Method Article
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.
מטרת שיטה זו היא למדוד את הפעילות הפרוטאוליטי של דגימות ביולוגיות מורכבות. הדגימות מופרדים באמצעות משקל מולקולרי באמצעות אלקטרופורזה באמצעות ג'ל פתרון מוטבע עם מצע מתכלה. שיטה זו שונה zymography ג'ל מסורתיות בכך fluorogenic מתרצה פפטיד הוא שולב covalently הג'ל פתרון במקום חלבונים באורך מלא, כגון ג'לטין או קזאין. השימוש פפטידים fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות הפרוטאוליטי ללא שלבים נוספים מוכתמים. אנזימים בתוך דגימות ביולוגיות קליב פפטיד fluorogenic מתרצה, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה. האות פלורסנט, ג'לים ולאחר מכן עם תמונה עם סורק ג'ל פלורסנט רגיל, לכמת באמצעות densitometry. השימוש של פפטידים המצע מתכלה מאוד מרחיבה של פרוטאזות אפשרי לזיהוי בטכניקות zymographic.
ג'ל zymography היא טכניקה ביולוגי למדידת פעילות הפרוטאוליטי בתוך דגימות ביולוגיות, כגון נוזלי הגוף או תא תרבות המדיה1,2,3. הדגימות מופרדים באמצעות משקולות מולקולרית שלהם עם אלקטרופורזה באמצעות ג'ל לזיהוי מוטבע עם מצע מתכלה. מצעים מתכלה נפוצים כוללים ג'לטין, קזאין, קולגן ואלסטין, אשר שימשו כדי למדוד את הפעילות של מטריקס metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7, -8,-9 ו-11, בנוסף למגוון cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. לאחר אלקטרופורזה, האנזימים renatured הינם מותרות כדי להשפיל את החלבון בתוך הג'ל. Zymography ג'ל מסורתיים, הג'ל הוא מוכתם צבע חלבון, כגון כחול Coomassie, ולאחר פעילות פרוטאז מתגלה כמו איבוד אות, קרי, לבנים להקות (השפלה של חלבון) על רקע כחול כהה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שיטה חלופית zymography ג'ל, שבו המצע מתכלה הוא קצר, פפטיד fluorogenic covalently שולבו הג'ל לזיהוי (איור 1). ההחלפה של peptides סינתטי בשם דיאלקטריים מתכלה מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות לעומת zymography ג'ל מסורתי עם חלבונים מקורית9. להצמדת קוולנטיות פפטיד fluorogenic מונע פעפוע פפטיד והעברה במהלך בג'ל נצפתה עם שיטות קודמות9,10. יתר על כן, השימוש של מצע fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות פרוטאז מבלי להכתים נוספים וצעדים מבטל את ההגדלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא הגילוי של פעילות פרוטאז דגימות ביולוגיות באמצעות שיתוף קוולנטיות פפטידים fluorogenic zymogram ג'ל.
