격을 채웁니다. 접지선을 EIB로 라우팅합니다.
   참고: 필요한 경우, 광섬유는 테트로드^{와이어(12)를}따라 통합될 수 있다.

4. 차폐 콘 부착

1. 인쇄 된 원뿔의 내부에 페인트 실버 전도성 차폐 페인트. 원뿔 내부에 마이크로 드라이브 배열을배치합니다(그림 3E).
2. #0 나사 두 개를 3.5mm 나사 길이로 자른다. 마이크로 드라이브 어레이를 제자리에 고정하기 위해 콘 의 외부에서 나사를 고정합니다.
3. 스크류 헤드 주위에 실버 페인트를 적용하여 차폐 콘을 전기 접지와 전기적으로 연결합니다. 접지 선과 원뿔 사이의 전기 연결을 확인합니다. 마이크로 드라이브 어레이 본체와 차폐 콘 사이에 소량의 에폭시를 적용하여 본체를 단단히 부착합니다.
   참고 : 차폐 콘을 제조하는 또 다른 방법은 알루미늄 테이프^(40)를 사용하는 것입니다 (그림3F). 먼저, 알루미늄 호일을 종이에 붙인 후 차폐 콘용패턴 용지를 준비한다(도 3Fa). 그런 다음 종이를 롤액을 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 마이크로드라이브 본체에 부착합니다(그림 3Fb). 이 원뿔의 무게는 0.72 g이고 마이크로 드라이브 어레이의 총 중량은 4.7 g(표1)로 감소된다.

5. 임플란트 수술

참고 : 이 절차는 이중 사이트 이식에 대한 이전에 게시 된 기사^{18,39,41에서} 수정됩니다. 수술 후 빠른 회복을 위해 마이크로 드라이브 임플란트의 경우 동물의 무게가 25g을 초과해야 합니다.

