병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

병 변 및 전극 위치 확인은 전통적으로 통해 조직학 검사 스테인드 뇌 조각의 수동 추정을 요구 하는 시간이 걸리는 절차 다. 여기, 우리는 장애를 측정 하 고 덜 힘 드는 이며 더 자세한 결과 뇌의 전극 위치에 대 한 간단 하 고, 간단한 방법을 설명 합니다. 전체 두뇌 오스뮴 tetroxide 물, 수 지에 포함 되며 마이크로 CT 스캐너로 촬영. 검사 결과 해상도와 가상 섹션 두께 샘플 크기에 따라 두뇌의 3D 디지털 볼륨 (쥐와 얼룩말 피리 새 류 대 한 복 당 12-15와 5-6 µ m 머리, 각각). 표면과 깊은 병 변 특징 하실 수 있습니다 및 단일 tetrodes, tetrode 배열, 전해질 장애, 그리고 실리콘 프로브도 지역화할 수 있습니다. 무료 및 독점 소프트웨어는 수동 또는 자동으로 모든 비행기와 세그먼트 볼륨에서 샘플 볼륨을 검사 하는 경험이 있습니다. 이 방법은 뇌 볼륨을 생성 하기 때문에 병 변 및 전극 비교 시간과 연구에 걸쳐 표준화 하는 데 도움이 됩니다 현재 방법에 보다 훨씬 더 높은 학위를 측정할 수 수 있습니다.

신경 기능 및 뇌의 위치 사이의 관계를 이해 하기 위해서는 오랜 시간에 대 한 장애에 의존 했습니다. 예를 들어 우리의 이해 학습 및 메모리 불가결 되 고 마 키 충 동 제어에 대 한 것으로 전 두 엽 피 질 인간^1,2serendipitous 변의 두 제품을 했다. 그러나 동물 모델,,를 사용 하 여 세 렌, 저쪽에 하 여 병 변의 힘을 활용 하는 신경 수 있다 그리고 수많은 뇌 영역의 기능을 통해 구조-기능 관계의 체계적인 연구를 통해 해명 되었습니다 했습니다. 병 변^3,4.

그러나 올바르게 구조에 함수를 할당,, 병 변 연구는 부족 했던 지역 이다 정확한 정량화 절차 필요 합니다. 장애를 측정을 위한 현재 골드 표준 섹션, 마운트, 및 가벼운 현미경 이미지 두뇌입니다. 이미지 분할 영역 다음 아틀라스에 가장 가까운 부분에 일치와 과목에 걸쳐 변의 대략적인 좌표는 직접 보고, 종종 카메라 루시 다 이미지 또는 예제 조직학 조각^{3,4 사용 ,5,6,7,8,,910}.

현재 병 변 부 량 절차의 부정확성을 넘어 이러한 기술은 시간과 실패 하는 경향이 있습니다. 뇌 경직, 블레이드 선명도, 및 온도에 작은 변화는 어설픈, 뒤틀린, 또는 찢어진 섹션으로 이어질 수 있습니다. 섹션 수 있습니다 또한 얼룩 하지 균등 하 게 하 고 설치 매체에 거품 때문에 몇 군데 잘못 될. 중요 한 것은, 단면, 시 뇌의 병 변의 위치의 3 차원 컨텍스트 손실, 두뇌 도전 병 변의 정확한 3D 개조를 만들기 됩니다.

병 변에 대 한 또 다른 일반적인 응용 단일 및 다중 전극 녹음 뇌에서의 위치 결정 되었습니다. 마지막 녹음 세션의 끝에, 연구팀은 전극 끝에 작은 전해질 병 변 유발 하 고 두뇌 조직학 기존 병 변 실험¹¹에서 처리. 조직학 찾을 수 도전 되는 전해질 병 변 일반적으로 그들을 확인 하는 데 사용 하는 전극 보다 큰 하지만 충분히 작은 일반적으로 추가 문제, 위에서 설명한 동일한 단점에서 겪고 있다이 기술. Tetrode 배열의 경우 여러 전극 삽입 되 면 전해 병 변 통해 확인은 훨씬 더 도전. 대신 전해 병 변은 나중에¹², 조직학 확인 전극에 염료를 사용 하 여 하지만이 기술은 전통적인 조직학와 함께 제공 되는 동일한 단점이 있습니다 겪고 있다.

