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Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.
Der Zweck dieser Methode ist es, die proteolytische Aktivität von komplexen biologischen Proben zu messen. Die Proben werden durch Molekulargewicht mit Elektrophorese durch eine Lösung von Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Diese Methode unterscheidet sich von traditionellen Gel Zymography, dass eine abgeschreckt Fluorogenic Peptid in der Lösung von Gel statt voller Länge Proteine, wie Gelatine oder Kasein kovalent eingearbeitet ist. Verwendung der Fluorogenic Peptide ermöglicht direkte Nachweis der proteolytischen Aktivität ohne zusätzliche Färbung Schritte. Enzyme in den biologischen Proben cleave das abgeschreckt Fluorogenic Peptid, was zu einem Anstieg in Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal in die Gele ist dann mit einem standard Leuchtstofflampen Gel Scanner abgebildet und quantifiziert mit Densitometrie. Die Verwendung von Peptiden als abbaubare Substrat erweitert erheblich die möglichen Proteasen nachweisbar mit Zymographic Techniken.
Gel Zymography ist ein biologischer Verfahren zur Messung der proteolytischen Aktivität in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten oder Zelle Nährmedien1,2,3. Die Proben werden durch ihre Molmassen mit Elektrophorese durch ein Polyacrylamid-Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Gemeinsamen abbaubaren Substrate enthalten Gelatine, Kasein, Kollagen und Elastin, die verwendet wurden, um die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) -1,-2-3, -7,-8,-9 und-11, neben einer Vielzahl von Cathepsins1,2 messen , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. nach Elektrophorese, die Enzyme sind renaturierte und durfte um das Protein innerhalb des Gels zu degradieren. In traditionellen Gel Zymography das Gel wird mit einem Protein-Farbstoff, z. B. Coomassie Blau gefärbt und Protease-Aktivität wird als Verlust des Signals, d. h. weiße Bänder (Abbau von Protein) auf einem dunkelblauen Hintergrund erkannt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine alternative Methode der Gel Zymography, in dem das abbaubare Substrat kurzer Fluorogenic Peptid kovalent in das Polyacrylamid-Gel (Abbildung 1) integriert ist. Die Substitution von synthetische Peptide als abbaubare Substrate ermöglicht eine Erfassung von einer breiteren Palette von Proteasen im Vergleich zu traditionellen Gel Zymography mit native Proteine9. Kovalente Bindung des Peptids Fluorogenic verhindert Peptid Verbreitung und Migration während der Gelelektrophorese mit bisherigen Methoden9,10beobachtet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Substrates Fluorogenic direkte Nachweis der Protease-Aktivität ohne zusätzliche Färbung und de-Färbung Schritte. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Erkennung von Protease-Aktivität in biologischen Proben über die kovalente Einbeziehung Fluorogenic Peptide in Zymogram Gele.
1. Vorbereitung der Lösung von Gelschicht
2. Vorbereitung des Moleküls Azido-PEG3-Maleimide-Linker
3. Vorbereitung des Peptids Gelschicht zu lösen
4. Vorbereitung des stapelnden Gels
5. Vorbereitung des biologischen Proben für Elektrophorese
6. Elektrophorese von biologischen Proben in Peptid Zymography Gele
7. Darstellung der Peptid-Zymography Gele
Mit der beschriebenen Methode hier, zwei fluoreszierende Protease-abbaubar Peptide flossen in Polyacrylamid-Gele: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abgekürzt als QGIW in den Text und Zahlen) und GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abgekürzt als LACW im gesamten Text und Zahlen). ↓ gibt die Site der Spaltung. QGIW ist ein Kollagen-ich abgeleitet Sequenz entwickelt, um zelluläre Collagenases14erkennen. LACW ist eine Sequenz, die für die Erkennung von MMP-14 und MMP-1115optimiert wurde. Die Peptide sind gekennzeichnet mit Dabcyl (Löscher) und Fluorescein (Fluorophor) mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) - Ester - Amin Chemie11. Es kann schwierig sein, neue Fluorogenic Peptide zu entwickeln, die haben ausreichende Fluoreszenzlöschung und sind in standard-Puffer löslich. Daher ist die Anpassung der Peptid-Sequenzen aus handelsüblichen Leuchtstoffröhren Protease Substraten eine C-terminal-Cystein enthalten oft eine erfolgreiche Strategie, neue Fluorogenic Sensoren zu entwickeln. Um die Fähigkeit der Peptid-Zymography, komplexen Protease Mischungen zu trennen zu demonstrieren, wurde konditionierte Medien aus zwei verschiedenen Krebszelllinien gesammelt. HT1080 Fibrosarkom und MDA-MB-231 Brust Adenokarzinom Zellen wurden in 10 % FBS Medien für 24 Stunden, vergoldete danach die Medien mit serumfreie Medien für weitere 24 Stunden ersetzt wurde. Konditionierte Medien Proben wurden gesammelt und konzentriert mit 10 kDa Molekulargewicht cutoff-zentrifugale Filtereinheiten. Der Proteingehalt der Medien wurde mit einem standard µBCA-Assay gemessen. 30 µg Protein von konditionierten Medien waren electrophoresed. Als Positivkontrollen, Brunnen mit Typ ich bakterielle Kollagenase (100 µg) oder gereinigt, aktiviert MMP-9 (125 ng) wurden ebenfalls enthalten. Die Gele wurden für 24 h bei der Entwicklung von Puffer erlauben MMP Spaltung der abbaubaren Substrate innerhalb der Gele (Abbildung 2) inkubiert und dann ein Image erstellt. Fluoreszenz-Bildgebung ergab, dass zahlreiche Bands innerhalb der LACW Peptid Gele (Abbildung 2A14), sichtbar waren, während nur ein einzelnes Band innerhalb QGIW Gele (Abb. 2D14) erkennbar war. Im Vergleich zu Gelatine Zymography (Abbildung 2-14) konnten LACW Gele mehr proteolytischen Bands, demonstriert die Fähigkeit der Peptid-Zymography, ein breiteres Spektrum von Proteasen in biologischen Proben als erkennen erkennen traditionelle Methoden mit nativen Substraten.