1. 준비
   1. 접지 나사를 준비하려면 실버 와이어를 두개골 나사에 부착하고 실버 페인트를 적용하십시오. 그런 다음 실버 페인트를 사용하여 와이어의 반대쪽에 금핀을 부착합니다.
   2. 마이크로드라이브 어레이를 스테레오택 장치에 고정하도록 드라이브 홀딩 어댑터를 준비합니다. 에폭시를 사용하여 수커넥터를 스테인리스 핸들에 부착합니다. 커넥터와 스테인리스 핸들의 정렬이 직선인지 확인합니다.
   3. 기록 후 조직학적 확인이 필요한 경우, 실리콘 프로브(38)의 테트록 또는후면에 Di-I를 적용한다.
   4. 원하는 깊이로 실리콘 프로브를 아래로 낮춥힙습니다. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 풀고 실리콘 프로브의 마이크로 드라이브 나사를 돌려 실리콘 프로브 (opto-silicon 프로브)를 낮추고 너트를 고정하여 ferrule 홀더를 고정합니다. 해마 부위 CA1과 MEC의 실리콘 프로브에 테트로데스를 이식할 때 테트로드 캐뉼라와 실리콘 프로브 팁 사이의 거리는 3-4 mm입니다.
2. 스테레오탁스 장치에서 마취 마우스(0.8%-1.5%이소플루란)를 설정합니다. 마우스의 마취 상태는 발가락 핀치 반사의 부재에 의해 확인된다. 건조한 것을 방지하기 위해 눈에 투명한 연고를 바르십시오. 강한 외과 적 빛 노출로부터 보호하기 위해 호일 조각으로 눈을 덮습니다.
3. 모피를 면도한 후 요오드와 이소프로판올로 마우스의 두피를 소독합니다. 표준 수술 가위를 사용하여 두피에 1.5-2.0 cm 절개를하고 피하 리도카인을 적용 한 후 면봉을 사용하여 두개골 위에 조직을 제거하십시오.
4. 마우스 헤드를 입체 전적 도구에 맞춥습니다. 브레그마와 람다의 높이 차이가 100 μm 미만인지 확인합니다. 아틀라스를 사용하여 개두술 위치를 확인하고 멸균 된 연필로 이러한 위치를 표시합니다.
5. 두개골 나사 (0.8 mm 직경, 0.200 mm 스레드 피치)를 두개골에 1.5 회전 (0.3 mm)로 회전시키고 외과 용 핀셋과 스크루 드라이버를 사용하여 두개골에 8-11 구멍을 뚫은 후 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 고정하십시오.
   참고 : 정면 두개골에 2-4 구멍, 정수리 두개골의 양쪽에 2-3 구멍, 그리고 1-2 개 측 두개골에 구멍이 제안됩니다.
6. 심상 뼈에 구멍을 뚫은 후 지면 나사를 한 턴(0.2mm)으로 회전시켜 구멍에 부착합니다. 이 구멍이 뼈를 통해 뇌 케이스에 침투하지 않도록하십시오. 그렇지 않으면 소뇌 신호가 기록을 오염시것입니다. 임피던스 미터를 사용하여 지면 나사와 두개골 나사 사이의 1 kHz에서 임피던스가 20 kΩ 미만이지 확인하십시오.
   참고: 임피던스가 클수록 레코딩 중에 모션 아티팩트가 도입됩니다.
7. 표시된 위치에서 개두술을 수행합니다. 경막은 마우스에 그대로 남을 수 있다.
8. 접지 나사의 수커넥터와 마이크로드라이브 어레이의 접지 커넥터를 연결합니다. 접지 나사와 차폐 를 측정하여 임피던스 미터를 사용하여 연결을 확인합니다.
9. 마이크로드라이브 어레이를 어댑터에 설정하고 스테레오택시 장치로 설정하고 원하는 깊이까지 실리콘 프로브를 천천히 낮춥힙입니다. 실리콘 프로브가 뇌에 삽입될 때 테트로드 번들이 뇌 표면 위에 있지만 여전히 마이크로드라이브어레이 내부에 있는지 확인합니다(그림 4A).
10. 실리콘 프로브와 테트로드 번들의 영역을 밀봉하기 위해 실리콘그리스를 조심스럽게 적용합니다(그림 4B). 20G 바늘 의 끝에 소량의 실리콘 그리스를 넣고 바늘을 사용하여 프로브 주위에 그리스를 적용합니다. 실리콘 그리스가 프로브 주변을 완전히 덮을 때까지 반복하여 치과 아크릴이 전극/프로브 위 또는 밑으로 흐르지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 극적으로 기록 사이트의 임피던스를 증가시킬 것이다, 그리스가 전극 사이트를 만지지 않도록주의하십시오.
11. 치과 아크릴을 적용하여 마이크로 드라이브 어레이를 두개골의 고정 나사에 고정시다.
    참고 : 아크릴경화 중에 발생하는 과도한 열을 피하기 위해 3 층으로 치과 아크릴을 적용하는 것이 좋습니다.
12. 마이크로드라이브 어레이에서 어댑터를 조심스럽게 분리합니다. 탈수를 방지하기 위해 피하적으로 PBS 1 mL을 주입하십시오. 주입 5 mg/kg 멜 록시캄 피하 진통 치료로.
13. 실리콘 프로브 커넥터를 테이프로 덮어 먼지가 전기 연결내부로 들어가는 것을 방지합니다. 플라스틱 파라핀 필름을 사용하여 마이크로 드라이브 어레이를 덮고 제자리에 테이프를 놓습니다.
14. 3 일 동안 적절한 진통 치료를 투여하십시오 (예 : 하루에 한 번 2 mg / kg 멜 록시캄의 피하 주사). 테트로드 조정을 시작하기 전에 회복을 위해 3-5일 간 허용하십시오. 회복 기간 후에 이식된 마우스는 도 4C에도시되어 있다.

