Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite¹라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins^2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)⁴증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina⁵사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육⁶휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육⁷새로운 근육 세포로 분화.

줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환⁸의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs^9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법¹¹에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육¹²는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.

이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.

1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부

1. NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO₂ 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
2. 위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.
3. 두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.
4. 여전히는 집게로 잡고가 위로 발목 힘 줄을 잘라. 집게와 발목 쪽에서 TA/EDL을 해제 하는 동안 근육은 TA/EDL 발목에서 무릎에의 경도 선 따라가 위로 잘라. 전체 TA/EDL 경골에서 분리를 무릎 쪽 힘 줄을 잘라.

2. Cryo-포함 TA/EDL 근육의

1. 컨테이너, 예를 들어액체 질소 목욕 준비., 액체 질소 Dewar 플라스 크. 작은 플라스틱 비 커에 (약 20 mL) 반 전체에 methylbutane를 붓는 다. 그럼 그것을 동결에 액체 질소 목욕에서 비 커를 넣어. 몇 분 후에 methylbutane 동결 되었음을 확인 합니다.
   참고: 액체 질소는 드라이 아이스의 양동이 의해 대체 될 수 있지만 동결 시간 느립니다.
2. 해 부 TA/EDL 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓으십시오. 완전히 조교/EDL 몇 방울의 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물 (냉동 매체)로 커버.
3. 액체 질소 목욕 중 methylbutane 비 커 고 따뜻한 개체와 표면 해빙 (예.가 위 손잡이). 신속 하 게 딥은 O.C.T. 스냅-동결 조직에 녹 인된 methylbutane로 플런저에 TA/EDL을 커버.
4. 집게와 플런저에서 포함 된 조직을 분리 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 더 많은 샘플을 처리 하는 동안 그것을 저장 하는 장소 액체 질소에 튜브.
   참고: 포함 된 조직 저장할 수 있습니다 장기 (2 년) 또는-20 ° C-80 ° C에서 짧은 기간 (6 개월)에 대 한.

3. cryostat 단면

1. O.C.T.는 cryostat의 견본 홀더의 중심에 복합의 한 방울을 추가 합니다. O.C.T. 화합물은 거의 확정 될 때까지 기다립니다. 신속 하 게 발목 쪽으로 수직 O.C.T. 화합물에 포함 된 TA/EDL 스틱 다운 및 무릎 쪽까지.
2. 탑재 한 cryostat에 견본 홀더, 조직 10 µ m 간격 자르고에 대 한 프 로스트 코팅 슬라이드와 cryo-섹션을 수집 한 슬라이드에 4-8 절.
3. 적어도 3 h 하룻밤 실 온에서 섹션을 건조.
   참고: 비록 하룻밤 이상 냉장고에 섹션을 건조 하는 것은 허용, 그것은 필연적으로 증가 합니다 하지는 autofluorescence. 최상의 결과 얻으려면 건조 0.5 h에 대 한 섹션 진행 됩니다 고정과 얼룩 단계 즉시.
4. 슬라이드 상자에서 슬라이드를 수집, 즉시 그들을 사용 하 여 또는-80 ° C 또는-20 ° C 나중에 사용할 슬라이드를 저장.