1. הכנת שכבת ג'ל פתרון
2. הכנת המולקולה מקשר Azido-PEG3-maleimide
3. הכנת פפטיד לפתרון שכבת ג'ל
4. הכנה של הג'ל הערימה
5. הכנה של דגימות ביולוגיות אלקטרופורזה
6. אלקטרופורזה של הביולוגיה דוגמאות בפפטיד Zymography ג'ל
7. הדמיה של פפטיד Zymography ג ' לים
באמצעות השיטה המתוארת כאן, שני ניאון פפטידים פרוטאז-מתכלים אוחדו ג'לים לזיהוי: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (באופן מקוצר כ- QGIW לאורך הטקסט ואת המספרים) ו GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (באופן מקוצר כ- LACW לאורך הטקסט ואת המספרים). ↓ מציין האתר של המחשוף. QGIW הוא קולגן-אני נגזר רצף תוכננה לאתר collagenases הסלולר14. LACW הוא רצף מוטבה איתור MMP-14 ו- MMP-1115. פפטידים מסומנות עם dabcyl (כ'חטיף), fluorescein (fluorophore) באמצעות N-hydroxysuccinimide (NHS) - אסתר - הודיה עמר כימיה11. זה יכול להיות קשה לפתח פפטידים fluorogenic החדש יש קרינה פלואורסצנטית נאותה שכבתה והם מסיסים במאגרי סטנדרטי. לכן, התאמת פפטיד רצפים של סובסטרטים פרוטאז פלורסנט זמינים מסחרית כדי לכלול ציסטאין מסוף של C מהווה לעיתים קרובות כאסטרטגיה מוצלחת לפתח חיישנים fluorogenic חדש. להפגין את היכולת של פפטיד zymography להפרדת תערובות מורכבים פרוטאז, מדיה ממוזגים נאסף מתוך שתי שורות תאים סרטן שונים. HT1080 fibrosarcoma תאים ותאים אדנוקרצינומה של השד מד א-MB-231 מצופים בתקשורת FBS 10% במשך 24 שעות, לאחר מכן הוחלף התקשורת עם מדיה ללא סרום 24 שעות נוספות. מדיה ממוזגים דגימות נאספו, מרוכז באמצעות 10 יחידות סינון צנטריפוגלי הקיצוץ של משקל מולקולרי kDa. תכולת החלבון של המדיה נמדדה שימוש assay µBCA רגיל. 30 µg של חלבון ממדיה ממוזגים היו electrophoresed. כפקדי חיובית, בארות עם סוג אני collagenase חיידקי (100 µg) או מטוהרים, מופעל MMP-9 (125 ng) בנוסף נכללו. ג'לים הדגירה במשך 24 שעות ביממה בפיתוח מאגר כדי לאפשר MMP המחשוף סובסטרטים מתכלה בתוך ג'ל (איור 2), ואז עם תמונה. הדמיה פלורסנט חשף שלהקות רבות היו גלוי בתוך ג'ל פפטיד LACW (איור 2 א14), בעוד רק להקה אחת היה ברור בתוך QGIW ג'ל (2D איור14). בהשוואה zymography ג'לטין (איור 2G14), ג'לים LACW היו מסוגלים לזהות עוד להקות הפרוטאוליטי, הוכחת היכולת של פפטיד zymography לאתר מגוון רחב יותר של פרוטאזות מתנה בתוך דגימות ביולוגיות יותר שיטות מסורתיות באמצעות סובסטרטים מקורית.
כדי לוודא את הזהות של הלהקות מטמיעים כמו MMPs, ג'לים zymography פפטיד היו מודגרות פיתוח מאגר המכיל גם 20 מיקרומטר GM6001, מעכב MMP ותתנו לו, או 10 מיקרומטר E-64, מעכב cathepsin כללי. טיפול של פפטיד LACW ג ' לים עם GM6001 (2B איור14) ירד האינטנסיביות של הלהקות, בזמן הטיפול עם E-64 (2C איור14) הייתה השפעה ניכרת. טיפול של ג'לים פפטיד QGIW עם GM6001 הביא אבלציה מלאה הלהקות בעבר ראינו (2E איור14). כצפוי, E-64 לא הייתה כל השפעה (2F איור14). ב שני ג'לים פפטיד, GM6001 עכבות מטוהר. הפעילות MMP-9 אך לא השפיע על פעילות collagenase חיידקי, עוד יותר מאמת כי העלייה מטמיעים פלורסצנטיות היה תוצאה של פעילות הפרוטאוליטי על-ידי MMPs מתנה בתוך התחום הביולוגי שנבדקו דוגמאות.