여기, 우리는 깊이 있는 설명 얼룩 전자 현미경 (EM) 및 x-선 기법에 따라 최근 설명된 방법¹³ 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 병 변 단정 하 고 전류 보다 작은 동물 두뇌에서 전극을 찾습니다 방법입니다. 마이크로-CT는 엑스레이 선과 하지 샘플에서 반사 하는 엑스레이 수집 하는 동안 360 ° 회전 하는 샘플에서 촬영 하는 이미징 기법입니다. 결과 어떤 방향으로 시각화 하 고 정확 하 게 측정할 수 있는 샘플의 고해상도 디지털 3D 재구성. 많은 교육 기관 있다 마이크로 CT 스캐너, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

모든 관심과 동물의 실험적인 조작 검토 하 고 하버드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 관류 쥐에 대 한 특정 하지만 작거나 비슷한 크기 두뇌를 가진 어떤 동물 든 지에 적용 되는 절차.

1입니다. 관류

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 쥐에 대 한 (나이: 0.5-1.5 세, 무게: 250-600 g), 800-1000 mL 충분 해야 한다. 400 mL를 사용 하 여 동물과 정착 액을 희석 하는 추가적인 400 mL perfuse.
2. 정착 액 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 및 1 x PBS에 2.5% (w/v)도 (GA)으로 구성 된 준비. 쥐, 400 mL 충분 하다입니다. 재 관류 후 뇌의 후 고정을 위한 50 mL 원뿔 튜브에 50ml를 저장 합니다.
3. 4-5 %isoflurane 가스 (0.8 L/min O₂ 21 ° C에서 1.0 바에서)에서 15 분 동안 쥐 anesthetize
4. Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital의 치명적인 복용량을 주사 (180 mg/kg).
5. 발가락-핀치 반사 시험을 실시 하 여 동물에 반사 손실에 대 한 테스트. 동물의 반사 응답 잃은 때까지 관류를 시작을 기다립니다.
6. 앞에서 설명한 intracardial 관류와 뇌 추출 프로토콜¹⁴ 다음 솔루션에 따라: 1 x 125 mm Hg 피 제거 하에서 PBS의 400 mL와 함께 동물을 perfuse. 일단 모든 혈액 제거 되었으며 1 x PBS로 대체, PFA와 2.5%가 125 mm Hg에 1 x PBS에 용 해 2%의 솔루션의 400 mL와 함께 perfusing 시작 합니다.
   참고: 경우에 절차는 쥐를 동물에 실시 되 고, 관류 절차만 중요 한 구성 요소는 PBS와 2% x 1 사용 하 여 PFA, 1 x PBS에 2.5%가. 솔루션 볼륨 및 관류 압력은 종에 따라 조정할 수 있다.

2입니다. 포스트 고정

1. 2%에서 추출한 뇌를 배치 PFA, 2.5%가 PBS 솔루션 (이전 동물을 perfuse 하는 데 사용 하는 동일한 솔루션) x 1에서. 솔루션 볼륨 적어도 10 배는 두뇌의 볼륨 인지 확인 합니다. 쥐를 위해 솔루션 50 mL 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓습니다. 2-3 일, 4 ° c.에 가볍게 흔들어 후 고정 샘플 저장
   주: 샘플 50 mL 원뿔 튜브에 경우에, 궤도 통에 가로로 배치 됩니다 확인 최상의 결과.
2. 샘플 후 수정 되었습니다 오랫동안 충분히, 후 씻어 두 번 증 류 물 (ddH₂O), 드 이온된 수 (diH₂O), 또는 초순 샘플 4 다음 기간에 대 한 시간 ( 재료의 표참조): 1, 1, 1, 및 15 분.
   참고:이 프로토콜 ddH₂O, diH₂O, 또는 초순 이어야 한다 상호 교환. 편의상, ddH₂O 이제부터 물 정화를 참조 하 사용 됩니다.