6. 실리콘 프로브 회수(그림 4D)

1. 케타민 (75 mg /kg)과 덱스 메데토미딘 (1 mg / kg) 마취제를 복강 내 로 주입하고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하십시오. 후드를 사용하여 심장을 통해 4 % 파라 포름 알데히드를 직접 교전시켜 마취 된 마우스를 수정하십시오. 설치류에 대한 외과 적 방법은 이전에^42에설명되어 있습니다.
2. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 느슨하게 합니다. 그런 다음 조정 나사를 돌려 실리콘 프로브를 마이크로 드라이브 어레이 본체 내부쪽으로 완전히 후퇴시켜 본체 의 상단으로 조심스럽게 이동합니다. 프로브를 상단 위치에 고정하도록 너트를 고정합니다.
3. 측면에서 두개골을 균열하여 바닥에서 마우스 뇌를 가져 가라. 마이크로드라이브 어레이가 이제 동물과 분리됩니다.
4. 실리콘 프로브를 구동하는 L자형 마이크로드라이브 나사를 완전히 제거합니다. 펜치를 사용하여 페룰 홀더의 너트를 풀고 꺼내십시오. 페룰 홀더의 구성 요소 A를 꺼낸다.
5. 프로브 커넥터 마운트를 풀고 드라이브 본체에서 분리합니다. 마이크로드라이브 어레이 본체에서 프로브 커넥터 마운트가 벗겨지을 수 있는지 확인합니다.
6. 핀셋으로 셔틀의 상단 부분을 잡고 마이크로 드라이브 어레이에서 실리콘 프로브 어셈블리를 조심스럽게 밀어 내십시오.
7. 콘택트렌즈 클리너(먼저 효소, 과산화수소 3%)로 프로브 팁을 최소 1일 동안 청소합니다. 현미경으로 이소프로판올 패드를 사용하여 전극 팁을 조심스럽게 닦으소. 프로브를 정전기가 없는 저장 상자에 보관하십시오.
   참고: 셔틀 및 프로브 커넥터 마운트는 실리콘 프로브에 부착된 상태로 유지되며 다음 이식시 재사용할 수 있습니다.
   참고: 일부 실리콘 프로브는 과산화수소로 견딜 수 없습니다. 이 경우, 프로테오라틱 효소만을 함유하는 콘택트렌즈 용액을 사용한다.
8. 다음 수술을 위해 마이크로 드라이브 어레이 본체를 재사용하려면 미세 팁 드릴과 니퍼의 조합을 사용하여 치과 아크릴을 제거하십시오. 그런 다음 제거 된 치과 아크릴을 아세톤에 담그어 두개골 나사를 회수하십시오. 아세톤은 마이크로 드라이브 어레이의 플라스틱 부품을 용해시울 수 있습니다.
9. 메스를 사용하여 마이크로 드라이브 본체와 차폐 콘 사이의 에폭시를 제거합니다.
   참고: 마이크로드라이브가 파손되지 않은 경우 다음 수술을 위해 추가 부품을 다시 인쇄할 필요가 없습니다.

마이크로 드라이브 어레이는 5 일 이내에 구성되었습니다. 마이크로 드라이브 준비의 타임 라인은 표2에 설명되어 있습니다. 이 마이크로드라이브를 사용하여, 9개의 테트로데스 및 1개의 실리콘 프로브를 마우스의 해마 CA1 및 MEC[21주 령/29 g 체중 남성 pOxr1-Cre(C57BL/6 배경)]에 각각 이식하였다. 이 형질전환 마우스는 MEC 층 III 피라미드 뉴런에서 Cre를 발현한다. 마우스를 AAV5-DIO-ChR2-YFP(7.7 x 10¹² gc/mL)의 200 nL로 전극 임플란트 10주 전에 MEC에 주입하였다. LFP는 로우 패스 필터(1-500 Hz)를 사용하여 기록하였고, 하이패스 필터(0.8-5 kHz)를 사용하여 스파이크 유닛을 검출하였다. 광 자극(λ = 450 nm)은 섬유 커넥터의 끝에서 측정된 10.6 mW 강도에서 1 ms 펄스 폭을 사용하여 수행하였다. 테트로드 기록을 위한 기준 전극은 전용 테트로드 와이어를 사용하여 백색 물질에 배치되었다. 실리콘 프로브 기록에 대한 레퍼런스는 프로브의 상부 채널로서 설정되었다.