Um die Identität des visualisierten Bands wie MMPs Peptid Zymography Gele in Entwicklung-Puffer mit entweder 20 µM inkubiert wurden GM6001, ein Ausgedehntspektrum MMP-Hemmer oder 10 µM E-64, eine allgemeine Cathepsin-Inhibitor. Behandlung des Peptids LACW Gele mit GM6001 (Abb. 2 b14) verringert die Intensität der Banden, während der Behandlung mit E-64 (Abbildung 2-14) keine erkennbare Wirkung hatte. Behandlung der QGIW Peptid Gele mit GM6001 führte zu kompletten Ablation der zuvor gesehene Bands (2E Abbildung14). Wie erwartet, E-64 (Abbildung 2F14) wirken sich nicht. In den beiden Peptid-Gelen GM6001 gehemmt gereinigt MMP-9 Aktivität aber nicht auf bakterielle Kollagenase-Aktivität, weiter zu überprüfen, dass die visualisierte Zunahme der Fluoreszenz ein Resultat der proteolytischen Aktivität von MMPs in die geprüfte biologische Proben.
Um die Empfindlichkeit des Peptid-Zymography zum aktuellen Goldstandard, Gelatine Zymography vergleichen wurde eine Sensitivitätsanalyse durchgeführt mit gereinigtem, aktivierte MMP-9. Verdünnungsreihen von MMP-9 (1-250 ng) wurden in den LACW, QGIW und Gelatine Zymography Gelen (Abbildung 3A14) electrophoresed. Nach Entwicklung und Fluoreszenz-Bildgebung Band Intensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert und Grundstücke normalisierte Band Intensität wurden erzeugt, um EG50 Werte der Konzentration zu berechnen, die 50 % der maximalen Signal (Abb. 3 b produziert 14). LACW Peptid Gele waren in der Lage zu erkennen, die kleinste Konzentrationen von MMP-9 EG50 Wert von 17,28 ng, im Vergleich zu QGIW und Gelatine Zymogramme mit Werten von 59.50 ng und 31,85 ng, beziehungsweise. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung von Peptid-Zymography kann entsprechen oder die Sensitivitätslimite von nativen Substraten wie Gelatine übertreffen.