4입니다. 면역 형광 염색 법에 대 한 시 약의 준비

1. 버퍼를 준비:
   1. 10 x PBS에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 2 리터를 준비 합니다.
   2. 1 x PBS 16%에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 40 mL 준비 PFA.
   3. PBST의 2 리터를 준비: 0.1% 트리톤-100 1 x PBS.
   4. 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBST-b: PBST의 50 mL를 준비 합니다.
   5. 2%와 5 %BSA 정상 염소 혈 청으로 PBST-B-g: PBST의 10 mL를 준비 합니다.
   6. 1 mL 차단 솔루션의 준비. 희석 AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) (1:10) PBST-b
   7. 1 x 시트르산 버퍼의 200ml를 준비 합니다.
      참고: 위의 솔루션의 볼륨은 적어도 5 슬라이드에 대 한 충분 한. 볼륨은 슬라이드의 수와 슬라이드 컨테이너의 크기에 따라 조정 되어야 한다.
2. 항 체 얼룩을 준비:
   1. 1 차 항 체 (작업 농도): Pax7 마우스 단일 클론 항 체 (IgG1) 희석 하 여 1 차적인 항 체 혼합의 1.2 mL를 준비 (1-5 µ g/mL) + Laminin polyclonal 토끼 항 체 (0.5-2 µ g/mL) + MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2_b) (0.5-2.5 µ g / mL) PBST-B-g
      참고: MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2_b) 선택 사항입니다.
   2. 2 차 항 체 (작업 농도): 염소 반대로 마우스 IgG1 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 488 diluting 하 여 1.2 mL 이차 항 체 혼합의 준비 (0.5-2 µ g/mL) + 염소-토끼 IgG (H + L) 높은 간-흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 플러스 555 (0.5-2 µ g/mL) + 염소 반대로 마우스 IgG2_b 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 647 (0.5-2 µ g/mL) PBST-B-g
      참고: 알 렉 사 Fluor 647 선택 사항입니다.

5. 면역 형광 염색 법 단계

1. Rehydrate 하 고 PFA와 cryo-섹션을 수정.
   1. 슬라이드 상자에서 TA/EDL cryo-섹션 슬라이드의 몇 가지를 제거 합니다. 따뜻한 실 온에서 슬라이드 잡고 트레이에 슬라이드.
   2. 액체 차단 펜 (PAP 펜)를 사용 하 여 모든 곳을 알아내는-섹션 슬라이드에 포함 된 영역을 그립니다. 이 원형 슬라이드 밖 흐르는 솔루션을 막을 것 이다.
   3. 실험실 연기 후드에는 트레이 가져가 라. 300-500 µ L 4%의 추가 10 분 1 x PBS와 PFA에 밖으로 세척에 대 한 실 온에서 섹션을 해결 하기 위해 원된 영역 내에서 슬라이드에 PFA 슬라이드 컨테이너에서 적어도 3 x 5 분.
      주의: PFA는 독성과 유해 폐기물; 그것은 관리와 함께 작동 한다 고 유해 폐기물 용기에 폐기.
2. 항 원 복구
   1. 구 연산 염 버퍼의 200 mL와 함께 다른 슬라이드 컨테이너를 작성.
   2. 컨테이너에 슬라이드를 전송 합니다. 압력 밥 솥 요리 10 분에 대 한 높은 압력 모드에서 슬라이드를 슬라이드와 함께 컨테이너를 전송 합니다.
   3. 배수 물 10 분 전송에 대 한 모든 슬라이드 PBST (200 mL)와 새로운 컨테이너와 컨테이너를 쿨, 3 x 5 분 이상에 대 한 PBST와 슬라이드를 씻어.
3. 차단
   1. 슬라이드의 건조를 피하기 위해 습 한 환경을 만들기 위해 슬라이드를 잡고 트레이를 물에 젖은 kimwipes를 추가 합니다.
   2. 트레이, 다시 슬라이드를 이동 하 고 각 슬라이드에 솔루션 차단의 200 µ L를 추가 합니다. 모자와 함께 트레이 커버 하 고 30 분 동안 개발 차단 하자.
      참고: Pax7 항 체는 마우스 단일 클론 항 체 때문에 마우스 IgG 마우스 근육 조직에 높은 백그라운드를 만드는의 불특정 바인딩. AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L)를 사용 하 여 마우스에 마우스 난다 바인딩을 차단 합니다.
4. 1 차 항 체를 적용 합니다.
   1. 슬라이드 슬라이드 컨테이너에서 한 번 PBST와 린스. 그런 다음 다시 얼룩 트레이 슬라이드를 이동 합니다.
   2. 각 슬라이드에 1 차적인 항 체 혼합의 200 µ L을 적용 하 고 모자, 트레이 커버 개발 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서 반응 하 게.
      참고: 4 ° C에서 하룻밤 반응 비록 만족 스러운 결과 제공 실 온에서 반응 개발 최상의 결과 제공 합니다. Myosin MF20 항 체 트리플 (Pax7, Laminin MF20) 라벨 수행 믹스에 추가할 수 있습니다. MF20 얼룩 분화 근육 섬유. 이 단계는 또한 PBST-B-g을 줄이기 위해 다음 단계에서 2 차 항 체 (염소 항 체)에서 잠재적인 난다 바인딩 다른 차단 단계 역할을 합니다.
5. 2 차 항 체를 적용 합니다.
   1. 실 온에서 PBST와 함께 1 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.
   2. 각 슬라이드에 이차 항 체 혼합의 200 µ L을 추가 하 고 허용 하는 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 개발 하는 반응.
      참고: Pax7 + Laminin에 대 한 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG1 알 렉 사 488와 염소 안티 토끼 알 렉 사 555.
      Pax7 + Laminin + MF20, 염소 반대로 마우스 IgG2_b 알 렉 사 647 믹스에 추가.
   3. PBST와 2 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.
6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 카운터 얼룩 및 장착
   1. PBST 슬라이드 컨테이너, 예를 들어, PBST의 200 mL에 DAPI의 10 µ L에에서 DAPI (1:20, 000)를 희석.
   2. 슬라이드 3 분 DAPI 컨테이너에 얼룩.
   3. PBST와 DAPI 적어도 5 x 5 분 동안 세척 한다.
   4. 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. Coverslips와 함께 슬라이드 커버.
      주의: DAPI는 유독 하 고 위험한; 그것은 신중 하 게 처리 해야 한다 고 유해 폐기물 병에서 삭제.