כדי להשוות את רמת הרגישות של פפטיד zymography כדי תקן הזהב הנוכחי, zymography ג'לטין, ניתוח רגישות נערך באמצעות מטוהרים, מופעל MMP-9. דילולים טורי של MMP-9 (1-250 ng) היו electrophoresed ב ג'לים zymography LACW, QGIW, ג'לטין (איור 3 א14). בעקבות פיתוח והדמיה פלורסנט, עוצמות הלהקה היו לכמתו ImageJ, חלקות בעוצמה הלהקה מנורמל נוצרו כדי לחשב EC50 ריכוז ערכים-המייצרת 50% של האות המרבי (איור 3B 14). LACW פפטיד ג'לים הצליחו לזהות את הקטן ריכוזי MMP-9, שערכו50 EC 17.28 ng, לעומת zymograms QGIW ואת הג'לטין עם ערכים של 59.50 ng ו 31.85 ng, בהתאמה. נתונים אלה מציינים כי השימוש של פפטיד zymography יכול להתאים או לחרוג ממגבלות רגישות יליד סובסטרטים כמו ג'לטין.
איור 1: סכמטי של תהליך zymography ניאון פפטידים. (א) הכנת לזיהוי שכבתיים לפתרון ג'ל. תקן 10% פתרון פתרון ג'ל משמש כדי ליצור את השכבה הראשונה של הג'ל zymography פפטיד. לפתרון השני 10% ג'ל בשכבה הכוללת פפטיד מתרצה, פלורסנט, מולקולה מקשר azido-PEG3-maleimide הוא polymerized אז על גבי השכבה הראשונה. השכבה העליונה הסופי הוא 5% ג'ל הערימה. אלקטרופורזה סטנדרטי (B) מתחת ללא הפחתת התנאים משמש כדי להפריד פרוטאז המכילים דוגמאות ג'לים לזיהוי functionalized. ג'לים נשטפים להסיר מרחביות ולאפשר את החלבונים כדי renature. ג'לים מודגרת ואז במאגר פיתוח במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס, ומאפשר פרוטאזות לבקע את פפטידים fluorogenic, וכתוצאה מכך פלורסצנטיות מוגברת. זו קרינה פלואורסצנטית, המתאים עם פעילות פרוטאז, ואז נתפס באמצעות imager ג'ל פלורסנט של עירור של 488 ננומטר, פליטה של 521 nm (Adapted באישור Biotechniques ומדע העתיד14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זיהוי של פרוטאזות מופרש תא בשורות תאים סרטניים אנושיים. ניתוח של אנזים collagenase (100 µg), MMP-9 (125 ng) ושמת תא מדיה HT1080 fibrosarcoma (30 µg), מד א-MB-231 אדנוקרצינומה השד סרטן (30 µg) שורות תאים בג'לים פפטיד LACW ו- QGIW. ג'לים היו שטופלו דימתיל סולפוקסיד (בקרת הרכב) (A & D), מטופלים עם GM6001 (B & E) או מטופלים עם E-64 (C & F). (גרם) ג'לטין zymogram של HT1080, מד א-MB-231 ממוזגים תא מדיה (Adapted באישור Biotechniques ומדע העתיד14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השוואה של MMP-9 רגישות של פפטיד, ג'לטין Zymograms. (א) QGIW (למעלה), LACW (באמצע), ג'לטין (למטה) zymography ג'לים היו נענשים דילולים טורי של MMP-9. (B) Normalized הלהקה עוצמות היו לעומת ריכוז MMP-9 ובכושר לעקומה שיפוע משתנה של פרמטר ארבע. EC50 ערכים עולה ריכוז-חצי האות המרבי. תוצאות מיוצגים בתור n = 3, כלומר SD (Adapted באישור Biotechniques ומדע העתיד14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פתרון ג'ל | ||||
מניות conc. | סופי conc. | 5 ג'לים | ג'לים 10 | |
אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (19:1) | 40% | 10% | 10 מ | 20 מ |
טריס-HCl pH 8.7 | 1 מ' | ז 0.375 | 15 מ | 30 מ |
Dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) | 20% | 0.10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
H יונים2O | -- | -- | 14.4 מ | 28.7 mL |
TEMED | -- | -- | 40 ΜL | 80 ΜL |
APS | 10% | 0.10% | 400 ΜL | 800 ΜL |