테트로드 조정 후, 동작 성능은 선형 트랙(도5A)및 개방 필드(도5B)에서테스트하였다. 두 실험에서 마우스는 ~ 30 분 동안 자유롭게 탐색했습니다 (그림5Aa, b,c; 그림 5Ba, b,c). 전기 생리학적 신호는 기록 세션 전반에 걸쳐 심한 운동 관련 잡음 없이 성공적으로 기록되었다(그림5Ad, e; 그림 5 Bd,e). 다음으로, MEC에서 MEC층 III 뉴런을 CA1^43(도 6A)에투영하여 광 자극을 수행하였다. 자발적인 스파이크 활동(도6B,C) 및 LFP(도6D)는마우스가 자고 있을 때 테로데스 및 실리콘 프로브로부터 기록되었다. 테트로디에 기록된 LFP는 큰 잔물결 활동을 보였으며, 이는 모든 테트로드가 CA1 피라미드 형 세포 층 부근에 위치했다는 것을 시사한다. MEC에서 먼저 광 유도 반응성 활동이 관찰되었고, CA1에서 13-18 ms 대기 시간(도6E)이뒤따랐다.

그림 1: 마이크로드라이브 어레이 개요. (a) 테트로드 측(a) 및 실리콘 프로브 측(b)으로부터 마이크로드라이브 어레이의 골격 보기. (b) 로드된 마이크로드라이브 어레이의 실제 이미지로, 테트로드 측(a)과 실리콘 프로브 측(b)으로부터 바라보았다. 마이크로드라이브 어레이는 패널(b)의 지그 스테이지에 배치된다. (C) 개별 3D 인쇄 마이크로 드라이브 어레이 부품. (a-d) 마이크로 드라이브 어레이 본체는 네 가지 각도에서 볼 수 있습니다 (a : tetrode 측면보기; b : 실리콘 프로브 측면 보기; c : 상단보기; d : 아래쪽보기). 패널(c)의 파선 확대 뷰는 그림 2A에나와 있습니다. (e) 실리콘 프로브를 잡고 조정할 수 있는 셔틀. 실리콘 프로브는 패널(e)의 파선에 부착됩니다. (f) 32채널 실리콘 프로브 커넥터를 보유한 프로브 커넥터 홀더. (g) 광섬유 커넥터를 광원으로 연결/분리할 때 프로브의 움직임을 방지하기 위해 광섬유 페룰을 보유하는 광섬유 페룰 홀더. 이 부품은 [패널(g)]과 구성요소 A및 B의 두 가지 구성요소로 구성됩니다. (h) 전도성 재료로 페인팅 할 때 물리적 및 전기 차폐를 제공하는 인쇄 된 차폐 콘. 원뿔 창을 사용하면 마이크로 드라이브 어레이 준비 중에 구조 내부를 볼 수 있으며, 이는 결국 테이프 또는 3D 인쇄 재료로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 본체에 가이드 포스트 및 마이크로 드라이브 나사 준비. (A) 가이드 후 준비. (a) 그림 1Cc에표시된 마이크로드라이브 어레이 본체의 확대보기. (b) 몸의 구멍에 삽입 후 가이드. (B) 마이크로 드라이브 나사 설계. (a) 실리콘 프로브용 마이크로드라이브 나사로 300 μm 피치 맞춤형 나사, 지지 튜브 및 L자형 튜브로 구성됩니다. (b) 160 μm 피치 사용자 정의 나사와 30G 스테인레스 가이드 튜브로 구성된 tetrode용 마이크로 드라이브 나사. (C) 마이크로 드라이브 나사의 상단 부분의 제조 : (a) 마이크로 드라이브 나사에 대한 안티 몰드의 3D 인쇄 패턴의 준비. 그림은 실리콘 프로브 마이크로 드라이브 나사에 대한 패턴을 보여줍니다. (b) 금형 방지 패턴 (a) 및 실리콘 고무 소재를 사용하여 만들어진 금형. 조립 된 마이크로 드라이브 나사는 사용자 정의 나사와 와이어 / 튜브를 삽입하고 각 우물에 치과 아크릴을 부어 생산됩니다. 인세트: 금형 웰의 확대뷰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마이크로드라이브 어레이 어셈블리. (A) 광실리콘 프로브의 제조. (a) 두 개의 플라스틱 가이드 튜브를 셔틀에 부착합니다. (b) 실리콘 프로브에 광섬유를 접착시킨다. (c) 광실리콘 프로브에 셔틀을 부착한다. 이 사진에서, 셔틀의 하단 부분(파선)은 실리콘 프로브의 베이스[b의 뒤쪽]에 부착된다. 