6. 형광 현미경 검사 법

참고: immunofluorescent 얼룩 프로토콜 위에 보고는 넓은 필드 형광 또는 confocal 현미경으로 SCs 시각화를 수 있습니다. 그것은 처음 SCs를 식별 하는 도전 수 있습니다. 도움이 될 수 있는 몇 가지 권장 되는 단계는 여기 있다.

1. DAPI 채널 및 낮은 배율 목표를 사용 하 여 슬라이드에 대 한 섹션을 시각화.
2. 높은 낮은 배율을 전환 합니다. 관찰 하기 위해 SCs, 적어도 20 X 목적은 필요)입니다.
3. 488 (FITC)에 대 한 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 / 555 (Rhodamine) Pax7 Laminin를 모두 관찰 하는 SCs를 식별 하는 동시에 신호. 이 설정에서 Pax7 얼룩의 신호는 배경 잡음을 더 나은 대비.
4. 신속 하 게 제대로 식별 SCs DAPI FITC에서 채널 대체. 모든 SCs Pax7/DAPI 양성 해야 합니다.

위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (그림 1A) 보다 상대적으로 깔끔한 이미지를 (그림 1B)를 캡처합니다. 동일한 프로토콜 또한 청소년 생쥐 (그림 2A), 마우스 배아 (그림 2B)의 근육 조직에서 잘 작동 하 고 부상 성인 근육 조직 (그림 3). 청소년 및 미 발달 근육 조직에는 더 많은 활성화 된 SCs (그림 2A, 화살표) 또는 Pax7 긍정적인 조직적 선구자 (그림 2B, 화살표)을 상대적으로 더 큰 핵; 따라서, 성인 생쥐 ( 그림 1및그림 2 ) 보다 젊은 쥐의 SCs를 시각화 하기 위해 상대적으로 쉽습니다. 다친된 근육 조직에 또한 있다 더 활성화 Pax7 긍정적인 SCs (그림 3).