Abbildung 1: Schematische des fluoreszierenden Peptid-Zymography-Prozesses. (A) Vorbereitung der Multi-Layer Polyacrylamid-Gel zu lösen. Standard 10 % Lösung von Gel-Lösung wird verwendet, um die erste Schicht der Peptid-Zymography-Gel zu bilden. Eine zweite Lösung 10 % gel-Layer mit einem abgeschreckt, fluoreszierende Peptid und ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül wird dann auf die erste Schicht polymerisiert. Die endgültige Deckschicht ist ein 5 % Stapeln Gel. (B) Standard Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen dient zum Trennen von Protease-haltigen Proben in die funktionalisierten Polyacrylamid-Gele. Die Gele sind SDS zu entfernen und damit die Proteine zur Renaturierung gewaschen. Die Gele werden dann in einem Entwicklung-Puffer für 24 h bei 37 ° C, so dass die Proteasen, die Fluorogenic Peptide, wodurch erhöhte Fluoreszenz Spalten inkubiert. Diese Fluoreszenz, Korrespondenz mit Protease-Aktivität ist dann eingefangen mit einer fluoreszierenden Gel-Imager auf eine Anregung von 488 nm und Emission von 521 nm (Adapted mit freundlicher Genehmigung von Biotechniques und Zukunft der Wissenschaft14). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Erkennung der Zelle sezerniert Proteasen in menschlichen Krebszelllinien. Analyse der Kollagenase Enzym (100 µg), MMP-9 (125 ng) und konditioniert Zelle Medien von HT1080 Fibrosarkom (30 µg) und MDA-MB-231 Adenokarzinom (30 µg) Brustkrebszelllinien in LACW und QGIW-Peptid-Gele. Gele wurden behandelt mit DMSO (Fahrzeugkontrolle) (A & D), mit GM6001 (B & E) behandelt oder mit E-64 (C & F)behandelt. (G) Gelatine Zymogram HT1080 und MDA-MB-231 bedingt Zelle Medien (Adapted mit freundlicher Genehmigung von Biotechniques und Zukunft der Wissenschaft14). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vergleich der MMP-9 Empfindlichkeit des Peptid und Gelatine Zymogramme. (A) QGIW (oben), LACW (Mitte) und Gelatine (unten) Zymography Gele wurden serielle Verdünnungen von MMP-9 unterzogen. (B) normalisierte Band Intensitäten wurden aufgetragen gegen MMP-9 Konzentration und passen zu einer vier Parameter-Variable Steigung-Kurve. EG50 Werte zeigen eine Konzentration auf die Hälfte der maximalen Signal. Ergebnisse werden dargestellt als n = 3, meine SD (Adapted mit freundlicher Genehmigung von Biotechniques und Zukunft der Wissenschaft14). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Gel zu lösen | ||||
Lager Konz. | Endgültige Konz. | 5 Gele | 10 Gele | |
Acrylamid/Bis-Acrylamid (19:1) | 40 % | 10 % | 10 mL | 20 mL |
Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0,375 M | 15 mL | 30 mL |
Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) | 20 % | 0,10 % | 200 ΜL | 400 ΜL |
Entionisiertem H2O | -- | -- | 14,4 mL | 28,7 mL |
TEMED | -- | -- | 40 ΜL | 80 ΜL |
APS | 10 % | 0,10 % | 400 ΜL | 800 ΜL |
Gesamtvolumen | 40 mL | 80 mL | ||
Peptid-Lösung von Gel | ||||
Lager Konz. | Endgültige Konz. | 5 Gele | 10 Gele | |
Acrylamid/Bis-Acrylamid (19:1) | 40 % | 10 % | 5 mL | 10 mL |
Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0,375 M | 7,5 mL | 15 mL |
Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) | 20 % | 0,10 % | 100 ΜL | 200 ΜL |
Entionisiertem H2O | -- | -- | 6.5 ΜL | 13 mL |
Fluoreszierende Peptid | 10 mM | 75 ΜM | 150 ΜL | 300 ΜL |
Azido-PEG3-Maleimide-Vernetzer | 75 mM | 1,5 mM | 400 ΜL | 800 ΜL |
TEMED | -- | -- | 20 ΜL | 40 uL |
APS | 10 | 0,10 % | 200 ΜL | 400 ΜL |
Gesamtvolumen | 20 mL | 40 mL | ||
Stapeln von Gel | ||||
Lager Konz. | Endgültige Konz. | 5 Gele | 10 Gele | |
Acrylamid/Bis-Acrylamid (19:1) | 40 % | 5 % | 2,5 mL | 5 mL |
Tris-HCl pH 6,9 | 1 M | 0,125 M | 2,5 mL | 5 mL |
Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) | 20 % | 0,10 % | 100 ΜL | 200 ΜL |
Entionisiertem H2O | -- | -- | 14,75 mL | 29,5 mL |
TEMED | -- | -- | 50 ΜL | 100 ΜL |
APS | 10 % | 0,10 % | 100 ΜL | 200 ΜL |
Gesamtvolumen | 20 mL | 40 mL |
Tabelle 1: Reagenz-Tabelle für die Zubereitung von fluoreszierenden Peptid Zymography Gele. Konzentrationen und Mengen für die Herstellung von mehrschichtigen Peptid Zymography Gel.
Aktuelle Zymographic Techniken beruhen auf dem Einbau von nativen Substraten in Polyacrylamid-Gele für den Nachweis der Proteolyse. Während diese Techniken weit verbreiteten Einsatz angesammelt haben, werden sie noch in der Anzahl der Proteasen beschränkt, die Sie erkennen können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, in welche Leuchtstofflampen, Protease-abbaubar Peptide in der Polyacrylamid-Gel zu lösen integriert sind. Kovalente Kupplung mit ermöglicht ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül die Trennung und Nachweis von einer größeren Vielfalt von Proteasen als derzeit mit nativen Substraten erreichbar ist. Hoch abstimmbaren Artder fluoreszierende Peptide bietet Forscher die Möglichkeit, Substrate zu entwerfen, die ihre Proteasen Interesse ausrichten können. Zahlreiche Peptid Substrate wurden für eine Vielzahl von Proteasen Peptid Bibliotheken verwenden, und es gibt eine wachsende Anzahl von kommerziellen Quellen, die Herstellung von kundenspezifischen Peptide. Es kann schwierig sein, neue Fluorogenic Peptide zu entwickeln, die haben ausreichende Fluoreszenzlöschung und sind in standard-Puffer löslich. Anpassung Peptid Sequenzen aus kommerziell verfügbare fluoreszierende Protease Substrate zu einer C-terminalen Cystein enthalten deshalb oft eine erfolgreiche Strategie, neue Fluorogenic Sensoren zu entwickeln.