셔틀과 실리콘 프로브 생크는 병렬로 있어야 합니다. (B) 광실리콘 프로브 셔틀 어셈블리를 마이크로드라이브 어레이 본체의 가이드 포스트에 로딩합니다. (c) 실리콘 프로브 마이크로드라이브의 상대적 위치는 프로브가 완전히 체내로 후퇴될 때 (a) 및 구동 본체(b)에서 가장 낮은 위치에 위치할 때이다. L 자형 와이어는 셔틀의 홈에 삽입됩니다. (D) 광섬유 페룰 홀더와 프로브 커넥터 마운트의 분해 뷰입니다. (E) 차폐 원뿔이 부착되어 있습니다. 전도성 재료는 원뿔 내부에 그려집니다. (F) 종이와 알루미늄 테이프를 사용하여 다른 차폐 콘. (a) 패턴 용지. (b) 3D 프린팅 버전에 비해 1.1 g의 무게를 줄이는 부착된 대체 차폐 원뿔입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 수술 중 프로브를 밀봉하고 실리콘 프로브를 회수합니다. (A) 실리콘 그리스를 적용하기 전에 개두술 후 마이크로 드라이브 어레이와 마우스 두개골. 실리콘 프로브는 이 때 뇌에 약 2mm 삽입됩니다. (B) 치과 아크릴로부터 프로브를 보호하기 위해 실리콘 프로브 및 tetrode 번들 주위에 실리콘 그리스를 적용합니다. (c) 만성적으로 이식된 마우스는 회복 기간 이후에, 마우스가 걷고 있을 때(a), 그루밍(b), 및 카운터 밸런싱 풀리 시스템(c)과 함께 기록 케이블에 연결될 때. (d) 회수된 실리콘 프로브는 (a) 및 (b) 세척용액에 침지하기 전과 후이다. (a)의 생물학적 조직은 세정 과정(b) 후에 제거된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 행동 마우스로부터해내 내측 내측 피질(MEC)에서 동시 테트로드/실리콘 프로브 기록의 예. (A) 선형 트랙에 기록. (a) 리코딩에 사용되는 선형 트랙입니다. (b) 트랙에서 ~ 30 분 동안 마우스 탐색의 궤적. (c) 선형 트랙의 동작 성능입니다. (d-e) 대표적인 LFP 기록은 테트로드(d) 및 실리콘 프로브(e)로부터의 기록이다. (B) 열린 필드에 기록합니다. (a) 리코딩에 사용되는 개방 필드 챔버. (b) 챔버에서 ~30 분 동안 마우스 탐사의 궤적. (c) 열린 필드의 행동 성능. (d,e) 대표적인 LFP 기록은 테트로드(d) 및 실리콘 프로브(e)로부터의 기록이다. LED는 마우스의 위치를 기록하기 위해 헤드 앰프에 부착됩니다. 선형 트랙과 오픈 필드 챔버는 전기 접지와 연결되어 정전기 소음을 줄입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: CA1 및 MEC 및 광유전학 적 자극에서동시 기록의 대표적인 결과. (A) 주입 4주 후 AAV5-DIO-ChR2-YFP의 발현. MEC 층 III 등가 MEC에서 등등 CA1에 그들의 축세포를 투영하는 피라미드 형 뉴런. 파선: 오리, 지층 오리엔스; 캐, 지층 피라미드; 라드, 지층 라디에이터럼; 몰, 지층 lacunosum 분자. (B) 대표 스파이크 테트로데스 중 하나에서 기록. (a) tetrode에서 기록된 스파이크의 2D 클러스터 프로젝션. (b) (a)에서 파선으로 표시되는 3개의 클러스터의 평균 스파이크 파형의 예. (C) 실리콘 프로브 전극 사이트 중 하나에서 대표적인 스파이크 기록. (a) 스파이크 주 성분의 2D 클러스터 프로젝션. (b) 3개의 클러스터의 평균 스파이크 파형의 예. 스파이크 클러스터(분홍색 및 녹색)는 노이즈 클러스터(파란색)와 분리됩니다. (B,C)의 클러스터는 KlustaKwik 소프트웨어를 사용하여 계산됩니다. (D) CA1(a)의 테트로데스와 MEC(b)의 실리콘 프로브로부터 동시에 기록된 자발적 LFP의 트레이스. 검은 색 화살표는 (C)에 도시된 (B) 및 실리콘 프로브 전극 부지에 도시된 테트로드를 나타낸다. (E) MEC(b)의 CA1(a) 및 실리콘 프로브의 테트로데스로부터 펄스 광학 자극(10.6 mW, 1 ms; 채워진 적색 화살촉)에 대한 LFP 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 각 마이크로드라이브 어레이 부품의 개별 중량. 마이크로 드라이브 어레이의 총 중량은 에폭시로 보호 콘을 고정 한 후 5.9 g이었습니다 (*종이 및 알루미늄 테이프를 사용하여 대체 차폐 콘을 사용하는 경우).