그림 1: 마우스 성인 근육 조직을 휴식에 Pax7 및 Laminin 면역 형광 이미지. 성인 쥐의 TA/EDL 근육 섹션 Pax7 (녹색)와 항 체 Laminin (빨간색), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. (A) 이미지 넓은 분야 형광 현미경 아래 캡처한. (B) 이미지 공초점 현미경 촬영. 스케일 바: 50 µ m. 화살표: SCs 낮은 autofluorescence와 섬유에서. 화살촉: SCs 높은 autofluorescence 섬유에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 젊은 쥐의 근육 조직에 Pax7 Laminin 또는 MF20 면역 형광 이미지. 젊은 쥐의 TA/EDL 근육 섹션 Pax7 (녹색) 및 Laminin (빨간색) 또는 항 체 MF20 (마젠타), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. (A) 출생 후 하루 8 (P8) 근육 섹션 confocal 현미경 촬영. (B) 배아 일 17.5 (E17.5) 근육 섹션 넓은 분야 형광 현미경 아래 캡처한. 스케일 바 = 50 µ m. 화살표: SCs P8 근육 섹션 (A); 대표 Pax7 + E17.5 근육 섹션 이미지 (B)에 더 많은 반면에 조직적 선구자. 이 두 이미지는 또한에서 생성 된 이미지는 게시 된 종이¹³ (s그림 3D)와 s (그림 1B), 각각 원시 데이터에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 부상된 성인 근육 조직에 Pax7 및 Laminin 면역 형광의 대표 이미지. TA/EDL 근육 부분의 부상된 성인 근육 조직 (7 일) 부상 이후 Pax7 (녹색)와 항 체 Laminin (레드), immunostained 그리고 카운터 DAPI (파란색)으로 물. 이미지는 confocal 현미경 체포 됐다. 눈금 막대 = 50 µ m. 화살표: SCs 섹션에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육¹²얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계산 하 이 크게 시끄러운 autofluorescent 배경에서 밖으로 서 SC 파생 Pax7 신호를 향상. 둘째, 사용 Pax7 항 체는 마우스 항 체 이기 때문에, 우리는 마우스에 마우스 차단 단계 (5.3)을 줄이기 위해 마우스 IgG의 불특정 바인딩에서 발생 배경 추가. 셋째, 항 원 검색 단계 (단계 5.2) 조직을 고정 하는 PFA에 Pax7 항 체와 얼룩에 대 한 중요 했다.

동일한 프로토콜 (강아지와 배아) 젊은 쥐의 근육 조직에 사용 되었다 (그림 2). 사실, 그것은 동일한 프로토콜 보다 성인 쥐 새끼에 SCs를 시각화 하는 상대적으로 쉽게 했다. 그것은 성인 근육 조직으로 진행 하기 전에 경험을 얻기 위해 새끼에 SCs를 얼룩 시작 도움이 될 수도 있습니다. 1 차 항 체 (단계 5.4) 없이 부정적인 제어 모든 실험에 필요한 이기도합니다. 유사한 프로토콜 처리 단계 추가 파라핀으로 파라핀 섹션에 성공적으로 사용 되었다. 그러나, 파라핀 섹션 경향이 있다 신호는 상대적으로 약한 Pax7 식 SCs에서 마스크 더 높은 autofluorescence 배경. 만약에 가능 하다 면, 파라핀 섹션을 사용 하지 마십시오. 동일한 프로토콜 또한 수많은 SCs, 그리고 강아지의 근육 조직 (그림 3)으로 얻은 그 비슷한 결과 준 부상된 근육 조직에 고용 되었다.

근육 조직 autofluorescence 깨끗 한 면역 형광 검사 결과¹⁴를 얻기에 중요 한 장애를 나타냅니다. Autofluorescence 줄일 수 있는 곳을 알아내는-섹션의 건조 시간을 단축 하 고 갓된 cryo-섹션을 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 프로토콜¹⁵와 마찬가지로 마우스에 마우스 차단 단계 추가 백그라운드를 줄이기 위해 필요 합니다.

넓은 분야 형광 현미경, 공초점 현미경 눈 조각을 통해 SCs 시각화에 대 한 효과적인 동안, 높은-품질의 이미지를 캡처 confocal 현미경의 사용은 권장 됩니다.

저자는 공개 없다.

우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.