הנפח הכולל | 40 מ | 80 מ | ||
ג'ל פתרון פפטיד | ||||
מניות conc. | סופי conc. | 5 ג'לים | ג'לים 10 | |
אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (19:1) | 40% | 10% | 5 מ | 10 מ |
טריס-HCl pH 8.7 | 1 מ' | ז 0.375 | 7.5 mL | 15 מ |
Dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) | 20% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
H יונים2O | -- | -- | 6.5 ΜL | 13 mL |
פפטיד פלורסנט | 10 מ מ | מיקרומטר 75 | 150 ΜL | 300 ΜL |
Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker | 75 מ מ | 1.5 מ מ | 400 ΜL | 800 ΜL |
TEMED | -- | -- | 20 ΜL | 40 uL |
APS | 10 | 0.10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
הנפח הכולל | 20 מ | 40 מ | ||
ג'ל הערימה | ||||
מניות conc. | סופי conc. | 5 ג'לים | ג'לים 10 | |
אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (19:1) | 40% | 5% | 2.5 מ | 5 מ |
טריס-HCl pH 6.9 | 1 מ' | 0.125 מ' | 2.5 מ | 5 מ |
Dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) | 20% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
H יונים2O | -- | -- | 14.75 mL | 29.5 מ |
TEMED | -- | -- | 50 ΜL | 100 ΜL |
APS | 10% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
הנפח הכולל | 20 מ | 40 מ |
טבלה 1: ריאגנט טבלה עבור הכנת ניאון פפטידים ג'לים zymography. ריכוזי ואמצעי אחסון עבור הכנת הג'ל zymography פפטיד רב-שכבתית.
טכניקות zymographic הנוכחיים מסתמכים על שילוב של סובסטרטים יליד לתוך לזיהוי ג'לים איתור proteolysis. ואילו טכניקות אלה משכו השימוש הנרחב, הם עדיין מוגבלים במספר של פרוטאזות שהם יכולים לזהות. . הנה, פרוטוקול תוארה בפפטידים פלורסנט, פרוטאז-מתכלים אשר משולבים של לזיהוי פתרון ג'ל. קוולנטיות צימוד באמצעות מולקולה מקשר azido-PEG3-maleimide מאפשר את הפרדה וזיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות יותר הוא כיום השגה עם מצעים מקורית. הטבע מאוד tunable של ניאון פפטידים מעניק חוקרים את היכולת לעצב סובסטרטים שיכולות היעד שלהם פרוטאזות עניין. מצעים פפטיד רבים זוהו עבור מגוון רחב של פרוטאזות באמצעות מעבדות, יש מספר גדל והולך של מקורות מסחריים לייצור פפטידים מותאם אישית. זה יכול להיות קשה לפתח פפטידים fluorogenic החדש יש קרינה פלואורסצנטית נאותה שכבתה והם מסיסים במאגרי סטנדרטי. לכן, התאמת פפטיד רצפים של מסחרית זמינים פרוטאז פלורסנט סובסטרטים לכלול של ציסטאין C-מסוף מהווה לעיתים קרובות כאסטרטגיה מוצלחת לפתח חיישנים fluorogenic חדש.
במהלך השלמת פרוטוקול זה, צריך לקחת טיפול לטיפול ניאון פפטידים ג'לים כדי למנוע חשיפה מוגזמת לשמש אור כמו זה יכול להפחית באופן משמעותי את האות פלורסנט שזוהו. בנוסף, הריכוז הנוכחי של פפטיד בשימוש כל ג'ל הוא 75 מיקרומטר. זה יכול להיות מותאם להורדת ריכוזי לשמר פפטיד, במחשבה כי הפתרון azido-PEG3-maleimide יש להוסיף את הפתרון ב פחות שן טוחנת 20 עודף פפטיד. ניתן לרכוש ערכת azido-PEG3-maleimide בשלושה גדלים שונים (25, 100, 1000 מ ג). המחברים ממליצים בחום על רכישת ערכת 25 מ ג כמו הפתרון מוכן רק ניתן לאחסן על תקופות קצרות של זמן ב-20 ° C. יתר על כן, ערכה 25 מ ג מספיקה להכין 10 ג'ל פפטיד, אשר חייב לשמש בתוך 3 שבועות של הכנה.