3. 얼룩

주의:이 단계에 대 한 장갑을 사용 하는 동안 모든 솔루션 준비는 후드 아래를 수행 합니다.

1. 적어도 10 배 솔루션 얼룩의 두뇌 볼륨을 준비 합니다. 쥐 두뇌, 2% (w/v) 오스뮴 tetroxide (OsO₄) 50 mL에에서 준비 ddH₂O 주식 4% OsO₄ 솔루션의 25 mL 및 ddH₂오의 25 mL
   주의: 오스뮴 tetroxide 휘발성 및 임시 실명 및 호흡기 문제를 일으킬 수 있습니다 하지 않을 경우 적절 하 게 처리. 보조 컨테이너 내에서 적절 한 화학 위험 컨테이너에서 오스뮴 tetroxide를 문의 하는 모든 자료를 삭제 합니다.
2. 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓고 OsO₄ 솔루션을 추가 합니다. 두뇌는 OsO₄ 조직에서 지질과 반응으로 갈색을 시작 한다.
3. 튜브를 닫고 파라핀과 그것을 철저 하 게 봉인 외피 동안 누설 하지 않습니다 있도록 ( 재료의 표참조) 영화.
   참고:는 오스뮴 휘발성 이며 반응할지 가벼운 튜브, 플라스틱 튜브를 제대로 밀봉 하는 것은 무척 중요 하다. 튜브 추가 보호를 위해 알루미늄 호 일 포장 될 수 있습니다.
4. 2 주 동안 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 가볍게 흔들어 4 ° C에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다. 가로로 최고의 혼합 되도록 튜브를 놓습니다. 샘플 흔들어 동안 솔루션에 완전히 빠져들은 확인 합니다.
   참고: 지속적으로 순환 하는 오스뮴은 허용 되지 않습니다, 만약 그것 수 있습니다 완전히 침투 하지 샘플, 그래서 뿌리에 수평 배치는 매우 중요 하다.