표 2: 마이크로드라이브 준비의 타임라인입니다. 실리콘 고무 /치과 아크릴 / 에폭시를 경화하고 tetrode 와이어를적재하는 3D 부품 인쇄는 총 4-5 일 동안 마이크로 드라이브 어레이 준비 시간의 대부분을 차지합니다.

보조 파일: 보조 파일에는 .sldprt 및 .stl 형식모두에서 5개의 마이크로드라이브 부품의 3D 모델 데이터가 포함됩니다. 원래 3D 모델 파일은 소프트웨어 Solidworks2003으로 만들어졌습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 자유롭게 행동하는 마우스에서 실리콘 프로브를 사용하여 두 뇌 영역에서 신경 활동을 기록할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이를 구성하고 이식하는 방법을 보여줍니다. 또한 실험 후 광유전학 적 실험 및 실리콘 프로브의 회수를 보여줍니다. 조정 가능한 실리콘 프로브³³ 또는 광실리콘 프로브³⁶ 이식은 이전에 마우스에서 입증되었지만, 이 프로토콜은 동시 테트로드 어레이 및 광실리콘 프로브 이식에 분명한 이점을 제공하여 유연성을 제공합니다. 이식된 프로브 유형의 선택. 이식된 프로브의 종류는 다중 생크 프로브^27,44 또는 초밀도 Neuropixels 21,^45와같은 실험의 목표에 따라 전환될 수 있다. 이식 7의 조정 및 각도는 필요에 따라 3D 객체 설계 단계에서 용이하게 수정될^수 있다. 예를 들어, 이중 부위 또는 삼중 부위 기록은 해마^46,내측 피질^47,전두엽 피질^48,편도체^49와같은 기억 관련 뇌 구조전반에 걸친 학습 작업 중에 가능합니다. 피질^50을cingulate .

성공적인 임플란트 및 기록을 위한 몇 가지 중요한 절차가 있습니다. 실리콘 기반 프로브의 취약성으로 인해 조립 중에 마이크로드라이브 어레이에 대한 기계적 진동이나 충격을 최소화해야 합니다. 예를 들어, 실리콘 프로브를 마이크로드라이브 어레이에 로딩하기 전에 드릴을 사용하여 막힌 구멍을 여는 작업이 완료되어야 합니다. 또한 마이크로 드라이브 어레이 시공 및 임플란트 수술 중 각 단계의 접지 연결을 신중하게 확인하여 기록된 데이터의 안정성을 보장해야 합니다. 지면에 대한 불안정하거나 임피던스 연결이 발생하여 레코딩 세션 중에 큰 소음과 모션 관련 아티팩트가 발생합니다. 안정적인 기록을 위해, 뇌 조직이 임플란트 수술에 의해 부정적인 영향을 받고 있기 때문에 전극 드리프트를 피하기 위해 수술 후 1-2 주를 기다리는 것이 좋습니다. 그러나 실리콘 프로브의 신호 품질은 이전 경험에 기초하여 외과 적 외상으로부터 1-2 주 후에 회복됩니다. 다른 마우스에 의해 이식 된 마이크로 드라이브 어레이의 손상을 방지하기 위해 단일 하우징을 사용하는 것이 좋습니다. 광유전학 실험의 경우, 대부분의 실리콘 프로브는 광^{자극(51)에}반응하여 사진 아티팩트를 유도하는 반면, 다른 프로브는 사진 아티팩트(52)를 최소화하도록 설계되어 있습니다(사진 아티팩트가 감소되어 있습니다) 시판되는 실리콘 프로브).