Beim Ausfüllen dieses Protokolls, sollte darauf geachtet werden beim Umgang mit fluoreszierenden Peptid Gele, übermäßiger Lichteinwirkung zu verhindern, da dies erkannten Fluoreszenzsignal deutlich reduzieren kann. Darüber hinaus ist die aktuelle Konzentration von Peptid in jedes Gel verwendet 75 µM. Dies kann eingestellt werden, um niedrigere Konzentrationen, Peptid, unter Berücksichtigung, dass die Azido-PEG3-Maleimide-Lösung in mindestens 20 molaren Lösung hinzugefügt werden muss überschüssiges den Peptid zu sparen. Das Azido-PEG3-Maleimide-Kit erhältlich in 3 Größen (25, 100 und 1000 mg). Die Autoren empfehlen die 25 mg-Kit kaufen, da die fertige Lösung nur bei kurzen Zeiträume bei-20 ° c gelagert werden können Darüber hinaus genügt eine Kit 25 mg 10 Peptid Gele vorzubereiten, die innerhalb von 3 Wochen der Vorbereitung verwendet werden muss.
Eine Einschränkung des Zymography ist die Schwierigkeit die genaue Identität der visualisierten Protease Bands durch erhebliche Überschneidungen in Molekulargewichte zu erkennen. In Zukunft werden es Studien, wichtige sekundäre Analysen um ihre Identität mit Techniken wie Massenspektrometrie16,17zu bestimmen. Eine weitere Einschränkung der Zymography ist die Umfaltung von Proteinen zu ihren aktiven Konformation nach teilweisen Denaturierung von SDS und Elektrophorese. Diese Prozesse können eine Änderung in der aktiven Konformation der Protease, Rendern proteolytisch inaktive Proteine, aktive verursachen. Z. B. Pro-MMP-2 in Gelatine-Zymogramme trotz des Habens der hemmenden pro-Domänen intakten Due nachweisbar zu seiner Renaturierung, eine Zwischenform aktiv. Ergänzende Methoden wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) oder Western Blots kann verwendet werden, um die Identität und die totale Präsenz eine Protease von Interesse zu bestimmen.
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von fluoreszierenden Peptid Substrate für die Verbesserung der Empfindlichkeit des aktuellen Zymographic Techniken. Mit gereinigten MMP-9, wurde ein Konzentrationsgradient durchgeführt LACW, QGIW und Gelatine Zymography Gele zu vergleichen. Derzeit ist Gelatine Zymography Gold-Standard-Technik, die Gelatinases (MMP-2 und-9) in biologischen Proben erkannt werden. Vergleicht man die EG-50 -Werte der drei Substrate, hatte LACW Peptid Gele die niedrigsten Werte angibt die höchste Empfindlichkeit. Unter Verwendung verschiedener Peptid-Sequenzen zur Erkennung von spezifischen Proteasen kann möglicherweise diese Empfindlichkeiten noch weiter verbessern. Behandlung der Gele mit MMP aktivierende Vermittler wie 4-Aminophenylmercuric-Acetat (APMA) oder Heparin kann auch verwendet werden, um ein schwaches Signal als zuvor beschriebenen18zu steigern.
Neben der Messung der Protease-Aktivität für biologische Studien dienen Protease-abbaubar Peptide auch oft Vernetzung synthetischen Hydrogelen für Gewebe-Engineering und Arzneimittel-Lieferung-Applikationen. Kontrollierten Abbau ist von entscheidender Bedeutung für diese Anwendungen. Derzeit die Abbau-Kinetik dieser Peptide zeichnen sich mit einzelnen, gereinigten Enzyme. Bestimmen, welche Enzyme Zellen tatsächlich produzieren und sind verantwortlich für die Spaltung dieser Peptide ist jedoch schwierig zu bestimmen gewesen. Die Verwendung von Peptid-Zymography, Zelle und Gewebe-spezifische Enzymfreisetzung quantifizieren wird stark in die rationale Gestaltung dieser Peptid-Vernetzung-Sequenzen unterstützen.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Gefördert von der Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering-Abteilung und dem Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital und Richard J. Solove Research Institute.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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