4. 포함

1. 샘플은 2 주 동안 OsO₄ incubated 되어, 후에 그것을 세척 ddH₂O 5 시간 실 온 (RT)에서 다음 기간에 대 한: 1, 1, 1, 15, 및 모든 언바운드 OsO₄ 샘플에서 제거 60 분.
   참고: 지난 60 분 교환를 포함 하 여 여러 교류는 밖으로 확산에 순환 시스템에서 모든 오스뮴을 허용 하는 데 필요한.
2. 4 ° c.에서 ddH₂O 30 분 샘플을 씻어
   참고: 오스뮴 샘플, 밖으로 확산 계속 수 있습니다 하지만 그 수량을 크게 이전 단계에서 감소 한다.
3. 결국 수 지로 침투 하는 에탄올과 샘플을 탈수. 탈수, 바꿉니다 ddH₂O (30 분 각 4 ° C에서)에 대 한 다음 에탄올 희석의 10-20 mL: 20% (v/v) 에탄올과 80% (v/v) ddH₂O; 50% (v/v) 에탄올과 50% (v/v) ddH₂O; 70% (v/v) 에탄올 및 30% (v/v) ddH₂O; 90% (v/v) 에탄올과 10% (v/v) ddH₂O; 100%의 에탄올
4. 다음과 같이 아세톤 또는 수 지 희석을 준비 합니다.
   1. ( 재료의 표참조)을 포함 하기 위한 제조업체의 지침에 따라 수 지의 100 mL를 준비 합니다.
   2. 33% (v/v) 수 지-67% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 50 mL 원뿔 튜브에 수 지의 15 mL를 붓고 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 30 mL를 추가 합니다.
   3. 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤, 수 지의 22.5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 부 어와 100% 유리 증 류 아세톤의 22.5 mL을 추가.
   4. 67% (v/v) 수 지-33% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 수 지의 30 mL 50 mL 원뿔 관에 부 어 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 15 mL를 추가 합니다.
   5. 수 지의 잔여 32.5 mL를 사용 하 여 100% 수 지 아래의 첫 번째 솔루션으로.
5. 수 지 침투 과정 다음 아세톤 및 아세톤 또는 수 지 희석의 10-20 mL를 통해 샘플을 이동 하 여 시작: 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 그리고 실 온 (RT)에서 30 분 동안 100% 아세톤.
   참고: 침투 과정의 나머지 부분에서 열린다 실시간
6. 33% (v/v) 수 지 67% 아세톤 3 h RT에 RT, RT에서 3 h 67% (v/v) 수 지 33% 아세톤 및 실시간에 12 h에 대 한 100% 수 지에서 3 h에 대 한 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤에 샘플을 담가
7. 병에는 지침에 따라 수 지의 신선한 50 mL 배치를 확인 합니다. 그것은 치료 하실 것입니다 컨테이너에 샘플을 전송 (예., 일회용 금형 재료의 테이블에서에서 설명). 실시간에서 4 시간 동안 신선한 100% 수 지와 함께 샘플을 고취
   참고: 신선한 수 지를 사용 하지 않으면 전날 만든 수 지 성급 하 게, 강화에 시작 되 고 샘플 조작 하기 어려울 것입니다.
8. 45 ° c.에 15 분 동안 진공 오븐에서 샘플을 드
   참고:이 단계는 샘플 내에서 어떤 덫을 놓은 공기 거품을 제거 도움이 될 것입니다 하지만 그것은 중요 하지 않은 데이터의 품질에는 영향을 미치지 것입니다.
9. 마지막으로, 60 ° c.에서 48 h에 대 한 오븐에 샘플을 치료

5입니다. 마이크로-CT

1. 일단 샘플을 치료 껍질 일회용 형을 하 고 마이크로-CT 기계와 스캔.
   참고: 사용 되는 기계에 따라 설정이 달라 집니다. 재료의 테이블에에서 나열 된 저자에 의해 사용 되는 스캐너에 대 한 권장 설정이 130 kV, 0.1 m m 구리 필터 및 몰 리브 덴 소스, 1 초 노출, 프로젝션 4 프레임의 평균 135 µ A. 그러나, 경험 한다 보정 스캐너 개별적으로, 많은 요인 특정 세션 동안 최적의 설정에 영향을 미칠 것입니다.
2. 검사가 완료 되 면, 스캐너 소프트웨어와 함께 컴퓨터에 실험의 스캐너/소프트웨어 조합에 대 한 권장 매개 변수 샘플을 재구성 합니다.
3. 마지막으로, 시각화 하 고 분석 하는 선택의 실험의 소프트웨어를 사용 하 여 복원된 디지털 볼륨 (예제 테이블의 자료 를 참조).

전통적으로, 두뇌는 구분 병 변 계량 하 고 전극, 찾을 스테인드 하지만이 방법은 오류 발생, 노동 집약, 일반적으로 결과의 추정을 필요 합니다. 마이크로-CT 영상에 대 한 전체 두뇌를 준비 하 여 샘플을 손상의 가능성이 크게 감소, 관심의 기능, 전체 뇌의 맥락에서 분석 될 수 있습니다 및 방법을 빌려준다 많은 샘플의 병렬 처리를 상당히 샘플 준비를 과속.

메서드는 4 개의 주요 단계를 포함 한다: (1) 얼룩 오스뮴 tetroxide와 perfused 뇌, (2) 수 지에 두뇌를 포함, (3) 마이크로 CT 스캐너로 두뇌 이미징 및 (4) 분석 결과 디지털 볼륨 (그림 1). 이 문서에서는 1-3 단계는,으로 설명 4 (분석) 단계는 프로젝트의 특정 요구에 따라 상당히 달라 집니다.

반면 전통적인 단면화는 하나의 단면 방향을 미리 선택 되어야 한다에이 방법에서 결과 디지털 볼륨 3 차원에서 조작 그리고 거의 모든 방향에서 슬라이스 (그림 2a-2b). 사용자 또한 신경 섬유와 개별 glomeruli 있는 표시그림 2(c) 쥐 뇌의 후 각 전구 등 필요한 경우 더 높은 해상도에서 샘플의 일부를 스캔 수 있습니다. 메서드 또한 작은 동물 두뇌에 광범위 하 게 적용 됩니다. 이 확인 하려면 얼룩말 피리 새 류 뇌 쥐 두뇌에 대 한 사용 및 성공적인 디지털 볼륨 (그림 2e) 결과 동일한 프로토콜을 사용 하 여 준비 되었다. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 마이크로-CT에 대 한 준비는 샘플의 조직 했다 마이크로-CT의 해상도 (그림 2d)을 초과 해 서 해상도에 크기 순서까지 손상 되지 확인. 그러나,이 기술은 전자 현미경 (EM)를 위해 부적 한 만드는 상당한 ultrastructural 손상 했다 주목 해야한다.

기술은 표면 병 변 (그림 3)를 찾는 데 사용할 수 있습니다 및 뇌 (그림 4) 내 깊은 병 변. 기술은 또한 제자리에단일 tetrodes, 전해질 장애, 충분 한 직경의 전극 트랙 찾기 허용, tetrode 배열 원래의 및 실리콘 프로브 제자리에 (그림 5).

실패 한 준비 잘못 된 버퍼를 사용 하는 경우에 발생할 수 있습니다 조직의 불완전 한 강화 작용 구성 된다 (그림 6). 그러나, 표면 특징은 필요한 경우에 예를 들어 다음 샘플의 표면에만 얼룩이 있을 수 있습니다는 실험에 대 한 충분 한.

그림 1 : 방법 개요. 준비 하 고 마이크로-CT 이미지를 사용 하 여 전체 뇌를 분석 하는 데 필요한 단계의 개요입니다. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 마이크로 CT 화상 진 찰을 통해 병 변 특성의 기능. (한) Manipulatable 3D 볼륨 및 (b) 가상 조각 (13.9 μ m 복) 긴 에반스 쥐의 마이크로-CT 스캔에서 임의 방향에서. (c) 후 각 전구 높은 해상도 (4.9 µ m 복) glomeruli (흰색 화살표) 및 개별 신경 섬유 (파란색 화살표) 공개 스캔. (d) 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미지 (10 nm/픽셀) 마이크로 CT 영상에 대 한 준비는 쥐 뇌의 시각 피 질. (e) 얼룩말 피리 새 류 (Taeniopygia guttata) 뇌 이미징; 마이크로-CT에 대 한 준비 3D 볼륨 및 2D 조각 (5.6 µ m 복) 화관, 수평, 화살 비행기. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 시각 피 질 병 변 특성 마이크로-중부를 사용 하 여 쥐 뇌 시각 피 질 quinolinic 산에서 lesioned의 (한) 3D 시각화. 왼쪽된 패널은 뇌 (뇌 병 변에 시각적 액세스할 수 있도록 약간 투명해)의 맥락에서 병 변의 볼륨을 보여줍니다. 오른쪽 패널 고립된 병 변 볼륨을 보여줍니다. (b) 화관, 수평, 화살 비행기 (12.8 µ m 복)에 병 변 2D 조각 상위 3 패널 돌아가려면된 섹션을 표시 하 고 하단 3 패널 표시 중첩된 병 변 주석 섹션. 이 병 변은 수동으로 주석이 추가 된 코로나 방향에서 마다 2 조각. 볼륨 다음 보간을 통해 만들었습니다. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: dorso 측면이 병 변 특성 마이크로-CT 및 조직학을 사용 하 여 비교. 왼쪽 "뇌 1" 하반기 마이크로-CT (13.5 µ m 복) 이미징에 대 한 처리 (는) 화살, 수평 및 코로나 보기. 상위 3 패널 돌아가려면된 섹션을 표시 하 고 하단 3 패널 같은 섹션에 주석된 병 변 표시. 병 변은 수동으로 화살 비행기에 모든 2 섹션을 세그먼트와 연속적으로 보간됩니다. (b) "두뇌 1"의 절반 처리 조직학 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 권리의 가장 가까운 일치 코로나 섹션. 패널 (c, d) (a, b) 유사 하지만 "두뇌 2"에 해당 됩니다. 2 뇌 병 변은 수동으로 세그먼트 코로나 비행기에 모든 8 섹션. (e) 1 (어두운 회색) 및 2 (밝은 회색) 두뇌의 오른쪽 반쪽 조직학 치료 병 변 특성. 패널 아래 (b, d, e) 숫자 bregma에 상대적인 위치에 해당합니다. (f) 왼쪽 뇌 1의 마이크로-코네티컷에 대 한 처리의 병 변 특성 첫 번째 패널 격리 된 병 변을 보여줍니다. 두 번째 및 세 번째 패널 두 관점에서 뇌의 병 변을 보여줍니다. (g) (f)와 동일 하지만 해당 뇌 2. (h) 병 변의 오버레이에 (f, g) 볼륨 디지털 뇌 병 변 특성의 비교에 대 한 능력을 보여주는. (F)에 병 변 (g), 병 변에 등록 하 고 모두 뇌 2의 왼쪽된 절반의 맥락에서 표시 됩니다. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 마이크로-CT 영상 통해 전극 지역화. (a) 단일 tetrode 왼쪽 제자리에 (14.0 µ m 복). 상단 왼쪽된 패널: 크롬 tetrode; 쥐의 신체 callosum에 시각 피 질을 통해 여행의 위치를 보여주는 가상 코로나 섹션의 최대 강도 투영 오른쪽 상단: (a) (흰색 사각형)의 맨 위 왼쪽된 패널에 표시 된 이미지의 근접. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 이식된 전극의 가로 보기 (흰색 화살표는 tetrode의 위치를 나타냅니다). (b) 전해 병 변 및 전극 (13.9 μ m 복) 쥐 뇌의 앞쪽 지역에 추적합니다. 상단 왼쪽: 전해 병 변으로 뇌의 3D 렌더링 (보라색 병 변을 나타내는 흰색 화살표) 밖으로 세그먼트; 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 75 µ m 직경 텅스텐 전극과 전해질 병 변 (흰색 화살표)를 나타내는 수평 섹션 생산. 또한, 철회 시 전극에서 일부 금속 화살 보기 (흰색 화살표)에서 트랙을 따라 표시 됩니다. (c) 16-tetrode 이식 쥐 뇌의 앞쪽 피 질에 제자리에서 왼쪽. 상단 왼쪽: 왼쪽 이식; 16-tetrode 배열 전체 뇌의 3 차원 렌더링 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 16 tetrode 이식 (8.9 µ m 복)를 나타내는 수평 섹션. (d) 실리콘 프로브 (10mm 생크, 32 사이트) 왼쪽 제자리에 후부 피 질, 해 마, 그리고 subcortical 구조 (13.9 μ m 복)을 통해 여행. 상단 왼쪽: 세그먼트 실리콘 프로브 (흰색 화살표 나타내는 녹색 프로브); 전체 뇌의 3 차원 렌더링 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 수평 보기는 실리콘의 뇌에 조사. 또한, 실리콘 프로브에 참조 사이트 코로나와 화살 섹션 (흰색 화살표의 끝)에 표시 됩니다. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 : 침투 오스뮴 오스뮴 tetroxide 용 매 효과. (a) 왼쪽된 패널: 쥐 뇌 ddH₂O에서에서 오스뮴 tetroxide에 1 주 동안 incubated. 오른쪽 패널: 쥐 뇌 오스뮴 tetroxide ddH₂O에서에서 2 주 동안 incubated. (b) 2 쥐 두뇌 오스뮴 tetroxide 나트륨 cacodylate 버퍼에서에 6 주 동안 incubated. 그림¹³작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

다음은 프로토콜에 중요 한 단계: 첫째, PFA와 조지아 동물 perfuse 이후 두뇌를 수정 후의 조합의 사용 했다 조직의 일관 된 전체 오스뮴 침투를 달성 하는 최고. 우리가 테스트 하지 않 았 명시적으로, 비록 그럴듯한 설명이입니다 PFA 고정 가역¹⁵, 반면 조지아 고정은 가역^16,17. 오스뮴 tetroxide에서 2 주간 배양 조직의 전체 침투에 대 한 필요 하기 때문에, 뇌의 내부에 PFA 밖으로 확산 하 고 조직의 얼룩이 지기는 하는 동안 저하 가능 하다. 오스뮴 따라서 내부 구조를 유지할 수 없습니다.

버퍼에 녹아 있는 수성 오스뮴 오스뮴 반대를 사용 하 여 (즉, 나트륨 cacodylate)는 오스뮴에 의해 전체 조직 침투를 위해 절대적으로 필요 했다. 6 주 부 화 후에 나트륨 cacodylate에 녹아 오스뮴 완전히 조직에 침투 하지 않았다 그리고 발생 확산 배리어 (그림 6). 오스뮴 지질에 매우 민감 이며 세포 막^18,,1920에 바인딩할 생각. 조직 충분히 permeabilized 하지 경우로 나트륨 cacodylate 같은 부드러운 버퍼의 경우 수도, 세포 막 수 오스뮴 포화 하 고 더 많은 오스뮴 조직으로 확산을 방지 sterically 가능 하다. 그러나 우리가 가설,, 물은 오스뮴에 대 한 용 매로 역할을 가벼운 세제를 충분히 조직에 깊은 확산 수 있도록 조직 permeabilizes.

경험 하는 마우스와 같은 더 작은 두뇌를 준비 하는 오스뮴에 부 화 시간 줄일 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 부 화 시간 더 큰 견본에 증가 될 필요가 있다. 이 크기에 다른 쥐의 두뇌에서 일관 된 얼룩에 대 한 최소 시간 확인을 테스트할 수 있습니다. PFA와 오스뮴 (위에서 설명한) 대로, 그리고 오스뮴 중 부족 한 동요에 대 한 용 매로 물을 사용 하지 않는 관류와 후 고정 하는 동안 조지아 가능성이 문제 경험 전체 오스뮴 침투와 문제가 발생 하는 경우 사용 하지 않는 부 화입니다. 우리, 예를 들어, 그 때 발견 50 mL 원뿔 튜브에 잠복기 (으로 세로로 소유자에) 튜브 그들의 측면에 누워, 얼룩와 그들을 작성 하는 것과 전체 보육 기간 적절 한 보장에 대 한 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 배치 침투입니다.

이 메서드는 여러 가지 방법으로 제한 됩니다. 첫째, 준비 유지 하지 않습니다 열 대권 외의 아주 잘, 그래서 전자 현미경 검사 법에 대 한 사용 하지 않아야. 이 메서드는 추가 조직학 나 면역 형광 검사와 결합할 수 없습니다. 디지털 볼륨의 해상도 샘플의 크기에 의해 결정 됩니다 (작은 샘플 높은 해상도에서 스캔 될 수 있습니다) 및 스캐너, 기하학적 배율;에 의존 하는 경우의 형상에 의해 그러나, 샘플의 하위 원하는 경우 더 높은 해상도에서 검색할 수 있습니다.