אחת המגבלות של zymography היא הקושי אניני טעם את זהותו המדויק של להקות פרוטאז מטמיעים בשל חפיפה משמעותי במולקולרית משקולות. בעתיד מחקרים, זה יהיה קריטי לערוך ניתוח משני כדי לקבוע את זהותם באמצעות טכניקות כגון ספקטרומטר מסה16,17. מגבלה נוספת של zymography הוא refolding של חלבונים כדי שלהם קונפורמציה פעיל בעקבות denaturing חלקית על ידי מרחביות ו אלקטרופורזה. תהליכים אלו יכולים לגרום לשינוי קונפורמציה פעיל הפרוטאז, עיבוד חלבונים proteolytically אינו פעיל, פעיל. לדוגמה, ניתן לזהות pro-MMP-2 ג'לטין zymograms למרות שיש יעד שלמים מעכבות את הפרו-התחום כדי renaturation שלו אל הטופס הפעיל בינוני. שיטות משלימים כמו מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) או ווסטרן שמחק יכול לשמש כדי לקבוע את זהותו ואת נוכחות הכולל של פרוטאז עניין.
מאמר זה מדגים את השימוש ניאון פפטידים סובסטרטים לשיפור הרגישות של טכניקות zymographic הנוכחית. באמצעות מטוהרים MMP-9, ניתוח ריכוז הדרגתי נערכה השוואת ג'לים zymography LACW, QGIW, ג'לטין. כיום, zymography ג'לטין הוא הטכניקה תקן הזהב שבו gelatinases (MMP-2 ו-9) מזוהים בדגימות ביולוגיות. השוואת הערכים50 EC של סובסטרטים שלושה, ג'לים פפטיד LACW היו הערכים הנמוכים ביותר, המציין את הרגישות הגבוהה ביותר. ניצול רצפי פפטיד שונים המיועדים גילוי של פרוטאזות ספציפי יכול לשפר באופן פוטנציאלי רגישויות אלה עוד יותר. טיפול היחסי של ג'ל עם סוכן הפעלת MMP כגון אצטט 4-aminophenylmercuric (APMA) או הפארין יכול לשמש גם כדי להגביר את האות חלש כפי שתואר לעיל18.
בנוסף המדד של פרוטאז פעילות עבור מחקרים ביולוגיים, פפטידים פרוטאז-מתכלים משמשים גם לעתים קרובות crosslinking hydrogels סינתטי עבור הנדסת רקמות ויישומי משלוח סמים. השפלה מבוקר הוא קריטי עבור יישומים אלה. נכון לעכשיו, ההשפלה קינטיקה של פפטידים אלה מאופיינים באמצעות אנזימים יחיד, מטוהרים. עם זאת, קביעה אילו אנזימים תאים למעשה לייצר והם אחראים על המחשוף של פפטידים אלה כבר קשה לקבוע. השימוש zymography פפטיד לכמת התא ואת שחרור רקמות ספציפיות אנזים יסייעו במידה רבה בעיצוב רציונלית של רצפי crosslinking אלה פפטיד.
המחברים אין לחשוף.
מימון מסופקים על ידי אוהיו סטייט אוניברסיטת להנדסה, המחלקה להנדסה ביו-רפואית של מקיף במרכז לחקר הסרטן - ארתור ג ג'יימס סרטן החולים ו ריצ'רד ג' Solove מכון מחקר.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved