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여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.
이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.
젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymography, 젤 Coomassie 파란 등 단백질 염료와 스테인드 하 고 효소 활동 즉, 흰색 밴드 (단백질의 저하)는 진한 파란색 배경에 신호의 손실으로 감지 합니다.
여기, 우리는 젤 zymography, 있는 분해성 기판은 짧은, fluorogenic 펩 티 드 covalently polyacrylamide 젤 (그림 1)에 통합 하는 대체 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 분해성 기판으로 합성 펩 티 드의 대체 기본 단백질9전통적인 젤 zymography에 비해 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다. Fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 펩 티 드 보급 및 이전 방법9,10관찰 하는 젤 전기 이동 법 동안 마이그레이션 방지 합니다. 또한, fluorogenic 기판의 사용은 추가 얼룩-얼룩 단계 없이 프로 테아 제 활동의 직접 검출을 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 zymogram 젤에서 fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 통해 생물학 견본에서 효소 활동의 탐지.
1입니다. 해결 젤 층의 준비
2. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자의 준비
3. 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드의 준비
4입니다. 겹쳐 쌓이는 젤의 준비
5입니다. 전기 이동 법에 대 한 생물 학적 샘플의 준비
6. 펩 티 드 Zymography 젤에서 전기 이동 법 생물의 샘플
7. 영상 펩 티 드 Zymography의 젤
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases14을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP 14 MMP 1115의 검출에 대 한 최적화 된 시퀀스입니다. 펩 티 드 dabcyl (끄는) 및 fluorescein (fluorophore) N-hydroxysuccinimide (NHS)-에스테 르를 사용 하 여 표시 됩니다 아민 화학11. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서, C 터미널 시스테인을 포함 하도록 상용 형광 효소 기질에서 펩 티 드 순서를 적응은 종종 새로운 fluorogenic 센서를 개발 하는 성공적인 전략. 설명 하기 위해 복잡 한 효소 혼합물을 분리 하는 펩 티 드 zymography의 기능은, 바른된 미디어는 두 다른 암 세포 선에서 수집 되었다. HT1080 fibrosarcoma 세포와 MDA-MB-231 유 방 선 암 세포 10 %FBS 미디어에서 24 시간 후 미디어 추가 24 시간 동안 혈 청 자유로운 미디어와 대체 되었다 도금 했다. 바른된 미디어 샘플 수집 그리고 10 kDa 분자량 컷오프 원심 필터 단위를 사용 하 여 집중. 미디어의 단백질 콘텐츠는 표준 µBCA 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 바른된 미디어에서 단백질의 30 µ g electrophoresed 했다. 긍정적인 컨트롤로 우물 유형 나 세균성 콜라 (100 µ g) 또는 정화, MMP 9 활성화 (125 기)도 포함 됐다. 젤 젤 (그림 2) 내 분해성 기판의 MMP 분열 수 있도록 버퍼를 개발에 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 그 후 몇 군데. 형광 이미징만 단일 밴드 QGIW 젤 (그림 2D14) 내에서 분명 했다 동안 수많은 밴드 LACW 펩 티 드 젤 (그림 2A14), 내 표시 했다 밝혔다. LACW 젤 젤라틴 zymography (그림 2G14), 비해 더 분해 밴드, 프로 테아 제 보다 생물 학적 샘플 내 존재의 넓은 범위를 검색 하는 펩 티 드 zymography의 능력을 보여주는 검색 수 있었다 네이티브 기질을 사용 하 여 전통적인 방법입니다.
MMPs 시각화 된 밴드의 정체성을 확인 하려면 펩 티 드 zymography 젤 중 20 µ M를 포함 하는 개발 버퍼에서 incubated 했다 GM6001, 넓 스펙트럼 MMP 억제제 또는 10 µ M E-64, 일반 cathepsin 억제제. GM6001와 LACW 펩 티 드의 치료 젤 (그림 2B14) E-64 (그림 2C14) 치료 했다 아무 뚜렷한 효과 밴드의 강도 감소. GM6001와 QGIW 펩 티 드 젤의 치료 이전 본된 밴드 (그림 2E14)의 완전 한 제거 귀착되는. 예상 대로 E-64 어떤 효과 (그림 2F14)는 하지 않았다. 둘 다 펩 티 드 젤에서 GM6001 저해 MMP 9 활동 순화 하지만 미치지 않았다 세균 콜라 활동, 형광의 시각화 된 증가 MMPs 시험된 생체 내 존재에 의해 분해 활동의 결과 추가 확인 샘플입니다.
현재 골드 표준, 젤라틴 zymography, 펩 티 드 zymography의 감도 비교 하는 민감도 분석 정화, 활성화 된 MMP-9를 사용 하 여 실시 했다. MMP-9 (1-250 ng)의 직렬 희석 LACW, QGIW 및 젤라틴 zymography 젤 (그림 3A14) electrophoresed 했다. 개발 및 형광 이미징, 밴드 농도 ImageJ로 계량 했다 및 정규화 된 밴드 강도 플롯 최대 신호 (그림 3B 의 50%를 생산 하는 EC50 값의 농도 계산 하기 위해 생성 된 14). LACW 펩 티 드 젤 17.28 EC50 값 MMP 9의 작은 농도 감지할 수 있었다 59.50의 값 QGIW 및 젤라틴 zymograms에 비해 ng, ng 및 31.85 ng, 각각. 이러한 데이터는 펩 티 드 zymography 사용 하 여 일치 하거나 젤라틴 같은 네이티브 기판의 감도 한계를 초과 수 있습니다 나타냅니다.
그림 1: 형광 펩 티 드 zymography 프로세스의 도식. (A) 멀티 레이어 polyacrylamide 젤 해결의 준비. 젤 솔루션 해결 표준 10%는 펩 티 드 zymography 젤의 첫 번째 레이어를 형성 하는 데 사용 됩니다. 담금질, 형광 펩 티 드를 포함 된 레이어를 젤 두 번째 10% 해결 하 고는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자는 다음 첫 번째 레이어 위에 생산. 최종 상위 계층 5% 겹쳐 쌓이는 젤입니다. (B) 표준 전기 비 감소에서 조건 기능성 polyacrylamide 젤에서 샘플 포함 하는 효소를 분리 하는 데 사용 됩니다. SDS를 제거 하 고 renature에 단백질은 젤 세척 된다. 젤 다음 수 프로 테아 제는 fluorogenic 펩 티 드, 증가 형광의 결과로 다니엘을 37 ℃에서 24 h에 대 한 개발 버퍼에서 알을 품는. 이 형광, 효소 활동, 해당 488 nm의 여기 및 521의 방출에서 형광 젤 영상 장치를 사용 하 여 캡처된 다음 nm (Biotechniques 및 미래 과학14허가 적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 세포 분 비 프로 테아 제 인간 암 세포 선에서의 탐지. 콜라 효소 (100 µ g), MMP 9의 분석 (125 기) 셀 미디어 HT1080 fibrosarcoma (30 µ g) 및 LACW 및 QGIW 펩 티 드 젤 MDA-MB-231 선 암 유 방 암 (30 µ g) 셀 라인에서 조절 하 고. 젤은 DMSO (차량 통제) (& D)로 치료, GM6001 (B & E) 취급 또는 E-64 (C & F)으로 처리 있었다. (G) HT1080 및 MDA-MB-231의 젤라틴 zymogram 조절 셀 미디어 (Biotechniques, 미래 과학14허가 적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 펩타이드와 젤라틴 Zymograms의 MMP 9 감도의 비교. (A) QGIW (맨 위), LACW (가운데)와 젤라틴 (아래) zymography 젤 MMP 9의 직렬 희석을 복종 되었다. (B) 정규화 밴드 농도 MMP 9 농도 대 한 플롯 되었고 4 개의 매개 변수 슬로프 곡선에 맞게. EC50 값 절반 최대 신호에서 농도 나타냅니다. 결과 n으로 표시 되는 = 3, SD (Biotechniques 및 미래 과학14허가 적응) 의미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
결심 젤 | ||||
재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
Tris HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 15 mL | 30 mL |
나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 200 Μ L | 400 Μ L |
이온된 H2O | -- | -- | 14.4 mL | 28.7 mL |
TEMED | -- | -- | 40 Μ L | 80 Μ L |
APS | 10% | 0.10% | 400 Μ L | 800 Μ L |
총 볼륨 | 40 mL | 80 mL | ||
펩 티 드 해결 젤 | ||||
재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
Tris HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 7.5 mL | 15 mL |
나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
이온된 H2O | -- | -- | 6.5 Μ L | 13 mL |
형광 성 펩 티 드 | 10 m m | 75 Μ M | 150 Μ L | 300 Μ L |
Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker | 75 m m | 1.5 m m | 400 Μ L | 800 Μ L |
TEMED | -- | -- | 20 Μ L | 40 uL |
APS | 10 | 0.10% | 200 Μ L | 400 Μ L |
총 볼륨 | 20 mL | 40 mL | ||
겹쳐 쌓이는 젤 | ||||
재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 5% | 2.5 mL | 5 mL |
Tris HCl pH 6.9 | 1 M | 0.125 M | 2.5 mL | 5 mL |
나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
이온된 H2O | -- | -- | 14.75 mL | 29.5 mL |
TEMED | -- | -- | 50 Μ L | 100 Μ L |
APS | 10% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
총 볼륨 | 20 mL | 40 mL |
표 1: 형광 펩 티 드 zymography 젤을 준비 하기 위한 시 약 테이블. 농도 및 다층 펩 티 드 zymography의 준비에 대 한 볼륨 젤.
현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아의 검출 보다 현재 네이티브 기판으로 달성. 형광 펩 티 드의 높게 가변 자연 연구원 그들의 프로 테아 제 관심의 대상 기판 설계 하는 능력을 준다. 수많은 펩 티 드 기질 다양 한 프로 테아 제 펩 티 드 라이브러리를 사용 하 여에 대 한 확인 되었습니다 그리고 상용 소스 사용자 지정 펩 티 드 제조의 성장 수가 있다. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 상업적으로에서 펩 티 드 순서를 적응 C 터미널 시스테인을 포함 하도록 사용 가능한 형광 효소 기판은 종종 새로운 fluorogenic 센서를 개발 하는 성공적인 전략.
이 프로토콜을 완료 하는 동안 한다 주의 형광 펩 티 드 젤을 처리 하는 동안 검색 된 형광 신호를 크게 줄일 수 있습니다이 빛에 과도 한 노출 방지 하기 위해. 또한, 각 젤에 사용 하는 펩 티 드의 현재 농도 75 µ M. 이 낮은 농도 펩 티 드, 펩 티 드를 초과 azido-PEG3-maleimide 솔루션 적어도 20 모 랄에서 솔루션에 추가 되어야 합니다 염두에 유지 보존 하기 위해 조정할 수 있습니다. Azido-PEG3-maleimide 키트 3 크기에 구입할 수 있다 (25, 100 및 1000 mg). 저자에 준비 솔루션-20 ° c.에 시간의 짧은 기간에만 저장할 수 있습니다 25 밀리 그램 키트를 구입 하는 것이 좋습니다. 또한, 25 밀리 그램 키트 준비의 3 주 이내 사용 해야 하는 10 펩 티 드 젤을 준비 해도 됩니다.
Zymography의 제한 중 하나입니다 시각화 된 효소 분자 무게에 상당한 중복으로 인해 밴드의 정확한 id를 분별에 어려움. 미래 연구, 그것 됩니다 보조 분석 질량 분석16,17같은 기술을 사용 하 여 자신의 정체성을 중요. Zymography의 또 다른 한계는 SDS와 전기 이동 법에 의해 부분 변성 시키기 다음 그들의 활성 구조를 단백질을 refolding 이다. 이러한 프로세스는 proteolytically 비활성 단백질을 활성 렌더링 protease의 활성 구조에 변화를 일으킬 수 있습니다. 예를 들어 프로-MMP-2 억제 프로 도메인 그대로 인해 불구 하 고 젤라틴 zymograms에서 검출 될 수 있다 중간 활성 폼에는 renaturation 하. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 보충 방법 또는 서 몰아내고 정체성과 관심의 효소의 전체 존재를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 문서는 현재 zymographic 기술의 감도 향상을 위한 형광 펩 티 드 기판의 사용을 보여줍니다. 순화 된 MMP-9를 사용 하 여, 농도 기온 변화도 분석 LACW, QGIW 및 젤라틴 zymography 젤 비교를 실시 했다. 현재, 젤라틴 zymography은는 표준 기술에 gelatinases (MMP-2-9)는 감지 생물학 견본에서. 3 기판의 EC50 값을 비교, LACW 펩 티 드 젤 낮은 값, 높은 감도 나타내는 했다. 특정 프로 테아의 탐지를 위한 다른 펩 티 드 시퀀스를 활용 하 여 잠재적으로 더욱 이러한 감도 높일 수 있다. 4-aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA) 또는 헤 파 린 같은 MMP 활성화 에이전트는 젤의 치료 또한 앞에서 설명한18으로 약한 신호를 향상 사용할 수 있습니다.
생물학 학문을 위한 효소 활동의 측정 뿐만 아니라 효소 분해 펩 티 드 또한 종종 조직 공학, 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 가교 합성 hydrogels 사용 됩니다. 제어 저하는 이러한 응용 프로그램에 대 한 중요 합니다. 현재, 이러한 펩 티이 드의 저하 속도 론 단일, 정제 효소를 사용 하 여 특징입니다. 그러나, 세포는 실제로 생산 하 고 이러한 펩 티이 드의 분열에 대 한 책임은 어떤 효소를 결정 어려운 결정 되었습니다. 세포 및 조직 관련 효소 출시 계량 펩 티 드 zymography 사용 하 여 이러한 펩타이드 가교 시퀀스의 합리적인 디자인에 크게 도움이 됩니다.
저자는 공개 없다.
자금에 오하이오 주립 대학 대학의 공학, 생명 공학 부, 그리고 종합 암 센터-아서 G. 제임스 암 병원과 리처드 J. Solove 연구소에 의해 제공.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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