마이크로 드라이브 어레이 (5.9 g)의 무게는 이전 기사^12,53에설명 된 일반적인 마이크로 드라이브보다 무겁습니다. 및 견과류: ~22%). 임플란트 수술에 25g(~2-3개월 된 C57BL/6 마우스^54,55)의무게를 가진 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 이유로,이 마이크로 드라이브 배열은 청소년 마우스를위한 최선의 해결책이 아닐 수 있습니다. 마우스 의 체중의 5 %-10 %인 장치는 종종 임플란트^12,56 (이^57에대한 지원 게시 된 데이터가 없지만)에 대해 용납되도록 유도되지만,이 마이크로 드라이브 어레이는 체중의 ~ 24 %의 무게를 가합니다. 25 g 마우스 (~19% 아래에 설명 된 대체 콘을 사용 하는 경우).

그러나, 이식된 성인 마우스는 자유롭게 움직이고 홈 케이지에서 뛰어다닐 수 있었습니다. 유사한 마이크로드라이브 어레이 중량(~4.5 g)으로 이식된 마우스는 식품 제한^{13,17하에서도}행동 태스크(linear maze task)를 수행하는 것으로 이전에 나타났다. 무게의 단점은 중대 밸런싱^{시스템(18,34,58} 또는 헤드포스트 시스템^59)이 마이크로드라이브 어레이를 지원하기 때문에 기록 시 문제가 되지 않는다. 또한, 마이크로 드라이브 어레이의 총 중량은 높이를 낮추거나 차폐 콘의 두께를 줄이고 더 작은 나사를 활용하기 위해 설계를 수정하여 줄일 수 있습니다.

현재 3D 프린팅 재료를 사용하여 차폐 원뿔의 두께를 ~0.3 mm (현재 두께 ~ 0.6 mm)까지 줄일 수 있습니다. 테트로드 와이어가 여전히 덮일 수 있는 한 원뿔 높이를 ~5mm 줄일 수 있습니다. tetrode 와이어의 노출은 전선의 파손및 장기 기록의 실패를 초래할 것이다. 대안적으로, 종이 및 알루미늄 테이프를 사용하여 차폐 콘의 제조는 원뿔 중량을 ~0.7 g (총 중량의 ~ 15 %로 감소시킬 수 있습니다; 원래 마이크로 드라이브 어레이의 총 중량에서 20 % 감소); 하지만, 이들은 체력과 트레이드 오프. 또한 마이크로 드라이브의 크기(전류 차폐 원뿔: 4.2 x 4.0 x 2.6 cm = 주요 축 x 마이너 축 x 높이)는 동물 케이지 의 상단에서 제공되는 경우 식품 및 물 접근에 장애물이 될 수 있습니다. 케이지 바닥이나 측벽에서 제공되는 한 마이크로 드라이브는 먹기, 음주, 손질, 양육 또는 중첩^60과같은 마우스의 자연적인 행동을 방해하지 않습니다.

결론적으로, 이 마이크로 드라이브 프로토콜은 장거리 신경 회로의 역학과 기능을 이해하기 위해 자유롭게 움직이는 마우스의 여러 뇌 영역에서 녹음할 수 있는 유연한 선택을 연구원에게 제공합니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 작품은 일본과학해외연구동호회(HO), 부여된 장학생프로그램(TK), 인간개척과학프로그램(TK), 뇌연구재단(TK), 교수과학기술취득, 보존 프로그램 (TK), 뇌 및 행동 연구 재단 (TK), 스미토모 재단 연구 보조금 (JY), 나르사드 젊은 조사자 연구 보조금 (JY). 원고를 준비하는 동안 귀중한 의견과 제안에 대해 W. Marks에 감사드립니다.