마이크로-CT 영상 측정 병 변에 대 한과 작은 동물 두뇌에 전극을 지역화 스타일 전자 현미경 조직 치료를 결합 하는 새로운 방법을 제시 하고있다. 이 메서드는 틀림 없이 덜 힘 드는, 적은 전문 지식이 필요로 고 단면화 및 두뇌를 얼룩이 지기에 대 한 현재 금 표준 보다는 더 쉽게 같지는 결과 생성 합니다. 이전에 과학자 들은 열 대권 외의 전자 현미경 검사 법^21,22를 보존 하기 위한 것입니다 마우스 두뇌에 심지어 오스뮴 침투에 대 한 프로토콜을 설명 했습니다. 그러나,이 프로토콜은 매우 복잡 하다. 이 연구에서 저자 마이크로 CT 영상 전자 현미경 검사 법 보다는 훨씬 간단한 방법 개발 목적. 다양 한 목적에 대 한 두뇌 이미징에 마이크로-CT를 적용 하는 다른 연구 되었습니다. 토끼와 쥐에 이전 조사 마이크로-CT를 사용 찾을 종양과 다른 이상²³. 이 조사 했다 독점 MRI 조 영제, 연구원은의 사용 병 변 연구에서 마이크로-CT의 잠재적인 유용성을 예측 했 어. 쥐에 있는 또 다른 연구 약 스크린에 대 한 심한 형태학 차이 마우스 두뇌는 두개골에서 요오드의 얼룩 참여 하지만 저자 고르지 조직 수축에 직면 하 고 히드로²⁴에 조직을 포함 하기로 찾는 목적. 대뇌 동굴 같은 기형, 비정상적으로 크고 불규칙 한 모세 혈관의 장애를 찾아서 만든 쥐에 다른 연구 목적 있다 오스뮴 tetroxide 및 수성 요오드 얼룩;로 사용 그러나, 이들은 훨씬 작은 샘플 (분리 된 마우스 hindbrains) 보다 여기^25,,2627에서 수행 했다. 3 차원 뇌 볼륨을 생성 하기 위한 다른 방법 µMRI²⁸ 있으며 고해상도 episcopic 현미경 검사 법³¹. µMRI의 해상도 가난한 (25 µ m 복 비슷한 샘플²⁸), 그리고 기술은 더 비싼^23,30. 고해상도 episcopic 현미경 검사 법에는도 전에 직면해: 그것은 파괴적인 기술, 그리고 전체 뇌 단면 수 있도록 블록 얼굴 기구 생산 될 필요가 있을 것입니다. 여기에 제시 된 작품은 또한 두 전극 캡처하고 주변 조직 하 여 엑스레이^32,,3334 와 뇌에 전극을 찾으려고 노력 이전 확장 합니다. 또한, 기술은 단일 전극, tetrode 배열, 전해 병 변, 전극, 트랙과 실리콘 프로브를 찾는 수 있습니다.

가치 있는 미래 방향을 창조 된 병 변 연구 등록 될 수 있었다 공동 병 변의 위치와 크기 정량화를 표준화 하는 "평균 뇌" 아틀라스의 것 이다. 이 방법은 또한 다른 모델과 얼룩말 피리 새 류 뇌 (그림 2)에 즉시 응용 프로그램에 의해 exemplified로 비 모델 생물을 확대 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

저자 감사 합니다 그렉 린과 아서 McClelland 자신의 전문성에 대 한 마이크로-CT 기계와 데이비드 리치몬드 및 이미지에서 헌터 엘리엇과 데이터 분석 코어 (IDAC) 처리 조언, 그들의 이미지에 대 한 하버드의과 대학에 보스턴에서 윌리엄 Liberti 기꺼이 얼룩말 피리 새 류 두뇌를 제공 하는 대학. 이 작업 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 이 작품은 리처드와 수잔 스미스 가족 재단과 IARPA (계약 #D16PC00002)에 의해 지원 되었다. S.B.E.W. 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP;에서 장학금에 의해 지원 되었다 LT000514/2014)와 유럽 분자 생물학 기구 (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. 여는 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 친교 프로그램 (GRFP)을 지원 했다.